JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Bacteriofaagverwijdering uit geïnfecteerde Salmonellaculturen

Published: June 28, 2024
doi:
10.3791/66855
, ,
1Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia,Universidad de Sevilla, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología,Universidad de Sevilla

Summary

Bacteriofagen, alomtegenwoordig en divers op aarde, infecteren en vermenigvuldigen zich in bacteriële gastheren en spelen een cruciale rol in microbiële ecosystemen. Ondanks hun belang kan hun aanwezigheid industriële processen verstoren. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van bacteriële lipopolysacchariden om bacteriofagen uit Salmonellaculturen te elimineren.

Abstract

Bacteriofagen, of gewoon fagen, spelen een vitale rol in microbiële omgevingen, beïnvloeden bacteriepopulaties en geven vorm aan hun evolutie en interacties. Deze organismen zijn virussen die infecteren en repliceren in bacteriële gastheren. Fagen zijn alomtegenwoordig op aarde, zeer divers en zeer overvloedig. Hoewel bacteriofagen een waardevolle rol spelen in verschillende omgevingen en een belangrijk onderzoeksgebied zijn in de microbiologie en ecologie, kan hun aanwezigheid ongewenst zijn in bepaalde industriële processen of producten. Gezien de overvloed en alomtegenwoordigheid van bacteriofagen op aarde, is het ontwerp van procedures voor het verwijderen van bacteriofagen uit bacterieculturen van cruciaal belang in diverse laboratorium- en industriële toepassingen om de integriteit van de culturen te behouden en nauwkeurige experimentele resultaten of productkwaliteit te garanderen. Hier hebben we een protocol verfijnd om de bacteriofagen uit geïnfecteerde Salmonella enterica-culturen te elimineren, met behulp van een strategie gebaseerd op het gebruik van lipopolysacchariden (LPS) die zich in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën bevinden. Bacteriële LPS speelt een belangrijke rol bij de herkenning van de gastheer door fagen, en we maken gebruik van deze eigenschap om een effectieve procedure te ontwerpen voor de verwijdering van fagen, die LPS als receptor gebruiken, in Salmonella-bacterieculturen.

Introduction

Microbiële populaties worden geconfronteerd met meerdere uitdagingen in natuurlijke omgevingen, en een bijzonder ernstige bedreiging is het potentieel van infectie door bacteriofagen, de virussen die bacteriën infecteren. Deze virussen zijn wijdverspreid op de planeet en vertonen een grote diversiteit en overvloed 2,3,4,5. Hoewel bacteriofagen divers zijn in grootte, morfologie en genomische organisatie, delen ze allemaal dezelfde structuur: een DNA- of RNA-genoom omhuld door een capside gevormd door faag-gecodeerde eiwitten6. Bacteriën hebben een breed scala aan verdedigingsmechanismen tegen hen ontwikkeld7. Een belangrijk aspect van bacteriofaaginfectie, dat zowel voor karakterisering als voor detectie relevant is, zijn de receptorbindende domeinen die aanwezig zijn op staartvezels. Bacteriofagen hebben eiwitten op hun oppervlak die receptorbindende eiwitten of staartvezels worden genoemd voor het herkennen van en binden aan specifieke receptorplaatsen op het oppervlak van de bacteriële cel. In het geval van Gram-negatieve bacteriën is de herkenning van oppervlaktestructuren, zoals lipopolysacchariden (LPS), buitenmembraaneiwitten, pili en/of flagella, betrokken bij de interactie tussen faag en bacterie8. Deze interactie tussen bacteriofagen en bacteriën is zeer specifiek en hangt vooral af van hun vermogen om zich aan gastheeroppervlakken te hechten. Het O-antigeen van lipopolysaccharide is een veelgebruikte receptor9.

Het onderzoek naar interacties tussen bacteriofaag en bacteriën is niet alleen fascinerend vanuit biologisch oogpunt, maar heeft ook praktische toepassingen op gebieden als faagtherapie en biotechnologie. Hoewel bacteriofagen een waardevolle rol spelen in verschillende contexten, bijvoorbeeld bij het veranderen van microbiële populaties10, kan hun aanwezigheid ongewenst zijn in bepaalde industriële processen. In de farmaceutica, biotechnologie en voedselproductie kan de aanwezigheid van bacteriofagen de kwaliteit en veiligheid van de eindproducten beïnvloeden, waardoor de verwijdering ervan essentieel is om aan de kwaliteitsnormen te voldoen. In bioprocessing en bioproductie, waar bacterieculturen worden gebruikt om verschillende verbindingen te produceren (bijv. eiwitten, enzymen of antibiotica), kan de aanwezigheid van bacteriofagen leiden tot verstoring van productieprocessen vanwege hun vermogen om de bacteriepopulatie in elke gedeelde omgeving in evenwicht te brengen. Fagen kunnen het professionele leven van de industriële microbioloog af en toe in een nachtmerrie veranderen11. Het ontwerp van effectieve procedures om fagen te verwijderen is van cruciaal belang om een consistente en betrouwbare productie te garanderen en de procesefficiëntie te verbeteren. Afgezien van deze industriële aspecten, is in een onderzoekslaboratoriumomgeving, waar precisie en reproduceerbaarheid cruciaal zijn, de eliminatie van bacteriofagen essentieel voor het verkrijgen van nauwkeurige en betrouwbare resultaten. Bovendien kan het verwijderen van fagen ook worden gebruikt om verschillende omgevingen te simuleren om verschillende hypothesen te testen12. Het verwijderen van fagen kan ook zeer nuttig zijn in de onderzoeksomgeving, aangezien veel op fagen gebaseerde studies, zoals de telling van bacteriën na faagtoepassing, baat zouden hebben bij een stap om fagen te verwijderen om veel betrouwbaardere levensvatbare tellingen te produceren.

