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Biology

Élimination des bactériophages dans des cultures de salmonelles infectées

Published: June 28, 2024
doi:
10.3791/66855
, ,
1Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia,Universidad de Sevilla, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología,Universidad de Sevilla

Summary

Les bactériophages, omniprésents et diversifiés sur Terre, infectent et se répliquent au sein d’hôtes bactériens, jouant un rôle crucial dans les écosystèmes microbiens. Malgré leur importance, leur présence peut perturber les processus industriels. Nous avons développé une méthode utilisant des lipopolysaccharides bactériens pour éliminer les bactériophages des cultures de Salmonella .

Abstract

Les bactériophages, ou simplement phages, jouent un rôle essentiel dans les environnements microbiens, impactant les populations bactériennes et façonnant leur évolution et leurs interactions. Ces organismes sont des virus qui infectent et se répliquent au sein d’hôtes bactériens. Les phages sont omniprésents sur Terre, très diversifiés et très abondants. Bien que les bactériophages jouent un rôle précieux dans différents environnements et constituent un domaine clé de recherche en microbiologie et en écologie, leur présence peut être indésirable dans certains processus ou produits industriels. Compte tenu de l’abondance et de l’omniprésence des bactériophages sur Terre, la conception de procédures pour l’élimination des bactériophages des cultures bactériennes est cruciale dans diverses applications de laboratoire et industrielles afin de préserver l’intégrité des cultures et d’assurer des résultats expérimentaux précis ou la qualité du produit. Ici, nous avons mis au point un protocole pour éliminer les bactériophages des cultures infectées de Salmonella enterica , en utilisant une stratégie basée sur l’utilisation de lipopolysaccharides (LPS) situés dans la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Le LPS bactérien joue un rôle important dans la reconnaissance de l’hôte par les phages, et nous utilisons cette propriété pour concevoir une procédure efficace pour l’élimination des phages, qui utilisent le LPS comme récepteur, dans les cultures bactériennes de Salmonella .

Introduction

Les populations microbiennes sont confrontées à de multiples défis dans les environnements naturels, et le potentiel d’infection par des bactériophages, les virus qui infectent les bactéries, constitue une menace particulièrement grave1. Ces virus sont répandus sur la planète, présentant une grande diversité et une grande abondance 2,3,4,5. Bien que les bactériophages soient divers en termes de taille, de morphologie et d’organisation génomique, tous partagent la même structure : un génome d’ADN ou d’ARN enveloppé d’une capside formée par des protéines codées par des phages6. Les bactéries ont développé un large éventail de mécanismes de défense contre elles7. Un aspect clé de l’infection bactériophage, qui est pertinent pour la caractérisation ainsi que pour la détection, est les domaines de liaison aux récepteurs présents sur les fibres de la queue. Les bactériophages ont des protéines à leur surface appelées protéines de liaison aux récepteurs ou fibres de la queue pour reconnaître et se lier à des sites récepteurs spécifiques à la surface de la cellule bactérienne. Dans le cas des bactéries à Gram négatif, la reconnaissance des structures de surface, telles que les lipopolysaccharides (LPS), les protéines de la membrane externe, les pili et/ou les flagelles, est impliquée dans l’interaction phage-bactérie8. Cette interaction entre les bactériophages et les bactéries est très spécifique et dépend principalement de leur capacité à se fixer aux surfaces de l’hôte. L’antigène O du lipopolysaccharide est un récepteur9 couramment utilisé.

L’étude des interactions bactériophages-bactéries n’est pas seulement fascinante d’un point de vue biologique, mais a également des applications pratiques dans des domaines tels que la phagothérapie et la biotechnologie. Bien que les bactériophages jouent un rôle précieux dans divers contextes, par exemple en modifiant les populations microbiennes10, leur présence peut être indésirable dans certains processus industriels. Dans les secteurs pharmaceutique, biotechnologique et alimentaire, la présence de bactériophages peut avoir un impact sur la qualité et la sécurité des produits finis, ce qui rend leur élimination essentielle pour répondre aux normes de qualité. Dans les bioprocédés et les biofabrications, où les cultures bactériennes sont utilisées pour produire divers composés (p. ex., protéines, enzymes ou antibiotiques), la présence de bactériophages peut entraîner la perturbation des processus de production en raison de leur capacité à équilibrer la population bactérienne dans chaque environnement partagé. Les phages peuvent parfois transformer la vie professionnelle du microbiologiste industriel en cauchemar11. La conception de procédures efficaces pour éliminer les phages est essentielle pour assurer une production cohérente et fiable, améliorant ainsi l’efficacité du processus. En dehors de ces aspects industriels, dans un cadre de laboratoire de recherche, où la précision et la reproductibilité sont cruciales, l’élimination des bactériophages est essentielle pour obtenir des résultats précis et fiables. De plus, l’élimination des phages peut également être utilisée pour simuler des environnements variés afin de tester différentes hypothèses12. L’élimination des phages peut également être très utile dans l’environnement de recherche, car de nombreuses études basées sur les phages, telles que le dénombrement des bactéries après l’application de phages, bénéficieraient d’une étape pour éliminer les phages afin de produire des comptages viables beaucoup plus fiables.

L’élimination des phages basée sur l’isolement des colonies prendrait plusieurs jours pour s’assurer que les colonies sont exemptes de phages, alors que la procédure décrite ici permet de générer des cultures exemptes de phages en quelques heures. Ce protocole nous permet de suivre l’évolution des cultures bactériennes sans les empêcher d’isoler les colonies. En ce sens, il est possible de simuler des environnements fluctuants (présence et/ou absence de phages) pour tester différentes hypothèses. De plus, ce protocole permet l’analyse qualitative et quantitative de la présence de phages dans une culture bactérienne.

En résumé, la conception de procédures rentables pour l’élimination des bactériophages est cruciale pour maintenir la qualité, la sécurité et l’efficacité des produits dans diverses industries et pour faire progresser la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous décrivons un protocole très efficace basé sur l’utilisation du LPS pour l’élimination des bactériophages, qui utilisent le LPS comme récepteur, à partir de cultures de Salmonella infectées, ce qui est à la fois rapide et nécessite un équipement minimal.