Het verwijderen van fagen op basis van kolonie-isolatie zou enkele dagen duren om ervoor te zorgen dat kolonies faagvrij zijn, terwijl de hier beschreven procedure het mogelijk maakt om faagvrije culturen binnen enkele uren te genereren. Dit protocol stelt ons in staat om de evolutie van bacterieculturen te volgen zonder ze ervan te weerhouden kolonies te isoleren. In die zin is het mogelijk om fluctuerende omgevingen (aan- en/of afwezigheid van fagen) te simuleren om verschillende hypothesen te testen. Bovendien maakt dit protocol de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de aanwezigheid van fagen in een bacteriecultuur mogelijk.

Samenvattend is het ontwerpen van kosteneffectieve procedures voor de verwijdering van bacteriofagen van cruciaal belang voor het handhaven van productkwaliteit, veiligheid en procesefficiëntie in verschillende industrieën en voor vooruitgang in fundamenteel en toegepast onderzoek. Hier beschrijven we een zeer effectief protocol gebaseerd op het gebruik van LPS voor de verwijdering van bacteriofagen, die LPS als receptor gebruiken, uit geïnfecteerde Salmonella-culturen , wat zowel tijdbesparend is als minimale apparatuur vereist.

Protocol

OPMERKING: Voorafgaand aan het uitvoeren van de procedure voor het elimineren van fagen, beschrijven we de bereiding van een Salmonella-cultuur geïnfecteerd met 9NA-bacteriofagen. In figuur 1 wordt een algemene weergave gegeven van de volledige procedure voor het verwijderen van bacteriofagen in bacterieculturen. 1. Bereiding van Salmonellaculturen geïnfecteerd met bacteriofagen Bereiding van bacteriecultuurOPMERKING: In deze studie werd Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium stam ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011)13 gebruikt.Ontdooi langzaam de injectieflacon die is opgehaald bij -80 °C en die de betreffende S. enterica-stam bevat door deze op ijs te plaatsen. Strijk de S. enterica-stam uit de ontdooide dimethylsulfoxidebouillon uit op een plaat met Lennox-bouillon (LB) (10 g/l trypton, 5 g/l NaCl, 5 g/l gistextract en 15 g/l agar, zie materiaaltabel). Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C. Breng met een inoculatienaald een kolonie over van de S. enterica-plaat en inoculeer deze in 5 ml vloeibare LB in een glazen buis. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur met beluchting door schudden bij 200 tpm. Bacteriofaag preparaatOPMERKING: Bacteriofaag 9NA, die behoort tot de familie Siphoviridae (orde Caudovirales)14, werd in dit protocol gebruikt. Met name andere Salmonella enterica bacteriofagen die het O-antigeen van de lipopolysaccharide als receptor gebruiken, kunnen worden gebruikt.Bereid de bacteriofaagbouillon door 0,1 ml geconcentreerd bacteriofaaglysaat toe te voegen aan een mengsel van 100 ml voedingsbouillon (NB; 5 g/l pepton en 3 g/l gistextract), 2 ml 50x E-zouten (38,78 mM MgSO47 H2O, 520,5 mM CitroenzuurH2O, 2,87 M K2HPO4 watervrij en 829 mM NaNH4HPO44 H2O) en 0,4 ml 50% glucose. Meng grondig door inversie.Een representatief voorbeeld van een bacteriofaagconcentratie zou 109 PFU/ml (plaquevormende eenheden/ml) kunnen zijn, maar lagere concentraties kunnen worden gebruikt met vergelijkbare resultaten (zie Tabel met materialen). Schat de bacteriofaagconcentratie volgens stap 1.2.3. Bereid lysaat voor door de onderstaande stappen te volgen.Bereid het S. enterica inoculum in 5 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l NaCl en 5 g/l gistextract). Incubeer bij 37 °C en 200 tpm gedurende 24 uur. Meng 4 ml bacteriofaagbouillon met 1 ml van de nachtcultuur van S. enterica. Incubeer het mengsel bij 37 °C en 200 rpm gedurende 8 uur. Om onderscheid te maken tussen bacteriën en bacteriofagen, centrifugeert u het mengsel op 2.377 x g gedurende 20 minuten. Recupereer het supernatans in een glazen buis, voeg 800 μL chloroform toe (zie Tabel met materialen) en draai het in een wervel. Zorg ervoor dat u de bovenste fase alleen overbrengt als een mengsel met chloroform wordt gebruikt.OPMERKING: Het is belangrijk om de overdracht van resterende chloroform te voorkomen, wat de efficiëntie van de procedure zou kunnen beïnvloeden. De chloroformstap is gebruikelijk in zowel isolatie- als voortplantingsprotocollen als een manier om de vrijgekomen fagen te maximaliseren. Chloroform kan echter sommige fagen inactiveren of hun besmettelijkheid vernietigen15. Daarom is deze stap alleen van toepassing op fagen die resistent zijn tegen chloroform. Houd de lysaten 2 uur op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens bij 4 °C. Titreer het lysaat om het aantal bacteriofagen/aantal PFU per ml in het bereide lysaat te kwantificeren. Voer hiervoor de hieronder beschreven overlay-techniek uit.Bereid 5 ml LB inoculum voor S. enterica. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur met beluchting door schudden bij 200 tpm. Voer seriële verdunningen van het lysaat uit tot LB om een telbaar aantal PFU/ml te bereiken. Om de noodzakelijke verdunningsfactoren te bepalen, identificeert u het initiële geconcentreerde bacteriofaaglysaat. Voor een representatief voorbeeld van bacteriofaagconcentratie bij ongeveer 109 PFU/ml, liggen de verdunningsfactoren die resulteren in een telbaar aantal plaques tussen 106-10 10. Voeg 100 μl van de juiste lysaatverdunning en 60 μl van de ‘s nachts bereide S. enterica-cultuur de dag ervoor toe aan 5 ml LB-zachte agar, bereid door vloeibare LB en LB-agar te mengen in een verhouding van 1:1 en op 56 °C te houden om stolling te voorkomen. Meng voorzichtig en vermijd luchtbellen. Giet elk mengsel in de bovenkant van een LB-plaat en blijf op de bank staan tot het medium stolt. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 °C. Tel het aantal plaques op elk bord. Om het aantal PFU/ml te bepalen, vermenigvuldigt u het aantal plaques van elke plaat met de verdunningsfactor (FD). Om een efficiënte faaginfectie te garanderen, zijn 10 9-1012 PFU/ml nodig.PFU/ml = Nee. plaquettes in de plaat x FD Infectie van Salmonellaculturen met bacteriofagenVerdun een nachtelijke cultuur van S. enterica tot 1:100 in een eindvolume van 5 ml LB en voeg 0,1 ml lysaat toe (geconcentreerd op 10 9-1012 PFU/ml). Incubeer bij 37 °C en 200 tpm gedurende 24 uur. Bepaling van faagtiter als PFU in plaattestOm het aantal bacteriofagen in de geïnfecteerde cultuur te kwantificeren, voert u plaatassays uit om de faagtiter als PFU/ml te bepalen, zoals hieronder beschreven.Breng 1 ml van de cultuur over in een buisje. Centrifugeer op 17.115 x g gedurende 2 minuten en giet het supernatans in een nieuwe geëtiketteerde injectieflacon. Voeg 100 μL chloroform toe aan de injectieflacon en vortex om bacterieel afval uit de oplossing te verwijderen. Volg stap 1.2.3. 2. Verwijdering van bacteriofagen uit geïnfecteerde Salmonella enterica-culturen (zie figuur 2) OPMERKING: Om het verwijderingsproces van de bacteriofaag te controleren, worden tijdens het reinigingsprotocol verschillende aliquots genomen voor titratie. In totaal zijn er acht aliquots om te bevestigen dat het aantal PFU’s/ml afneemt gedurende het reinigingsproces totdat het volledig is geëlimineerd. Verwijdering van bacteriofaag in suspensieVerdun de bacteriecultuur met fagen tot 1:100 in 5 ml 0,22 μm gefilterde LB in een conische centrifugebuis van 50 ml. Titratiepunt 1: Dit is de eerste aliquot voor titratie (de beginnende geïnfecteerde Salmonellacultuur ). Centrifugeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 2,377 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant. Gebruik geen pipet; Giet de buis. Probeer wat volume aan de onderkant van de conische centrifugebuis te laten om de aanwezigheid van cellen te garanderen. Was bacteriële cellen met 10 ml 0,22 μm gefilterd LB-medium. Herhaal de centrifugeer- en wasstappen 3x. Resuspendeer de pellet in 5 ml 0,22 μm gefilterde LB. Titratiepunt 2: Dit is de tweede aliquot voor titratie. Breng 50 μl van de bovenstaande bacteriële suspensie over door een steriel filter van 0,45 μm (zie materiaaltabel) met behulp van een vacuümfiltratiesysteem. Spoel het filter af met 100 ml 0,22 μm gefilterde LB.OPMERKING: De kopgrootte van bacteriofaag 9NA is 0,067 μm. Salmonella daarentegen is 2-5 μm lang en 0,5-1,5 μm breed. Dus als membranen van 0,45 μm worden gebruikt, zullen de meeste bacteriën niet passeren omdat ze groter zijn dan 