Protocol

REMARQUE : Avant d’effectuer la procédure d’élimination des phages, nous décrivons la préparation d’une culture de Salmonella infectée par des bactériophages 9NA. La figure 1 illustre une représentation générale de la procédure complète d’élimination des bactériophages dans les cultures bactériennes. 1. Préparation de cultures de Salmonella infectées par des bactériophages Préparation de la culture bactérienneREMARQUE : Dans cette étude, on a utilisé la souche ATCC 14028 de Typhimurium sérovar de Salmonella enterica (SV8011)13.Décongelez lentement le flacon récupéré à -80 °C qui contient la souche d’intérêt de S. enterica en le plaçant sur de la glace. Étalez la souche de S. enterica du bouillon de sulfoxyde de diméthyle décongelé sur une plaque de bouillon Lennox (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L d’agar, voir le tableau des matières). Incuber la plaque à 37 °C pendant 24 h. À l’aide d’une aiguille d’inoculation, transférez une colonie de la plaque de S. enterica et inocunez-la dans 5 mL de LB liquide dans un tube de verre. Incuber à 37 °C pendant 24 h avec aération en secouant à 200 tr/min. Préparation des bactériophagesREMARQUE : Le bactériophage 9NA, qui appartient à la famille des Siphoviridae (ordre des Caudovirales)14, a été utilisé dans ce protocole. Notamment, d’autres bactériophages de Salmonella enterica qui utilisent l’antigène O du lipopolysaccharide comme récepteur peuvent être utilisés.Préparez le bouillon de bactériophage en ajoutant 0,1 mL de lysat de bactériophage concentré à un mélange de 100 mL de bouillon nutritif (NB ; 5 g/L de peptone et 3 g/L d’extrait de levure), 2 mL de sels 50x E (38,78 mM MgSO47 H2O, 520,5 mM d’acide citrique H2O, 2,87 M K2HPO4 anhydre et 829 mM NaNH4HPO44 H2O) et 0,4 mL de 50 % glucose. Bien mélanger par inversion.Un exemple représentatif de la concentration de bactériophages pourrait être de 109 UFP/mL (unités formant des plaques/mL), mais des concentrations plus faibles peuvent être utilisées avec des résultats similaires (voir le tableau des matériaux). Estimer la concentration de bactériophages à la suite de l’étape 1.2.3. Préparez le lysat en suivant les étapes décrites ci-dessous.Préparez l’inoculum de S. enterica dans 5 mL de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L de NaCl et 5 g/L d’extrait de levure). Incuber à 37 °C et 200 tr/min pendant 24 h. Mélanger 4 ml de bouillon bactériophage avec 1 ml de culture de nuit de S. enterica. Incuber le mélange à 37 °C et 200 tr/min pendant 8 h. Pour faire la distinction entre les bactéries et les bactériophages, centrifuger le mélange à 2 377 x g pendant 20 min. Récupérez le surnageant dans un tube de verre, ajoutez 800 μL de chloroforme (voir le tableau des matériaux) et vortexez-le. Assurez-vous de ne transférer la phase supérieure que lorsqu’un mélange avec du chloroforme est utilisé.REMARQUE : Il est important d’éviter le transfert de chloroforme résiduel, ce qui pourrait nuire à l’efficacité de la procédure. L’étape du chloroforme est courante dans les protocoles d’isolement et de propagation comme moyen de maximiser les phages libérés. Cependant, le chloroforme peut inactiver certains phages ou détruire leur infectiosité15. Par conséquent, cette étape ne s’applique qu’aux phages résistants au chloroforme. Maintenez les lysats à température ambiante pendant 2 h puis stockez-les à 4 °C. Titrer le lysat pour quantifier le nombre de bactériophages/nombre d’UFP par mL présent dans le lysat préparé. Pour ce faire, effectuez la technique de superposition décrite ci-dessous.Préparez 5 ml de LB d’inoculum pour S. enterica. Incuber à 37 °C pendant 24 h avec aération en secouant à 200 tr/min. Effectuez des dilutions en série du lysat dans LB pour atteindre un nombre dénombrable de PFU/mL. Pour déterminer les facteurs de dilution nécessaires, il faut identifier le lysat de bactériophage initial concentré. À titre d’exemple représentatif de