0,45 μm, terwijl de meeste fagen door de filterporiën van 0,45 μm gaan. Verwijdering van bacteriofaag in Salmonella-cellenOm de afgifte van fagen uit bacteriecellen te vergemakkelijken, incubeert u het 0,45 μm filter met cellen gedurende 2 uur bij 37 °C in de incubator zonder het systeem te demonteren.OPMERKING: Deze incubatiestap is nodig om de lysis van de geïnfecteerde bacteriën en de afgifte van intracellulaire fagen in het filter te bevorderen. Was het filter van 0,45 μm met behulp van een vacuümfiltratiesysteem en spoel het filter af met 100 ml 0,22 μm gefilterde LB. Recupereer bacteriële cellen uit het filter in 2 ml 2x LB (20 g/l trypton, 10 g/l NaCl, 10 g/l gistextract; zie materiaaltabel). Breng hiervoor het 0,45 μm-filter met een steriele pincet over in een kolf. Voeg vervolgens 2 ml 2x LB toe aan het filter en pipetteer meerdere keren om de cellen uit het filter vrij te maken. Centrifugeer 1 ml van deze suspensie gedurende 2 minuten bij 10.354 x g. Gooi het supernatans weg en was de bacteriecellen 3x met 1 ml gefilterd LB-medium. Resuspendeer de cellen in 1 ml 2x LB. Titratiepunt 3: Dit is de derde aliquot voor titratie.OPMERKING: Het gebruik van een meer geconcentreerde LB (2x LB) wordt sterk aanbevolen omdat, zoals hieronder beschreven, in de handel verkrijgbare lipopolysaccharide (LPS) wordt toegevoegd en deze LPS oplost in water, waardoor het medium wordt verdund. Voorkom herinfectie door de bacteriofagen die vrijkomen uit bacteriële cellen te misleiden met in de handel verkrijgbare lipopolysacharide, zoals hieronder beschreven.Incubeer 20 μL van de bacteriële suspensie in aanwezigheid van een in de handel verkrijgbare S. enterica lipopolysaccharide (LPS; zie materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 3,75 mg/ml in 1 ml 0,22 μm gefilterde LB gedurende 2 uur bij 37 °C met schudden bij 200 tpm.OPMERKING: Fagen die uit cellen in het medium vrijkomen, kunnen zich binden aan de commerciële S. enterica LPS in plaats van bacteriële LPS. Breng na 2 uur incubatie 1 ml cultuur over in een microcentrifugebuis en centrifugeer de suspensie gedurende 2 minuten bij 10.354 x g. Titratiepunt 4: Gebruik het supernatans als vierde aliquot voor titratie. Was de pellet 3x met 1 ml gefilterd LB medium. Na het wassen resuspendeert u de pellet in 1 ml 2x LB. Incubeer 20 μl van dit mengsel in 1 ml 0,22 μm gefilterde LB met 0,8 mg/ml commercieel LPS gedurende 2 uur bij 37 °C met schudden bij 200 rpm. Titratiepunt 5: Gebruik de rest van de bacteriële suspensie voor de vijfde titratie. Breng na 2 uur incubatie 1 ml cultuur over in een microcentrifugebuis en pellet door centrifugatie gedurende 2 minuten bij 10.354 x g. Titratiepunt 6: Gebruik het supernatans als zesde aliquot voor titratie door het supernatans in een nieuwe injectieflacon te gieten. Was bacteriecellen 3x met gefilterde LB. Resuspendeer na het wassen de verzamelde cellen in 1 ml 0,22 μm gefilterde LB. Haal 1 ml bacteriële suspensie door een steriel filter van 0,45 μm met behulp van een vacuümfiltratiesysteem. Spoel het filter af met 100 ml 0,22 μm gefilterde LB. Herstel cellen uit het 0,45 μm-filter in 2 ml 2x LB-medium. Breng daartoe het 0,45 μm-filter met een steriele pincet over in een kolf. Voeg vervolgens 2 ml 2x LB toe aan het filter en pipetteer meerdere keren om te proberen de cellen uit het filter te verwijderen. Pellet 1 ml cellen door centrifugeren gedurende 2 minuten bij 10.354 x g. 3x wassen met 0,22 μm gefilterde LB. Na het wassen de verzamelde cellen resuspenderen in 1 ml 2x LB. Titratiepunt 7: Dit is de zevende aliquot voor titratie. Dit aliquot zal informatie geven over de efficiëntie van het verwijderen van fagen in bacterieculturen. 3. Bereiding van bacteriofaagvrije Salmonella-cultuur na verwijdering van bacteriofagen Bereid het faagvrije inoculum voor. Voeg 100 μL cellen uit de bacteriële suspensie toe aan 900 μL LB met 0,45 mg/ml LPS. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur met schudden bij 200 tpm. Titratiepunt 8: Bereid de achtste aliquot voor op titratie (de uiteindelijke potentiële niet-geïnfecteerde cultuur). Dit punt is om de afwezigheid van herinfectie van fagen te bevestigen.