concentration de bactériophages d’environ 109 UFP/mL, les facteurs de dilution qui entraînent un nombre dénombrable de plaques sont compris entre 106 et 1010. Ajouter 100 μL de la dilution de lysat appropriée et 60 μL de la culture de nuit de S. enterica préparée la veille à 5 mL de gélose molle LB, préparée en mélangeant de la LB liquide et de la gélose LB dans une proportion de 1:1 et en maintenant à 56 °C pour éviter la solidification. Mélangez soigneusement, en évitant les bulles. Versez chaque mélange dans le haut d’une assiette LB et conservez sur le banc jusqu’à ce que le milieu se solidifie. Incuber les plaques pendant 24 h à 37 °C. Comptez le nombre de plaques sur chaque assiette. Pour déterminer le nombre de PFU/mL, multipliez le nombre de plaques de chaque plaque par le facteur de dilution (FD). Pour assurer une phaxie efficace, 109-10 12 UFP/ml sont nécessaires.PFU/mL = Non. plaques dans la plaque x FD Infection des cultures de Salmonella par des bactériophagesDiluer une culture de nuit de S. enterica à 1:100 dans un volume final de 5 mL de LB et ajouter 0,1 mL de lysat (concentré à 109-10 12 UFP/mL). Incuber à 37 °C et 200 tr/min pendant 24 h. Détermination du titre de phage sous forme de PFU dans le dosage sur plaquePour quantifier le nombre de bactériophages dans la culture infectée, effectuer des dosages sur plaque pour déterminer le titre de phage en PFU/mL, comme décrit ci-dessous.Transférez 1 mL de la culture dans un tube. Centrifugez à 17 115 x g pendant 2 min et versez le surnageant dans un nouveau flacon étiqueté. Ajoutez 100 μL de chloroforme dans le flacon et vortex pour éliminer les débris bactériens de la solution. Suivez l’étape 1.2.3. 2. Élimination des bactériophages des cultures infectées de Salmonella enterica (voir la figure 2) REMARQUE : Pour surveiller le processus d’élimination des bactériophages, différentes aliquotes sont prélevées tout au long du protocole de nettoyage pour le titrage. Au total, il y a huit aliquotes pour confirmer que le nombre de PFU/mL diminue tout au long du processus de nettoyage jusqu’à l’élimination complète. Élimination des bactériophages en suspensionDiluer la culture bactérienne contenant des phages à 1:100 dans 5 mL de LB filtrée à 0,22 μm dans un tube à centrifuger conique de 50 mL. Point de titrage 1 : Il s’agit de la première aliquote pour le titrage (la culture de Salmonella infectée de départ). Centrifuger la suspension pendant 10 min à 2 377 x g. Retirez délicatement le surnageant. N’utilisez pas de pipette ; Versez le tube. Essayez de laisser un peu de volume au fond du tube de centrifugation conique pour assurer la présence de cellules. Laver les cellules bactériennes avec 10 ml de milieu LB filtré à 0,22 μm. Répétez les étapes de centrifugation et de lavage 3x. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de LB filtrée de 0,22 μm. Point de titrage 2 : Il s’agit de la deuxième aliquote pour le titrage. Transvaser 50 μL de la suspension bactérienne ci-dessus à travers un filtre stérile de 0,45 μm (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un système de filtration sous vide. Rincez le filtre avec 100 ml de LB filtré de 0,22 μm.REMARQUE : La taille de la tête du bactériophage 9NA est de 0,067 μm. En revanche, Salmonella mesure de 2 à 5 m de long et de 0,5 à 1,5 m de large. Ainsi, si des membranes de 0,45 μm sont utilisées, la plupart des bactéries ne passeront pas car elles sont supérieures à 0,45 μm, tandis que la plupart des phages passeront par les pores filtrants de 0,45 μm. Élimination des bactériophages contenus dans les cellules de SalmonellaPour faciliter la libération des phages à partir des cellules bactériennes, incubez le filtre de 0,45 μm contenant des cellules pendant 2 h à 37 °C à l’intérieur de l’incubateur sans démonter le système.REMARQUE : Cette étape d’incubation est nécessaire pour favoriser la lyse des bactéries infectées et la libération de phages intracellulaires