Representative Results

Salmonella enterica en andere Gram-negatieve bacteriën hebben een buitenmembraan dat LPS bevat. Het O-antigeen van LPS is een veelgebruikte receptor door bacteriofagen 9NA om Salmonellaculturen te infecteren16,17. Gezien de specifieke affiniteit van bacteriofagen voor de O-antigeen- of kernpolysaccharidegebieden van LPS, wilden we onderzoeken of Salmonella enterica commerciële LPS kon worden gebruikt als afleidingsmanoeuvre om 9NA-bacteriofagen uit te sluiten. Om dit te doen, hebben we bekende concentraties van het commerciële LPS en 9NA-lysaat gemengd, gevolgd door een titratie. Commerciële LPS- en 9NA-bacteriofagen werden gemengd in een totaal volume van 200 μl en gedurende 2 uur bij 37 °C geïncubeerd zonder te schudden. Voor titratie werd 100 μL van het LPS-9NA-mengsel en 60 μL van een nachtelijke cultuur toegevoegd aan 5 ml LB zachte agar en op de bovenkant van een LB-plaat gegoten. De platen werden gedurende 24 uur bij 37 °C geïncubeerd. Zoals weergegeven in figuur 3, neemt de lysaattiter evenredig af wanneer de concentratie van S. enterica commercial LPS toeneemt. Deze resultaten geven aan dat de commerciële LPS correct functioneert als afleidingsvogel voor 9NA-bacteriofagen. Interessant is dat de tijd die faag 9NA nodig heeft om Salmonella-cellen te lyseren en fagen af te geven, wordt vergemakkelijkt door het aantal bacteriën en fagen (Figuur 4). Om te bestuderen hoe dit aspect het faagverwijderingsprotocol zou kunnen beïnvloeden, hebben we verschillende bacteriën: faagverhoudingen getest (1:1, 1:10, 1:100 en 1:1000). Zoals te zien is in figuur 4, is er een daling van OD600 nm van de cultuur na 1,5-2,5 uur na de toevoeging van 9NA-faag. OD600 nm-waarden die bijna nul naderen, zijn een indicatie dat de bacteriecultuur wordt gelyseerd18. Om deze reden werden de incubatietijden in dit protocol gedefinieerd als 2 uur om ervoor te zorgen dat fagen in Salmonella-cellen voldoende tijd hebben om bacteriën te lyseren en vrij te komen. Deze tijd moet voor elk gastheer-faagsysteem worden geschat voordat dit protocol wordt uitgevoerd. Nadat we hadden vastgesteld dat commercieel LPS werkt als een lokvogel en de lysistijd voor 9NA-geïnfecteerde bacteriën, voerden we het beschreven protocol uit voor het reinigen van geïnfecteerde Salmonella-culturen van de bacteriofagen (Figuur 1 en Figuur 2). Om de aanwezigheid van bacteriofagen langs elke stap van het protocol te controleren, hebben we plaque-assays uitgevoerd om de besmettelijkheid van de resulterende culturen in 100 μL van het resulterende mengsel op verschillende punten te berekenen (Figuur 5). We kunnen vaststellen dat herhaald wassen en filteren niet voldoende zijn voor de eliminatie van bacteriofagen uit culturen (titratiepunten 1-3); het aantal fagen neemt echter af zodra we een incubatiestap met commercieel LPS toepassen (titratiepunt 4). De cruciale stap voor de volledige verwijdering van bacteriofagen in een bacteriecultuur is de tweede incubatie met commercieel LPS (titratiepunt 6). Deze stap is essentieel voor een succesvolle verwijdering van 9NA-bacteriofaag in Salmonella-culturen . Een interessant aspect van dit protocol zou zijn om het niveau van faagresistentie te kennen na stappen voor het verwijderen van fagen. Een procedure die fagen scheidt van faagresistente bacteriën heeft geen nut. Om deze reden is het cruciaal om te onthullen dat de bacteriën die in de cultuur achterblijven faaggevoelig zijn. Om aan te tonen dat vatbare faagcellen na de procedure in de culturen achterblijven, gebruikten we Evans Blue Uranine (EBU) plaattest om te screenen op faagcontaminatie19. EBU-platen werden gemaakt van LB-medium aangevuld met 10 ml/L K2HPO4 25%, 5 ml/l glucose 50%, 2,5 ml/l fluoresceïne 1%, 1,25 ml/l Evans Blue 1% en 15 g/l agar. Cross-streaking op EBU-platen met 9NA-faag werd gebruikt om faagresistente en faaggevoelige isolaten te onderscheiden (Figuur 6). De bacterieculturen die aan het einde van het reinigingsprotocol werden verkregen, werden gebruikt om geïsoleerde kolonies te krijgen, die werden gecontroleerd op faagbesmetting (Figuur 6B). We kunnen het bestaan van zowel resistente als gevoelige cellen waarnemen. Dit protocol is niet voorstander van de selectie van faagresistente cellen; Het elimineert alleen bacteriofagen. Figuur 1: Korte schets van de procedure voor de eliminatie van bacteriofagen in Salmonellaculturen . De workflow is onderverdeeld in verschillende fasen: bereiding van bacteriecultuur en lysaat, infectie van de bacteriecultuur met bacteriofagen, verwijdering van bacteriofagen uit geïnfecteerde bacterieculturen en bereiding van een faagvrij bacterieel inoculum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Procedure voor het verwijderen van bacteriofagen uit geïnfecteerde Salmonella-invoerculturen. Het proces bestaat uit drie fasen: 1) Verwijdering van bacteriofagen in suspensie, 2) Verwijdering van fagen in bacteriële cellen en 3) Vermijden van herinfectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: LPS-loktest om de efficiëntie van Salmonella enterica commerciële LPS te meten om bacteriofagen te binden. Titrratie van een 9NA-lysaat (PFU/ml) bij toenemende concentraties van Salmonella enterica commercial LPS. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Bacteriofaag 9NA lysistijd in Salmonellaculturen . Groeicurves van de Salmonella enterica-culturen in aanwezigheid van bacteriofaag 9NA bij bacterie:faagverhoudingen van 1:1, 1:10, 1:100 en 1:1000. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Plaquetest voor infectiviteitstesten tijdens bacteriofaagverwijdering in Salmonella-culturen . (A) Titratie van acht aliquots werd uitgevoerd op verschillende punten van het protocol (titratiepunten 1-7 zijn gemarkeerd in figuur 2). Voor dit experiment werd gebruik gemaakt van Salmonella enterica serovar Typhimurium stam ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011) en bacteriofaag 9NA. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud en de gemiddelde en standaarddeviaties worden weergegeven. (B) Zachte agarplaten met Salmonella enterica werden verkregen volgens de overlay-techniek met behulp van aliquots van acht titratiepunten. De platen corresponderen van links naar rechts met de titratiepunten 1-8. (C) Optische dichtheid bij 600 nm bacteriecultuur op verschillende tijdstippen van het faagverwijderingsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Testen op faagresistente bacteriën na de procedure voor het verwijderen van bacteriofagen. (A) Schematisch diagram van een typische EBU-agarplaat die wordt gebruikt voor de kruisstreep-agartest: het verticale donkere gebied in het midden vertegenwoordigt de zone van 9NA-lysaat. De stip vertegenwoordigt de locatie waar de geteste cellen zijn geïnoculeerd op een veilige afstand van de lysaatzone, en de horizontale ononderbroken lijnen vertegenwoordigen ofwel de faagresistente cellen die over de lysaatzone groeien of de faaggevoelige cellen die niet buiten de lysaatzone groeien. (B) Aan het einde van het verwijderingsprotocol werden EBU-plaattesten voor het testen van 11 kolonies verkregen. Controle R en S zijn voorbeelden van respectievelijk faagresistente en faaggevoelige isolaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Bacteriofagen gebruiken verschillende strategieën om bacteriële gastheren te herkennen en te infecteren. Verschillende moleculaire structuren op het oppervlak van bacteriën kunnen fungeren als faagreceptoren: eiwit, polysacharide, lipopolysacchariden (LPS) en koolhydraatgroepen20. In Gram-negatieve bacteriën is LPS een veel voorkomende receptor voor fagen. Daarnaast zijn andere receptoren buitenmembraaneiwitten, pili en flagella21.

De specifieke interactie tussen bacteriofagen en bacteriën op basis van de herkenning van LPS8 is in dit werk benut voor de ontwikkeling van een zeer efficiënt protocol voor de eliminatie van bacteriofagen in geïnfecteerde bacterieculturen (Figuur 1 en Figuur 2). Ons protocol is geen voorstander van de selectie van faagresistente cellen; het elimineert alleen bacteriofagen (Figuur 6). Zowel faaggevoelige als faagresistente cellen blijven in bacteriecultuur na het uitvoeren van dit protocol voor het verwijderen van fagen.

De traditionele standaardpraktijk wanneer een faaginfectie optreedt, is om te proberen al het besmette materiaal te verwijderen, gevolgd door reiniging en sterilisatie22. De ontsmettingsprocedure omvat het blootstellen van de bacteriecultuur aan stressvolle omstandigheden, zoals hoge temperaturen, om de bacteriecellen gedeeltelijk of volledig te elimineren. Zoals beschreven in representatieve resultaten, is de cruciale stap in dit protocol de incubatie van met fagen geïnfecteerde bacterieculturen met commercieel LPS, een niet-schadelijke stof voor bacterieculturen. Dit helpt de levensvatbaarheid van bacterieculturen te behouden en biedt aanzienlijke voordelen voor industriële toepassingen in fermentoren en bioreactoren.