dans le filtre. Lavez le filtre de 0,45 μm à l’aide d’un système de filtration sous vide, en rinçant le filtre avec 100 ml de LB filtré de 0,22 μm. Récupérez les cellules bactériennes du filtre dans 2 mL de 2x LB (20 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 10 g/L d’extrait de levure ; voir le tableau des matériaux). Pour ce faire, transférez le filtre de 0,45 μm dans un ballon à l’aide d’une pince stérile. Ensuite, ajoutez 2 ml de 2x LB sur le filtre et pipetez plusieurs fois pour libérer les cellules du filtre. Centrifuger 1 mL de cette suspension pendant 2 min à 10 354 x g. Jeter le surnageant et laver les cellules bactériennes 3 fois avec 1 mL de milieu LB filtré. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 2x LB. Point de titrage 3 : Il s’agit de la troisième aliquote pour le titrage.REMARQUE : L’utilisation d’un LB plus concentré (2x LB) est fortement recommandée car, comme décrit ci-dessous, un lipopolysaccharide commercial (LPS) sera ajouté, et ce LPS se dissout dans l’eau, diluant ainsi le milieu. Évitez de réinfecter en trompant les bactériophages libérés par les cellules bactériennes avec du lipopolysaccharide commercial, comme décrit ci-dessous.Incuber 20 μL de la suspension bactérienne en présence d’un lipopolysaccharide (LPS) commercial de S. enterica jusqu’à une concentration finale de 3,75 mg/mL dans 1 mL de LB filtré à 0,22 μm pendant 2 h à 37 °C en agitant à 200 tr/min.REMARQUE : Les phages libérés par les cellules dans le milieu peuvent se lier au LPS commercial de S. enterica au lieu du LPS bactérien. Après 2 h d’incubation, transférer 1 mL de culture dans un tube de microcentrifugation et centrifuger la suspension pendant 2 min à 10 354 x g. Point de titrage 4 : Utiliser le surnageant comme quatrième aliquote pour le titrage. Lavez les granulés 3 fois avec 1 ml de média LB filtré. Après le lavage, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de 2x LB. Incuber 20 μL de ce mélange dans 1 mL de LB filtré de 0,22 μm avec 0,8 mg/mL de LPS commercial pendant 2 h à 37 °C avec agitation à 200 tr/min. Point de titrage 5 : Utilisez le reste de la suspension bactérienne pour le cinquième titrage. Après 2 h d’incubation, transférer 1 mL de culture dans un tube de microcentrifugation et la granuler par centrifugation pendant 2 min à 10 354 x g. Point de titrage 6 : Utiliser le surnageant comme sixième aliquote pour le titrage en versant le surnageant dans un nouveau flacon. Laver les cellules bactériennes 3 fois avec du LB filtré. Après le lavage, remettre en suspension les cellules collectées dans 1 mL de LB filtré à 0,22 μm. Passer 1 mL de suspension bactérienne à travers un filtre stérile de 0,45 μm à l’aide d’un système de filtration sous vide. Rincez le filtre à l’aide de 100 ml de LB filtré de 0,22 μm. Récupérez les cellules du filtre de 0,45 μm dans 2 mL de milieu 2x LB. Pour ce faire, transférez le filtre de 0,45 μm dans un ballon à l’aide d’une pince stérile. Ensuite, ajoutez 2 ml de 2x LB sur le filtre et pipetez plusieurs fois pour essayer de libérer les cellules du filtre. Granuler 1 mL de cellules par centrifugation pendant 2 min à 10 354 x g. Laver 3 fois avec 0,22 μm de LB filtré. Après le lavage, remettre en suspension les cellules collectées dans 1 mL de 2x LB. Point de titrage 7 : Il s’agit de la septième aliquote pour le titrage. Cette aliquote renseignera sur l’efficacité de l’élimination des phages dans les cultures bactériennes. 3. Préparation d’une culture de Salmonella exempte de bactériophages après élimination des bactériophages Préparez l’inoculum sans phages. Ajouter 100 μL de cellules de la suspension bactérienne à 900 μL de LB contenant 0,45 mg/mL de LPS. Incuber à 37 °C pendant 24 h avec agitation à 200 tr/min. Point de titrage 8 : Préparer la huitième aliquote pour le titrage (la dernière culture potentiellement non infectée). Ce point vise à confirmer l’absence de réinfection par les phages.