De incubatietijd in dit protocol is 2 uur om voldoende tijd te garanderen voor faaglysis van bacteriële cellen. Als er verschillende bacteriestammen en bacteriofagen moeten worden gebruikt, moet deze parameter door de gebruiker in overweging worden genomen en gedefinieerd. In dit geval moet voorafgaand aan het experiment een test worden uitgevoerd die vergelijkbaar is met die beschreven in figuur 4 .

Interessant is dat de werkzaamheid van dit reinigingsprotocol ook kan worden geanalyseerd door gebruik te maken van een test die de faaginhoud van een bepaald monster controleert. In die zin zijn epigenetische biosensoren een nieuw hulpmiddel voor de detectie van bacteriofagen23. Een bekende faagbiosensor die in staat is om colifagen te detecteren, die LPS als receptor gebruiken, is het opvAB::gfp-systeem 13,18,23,24. Deze faagbiosensor detecteert een toename van de OpvABON-subpopulatie in aanwezigheid van fagen die O-antigeen als receptor gebruiken. In die zin zouden we een opvAB::gfp-fusie kunnen gebruiken om LPS-bindende fagen te monitoren in verschillende stappen van dit protocol en/of diverse media en omstandigheden. Deze benaderingen kunnen waardevol zijn bij het bepalen van de timing en locaties waar een effectief protocol nodig kan zijn.

Hoewel LPS-herkenning gebruikelijk is, kunnen fagen ook een verscheidenheid aan andere oppervlaktereceptoren op bacteriële cellen gebruiken voor hechting en infectie. Hier hebben we de Gram-negatieve Salmonella gebruikt als representatieve enterobacteriën en de bacteriofaag 9NA die LPS gebruikt als receptor en genoomejectietrigger. Andere enterobacteriefagen (bijv. Escherichia coli T5) binden losjes aan LPS en hebben een buitenmembraaneiwit nodig voor genoominjectie. Het beschreven protocol is van toepassing op bacteriofagen die het O-antigeen van LPS herkennen en nodig hebben voor een succesvolle infectie, zoals 9NA, Det7 en P22 13,25,26,27. Dienovereenkomstig houdt de succesvolle implementatie van dit protocol voor de faagontsmetting van bacterieculturen in dat wordt bepaald of de bron van de faaginfectie herkenning van LPS in de gastheer vereist.

Concluderend, en ondanks de mogelijke beperkingen van het protocol, tonen onze representatieve resultaten duidelijk aan dat deze methode een krachtig hulpmiddel is om bacteriële Salmonella-culturen te reinigen van bacteriofagen die LPS gebruiken als receptor en trigger voor genoomejectie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Carmen R. Beuzón en Rocío Carvajal-Holguera voor hun nuttige discussies en suggesties. Dit werk werd ondersteund door de subsidie PID2020-116995RB-I00, gefinancierd door MICIU/AEI/ 10.13039/5011100011033 en het VI Plan Propio de Investigación y Transferencia van de Universidad de Sevilla.

Materials

20 mL syringe BD Discardit II 300296 No special requirements
50 mL conical tubes Avantor 525-0610 No special requirements
90 x 14 mm Petri dishes Deltalab 200209 No special requirements
Agar Sigma-Aldrich A1296 No special requirements
Bacteriophage lysate Minimal concentration: 109 PFU/mL
Centrifuge Eppendorf No special requirements
Chloroform Panreac 131252 No special requirements
Citric acid · H2O Merck 1.00247
Colony counter No special requirements
Evans Blue  Sigma-Aldrich E-2129
Flasks No special requirements
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F-6377
Forceps No special requirements
Glass tubes No special requirements
Glass tubes for lysate  No special requirements
Glucose  Sigma-Aldrich G7021
K2HPO4 Merck 1.05104.1000
K2HPO4 anhydrous  Merck 1.05104
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype Typhimurium Sigma-Aldrich L6511-25 mg Dissolved in sterile water
Membrane 0.45 µm  MF-Millipore HAWP02500 No special requirements
MgSO4 · 7 H2O Merck 1.05886
NaCl Sigma-Aldrich S9888 No special requirements
NaNH4HPO4 · 4 H2O Sigma-Aldrich S9506
Peptone iNtRON Ba2001 No special requirements
Syringe Filter 0.22 µm Millex SLGSR33SB No special requirements
Toothpicks No special requirements
Tryptone Panreac 403682.1210 No special requirements
Vacuum pump Thermo Scientific No special requirements
Yeast extract iNtRON 48045 No special requirements
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasman, L. M., Porter, L. D. . Bacteriophages. , (2024).
  2. Lawrence, D., Baldridge, M. T., Handley, S. A. Phages and human health: More than idle hitchhikers. Viruses. 11 (7), 587 (2019).
  3. Beller, L., Matthijnssens, J. What is (not) known about the dynamics of the human gut virome in health and disease. Curr Opin Virol. 37, 52-57 (2019).
  4. Roux, S., Hallam, S. J., Woyke, T., Sullivan, M. B. Viral dark matter and virus-host interactions resolved from publicly available microbial genomes. eLife. 4, 08490 (2015).
  5. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in aquatic ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (1), 69-114 (2000).
  6. Louten, J. Virus structure and classification. Essentl Human Virol. , 19-29 (2016).
  7. Egido, J. E., Costa, A. R., Aparicio-Maldonado, C., Haas, P. J., Brouns, S. J. J. Mechanisms and clinical importance of bacteriophage resistance. FEMS Microbiol Rev. 46 (1), 048 (2022).
  8. Rakhuba, D. V., Kolomiets, E. I., Dey, E. S., Novik, G. I. Bacteriophage receptors, mechanisms of phage adsorption and penetration into host cell. Polish J Microbiol. 59 (3), 145-155 (2010).
  9. Lindberg, A. A. Bacteriophage receptors. Ann Rev Microbiol. 27 (1), 205-241 (1973).
  10. Koskella, B., Meaden, S. Understanding bacteriophage specificity in natural microbial communities. Viruses. 5 (3), 806-823 (2013).
  11. Marcó, M. B., Moineau, S., Quiberoni, A. Bacteriophages and dairy fermentations. Bacteriophage. 2 (3), 149-158 (2012).
  12. Fernández-Fernández, R., et al. Evolution of a bistable genetic system in fluctuating and non-fluctuating environments. bioRxiv. , (2024).
  13. Cota, I., Blanc-Potard, A. B., Casadesús, J. STM2209-STM2208 (opvAB): a phase variation locus of Salmonella enterica involved in control of O-antigen chain length. PloS one. 7 (5), 36863 (2012).
  14. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods Mol Biol. 501, 69-76 (2009).
  15. Ackermann, H. W. Tailed bacteriophages: The order Caudovirales. Adv Virus Res. 51, 135-201 (1998).
  16. Wilkinson, R. G., Gemski, P., Stocker, B. A. D. Non-smooth mutants of Salmonella typhimurium: Differentiation by phage sensitivity and genetic mapping. J Gen Microbiol. 70 (3), 527-554 (1972).
  17. Casjens, S. R., Leavitt, J. C., Hatfull, G. F., Hendrix, R. W. Genome sequence of Salmonella Phage 9NA. Genome Announc. 2 (4), 00531-00614 (2014).
  18. Cota, I., et al. Epigenetic control of Salmonella enterica O-antigen chain length: A tradeoff between virulence and bacteriophage resistance. PLoS Genet. 11 (11), 1005667 (2015).
  19. Chan, K., Botstein, D., Watanabe, T., Ogata, Y. Specialized transduction of tetracycline resistance by phage P22 in Salmonella typhimurium. Virology. 50, 883-898 (1972).
  20. Bertozzi Silva, J., Storms, Z., Sauvageau, D. Host receptors for bacteriophage adsorption. FEMS Microbiol Lett. 363 (4), 002 (2016).
  21. Sørensen, M. C. H., et al. Bacteriophage F336 recognizes the capsular phosphoramidate modification of Campylobacter jejuni NCTC11168. J Bacteriol. 193 (23), 6742-6749 (2011).
  22. Ogata, S., Hongo, M. Bacteriophages of the Genus Clostridium. Adv Appl Microbiol. 25, 241-273 (1979).
  23. Olivenza, D. R., Casadesús, J., Ansaldi, M. Epigenetic biosensors for bacteriophage detection and phage receptor discrimination. Environ Microbiol. 22 (8), 3126-3142 (2020).
  24. Olivenza, D. R., et al. A portable epigenetic switch for bistable gene expression in bacteria. Sci Rep. 9 (1), 862 (2019).
  25. Walter, M., et al. Structure of the receptor-binding protein of bacteriophage Det7: a Podoviral tail spike in a Myovirus. J Virol. 82 (5), 2265-2273 (2008).
  26. Davies, M. R., Broadbent, S. E., Harris, S. R., Thomson, N. R., van der Woude, M. W. Horizontally acquired Glycosyltransferase operons drive Salmonellae lipopolysaccharide diversity. PLoS Genet. 9 (6), 1003568 (2013).
  27. Wahl, A., Battesti, A., Ansaldi, M. Prophages in Salmonella enterica: a driving force in reshaping the genome and physiology of their bacterial host. Mol Microbiol. 111 (2), 303-316 (2019).

Tags

Bacteriophage RemovalSalmonella CulturesPhage Removal ProtocolLipopolysaccharides (LPS)Gram-negative BacteriaBacterial Culture IntegrityExperimental ResultsProduct Quality

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fernández-Fernández, R., Olivenza, D. R., Sánchez-Romero, M. A. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (208), e66855, doi:10.3791/66855 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image