Representative Results

Salmonella enterica et d’autres bactéries à Gram négatif ont une membrane externe contenant du LPS. L’antigène O du LPS est un récepteur couramment utilisé par les bactériophages 9NA pour infecter les cultures de Salmonella 16,17. Étant donné l’affinité spécifique des bactériophages pour l’antigène O ou les régions polysaccharidiques centrales du LPS, nous voulions examiner si le LPS commercial de Salmonella enterica pouvait être utilisé comme leurre pour exclure les bactériophages 9NA. Pour ce faire, nous avons mélangé des concentrations connues de LPS commercial et de lysat 9NA, suivi d’un titrage. Les bactériophages commerciaux LPS et 9NA ont été mélangés dans un volume total de 200 μL et incubés pendant 2 h à 37 °C sans agitation. Pour le titrage, 100 μL du mélange LPS-9NA et 60 μL d’une culture de nuit ont été ajoutés à 5 mL de gélose molle LB et versés sur le dessus d’une plaque LB. Les plaques ont été incubées pendant 24 h à 37 °C. Comme le montre la figure 3, le titre de lysat diminue proportionnellement lorsque la concentration de LPS commerciale de S. enterica augmente. Ces résultats indiquent que le LPS commercial fonctionne correctement comme un leurre pour les bactériophages 9NA. Il est intéressant de noter que le temps nécessaire au phage 9NA pour lyser les cellules de Salmonella et libérer les phages est facilité par le nombre de bactéries et de phages (Figure 4). Afin d’étudier comment cet aspect pourrait affecter le protocole d’élimination des phages, nous avons testé différentes bactéries : rapports de phages (1:1, 1:10, 1:100 et 1:1000). Comme le montre la figure 4, il y a une baisse deDO 600 nm de la culture à 1,5-2,5 h après l’ajout du phage 9NA. Des valeurs OD600 nm proches de zéro indiquent que la culture bactérienne est en train d’être lysée18. Pour cette raison, les temps d’incubation dans ce protocole ont été définis à 2 h afin d’assurer un temps suffisant pour que les phages contenus à l’intérieur des cellules de Salmonella lysent les bactéries et soient libérés. Ce temps doit être estimé pour chaque système hôte-phage avant d’exécuter ce protocole. Une fois que nous avons déterminé que le LPS commercial fonctionne comme un leurre et le temps de lyse pour les bactéries infectées par le 9NA, nous avons exécuté le protocole décrit pour le nettoyage des cultures de Salmonella infectées des bactériophages (figures 1 et 2). Afin de surveiller la présence de bactériophages à chaque étape du protocole, nous avons effectué des tests de plaques pour calculer l’infectiosité des cultures résultantes dans 100 μL du mélange résultant en différents points (Figure 5). On peut observer que des lavages et des filtrations répétés ne sont pas suffisants pour l’élimination des bactériophages des cultures (points de titrage 1-3) ; cependant, le nombre de phages diminue dès que nous employons une étape d’incubation avec des LPS commerciaux (point de titrage 4). L’étape cruciale pour l’élimination complète des bactériophages dans une culture bactérienne est la deuxième incubation avec du LPS commercial (point de titrage 6). Cette étape est essentielle pour réussir l’élimination du bactériophage 9NA dans les cultures de Salmonella . Un aspect intéressant de ce protocole serait de connaître le niveau de résistance des phages après les étapes d’élimination des phages. Une procédure qui sépare les phages des bactéries résistantes aux phages n’a aucune utilité. Pour cette raison, il est crucial de révéler que la bactérie restant dans la culture est sensible aux phages. Pour démontrer que les cellules de phage sensibles restent dans les cultures après la procédure, nous avons utilisé le test sur plaque Evans Blue Uranine (EBU) pour dépister la contamination par les phages19. Les plaques EBU ont été faites d’un milieu LB complété par 10 mL/L de K2HPO4 25 %, 5 mL/L de glucose 50 %, 2,5 mL/L de fluorescéine 1 %, 1,25 mL/L d’Evans Blue 1 % et 15 g/L de gélose. On a utilisé des liaisons croisées sur des plaques d’UER avec des isolats de phage 9NA pour distinguer les isolats résistants aux phages et sensibles aux phages (figure 6). Les cultures bactériennes obtenues à la fin du protocole de nettoyage ont permis d’obtenir des colonies isolées, qui ont été vérifiées pour la contamination par les phages (Figure 6B). On peut observer l’existence de cellules à la fois résistantes et sensibles. Ce protocole ne favorise pas la sélection de cellules résistantes aux phages ; Il élimine uniquement les bactériophages. Figure 1 : Bref aperçu de la procédure d’élimination des bactériophages dans les cultures de Salmonella. Le flux de travail est divisé en différentes étapes : préparation de la culture bactérienne et du lysat, infection de la culture bactérienne par des bactériophages, élimination des bactériophages des cultures bactériennes infectées et préparation d’un inoculum bactérien exempt de phages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Procédure d’élimination des bactériophages dans les cultures infectées de Salmonella Enter. Le processus se compose de trois phases : 1) Élimination des bactériophages en suspension, 2) Élimination des phages contenus dans les cellules bactériennes et 3) Prévention de la réinfection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Essai de leurre LPS pour mesurer l’efficacité du LPS commercial de Salmonella enterica à se lier aux bactériophages. Titrage d’un lysat de 9NA (PFU/mL) à des concentrations croissantes de LPS commercial de Salmonella enterica. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. La moyenne et l’écart-type sont présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Temps de lyse du bactériophage 9NA dans les cultures de Salmonella. Courbes de croissance des cultures de Salmonella enterica en présence du bactériophage 9NA à des rapports bactéries :phages de 1:1, 1:10, 1:100 et 1:1000. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. La moyenne et l’écart-type sont présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Dosage sur plaque pour les tests d’infectiosité lors de l’élimination des bactériophages dans les cultures de Salmonella. (A) Le titrage de huit aliquotes a été effectué à différents points du protocole (les points de titrage 1 à 7 sont marqués à la figure 2). Pour cette expérience, on a utilisé le sérovar de Salmonella enterica, la souche ATCC 14028 opvAB ::lacZ (SV8011) et le bactériophage 9NA. Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires, et la moyenne et les écarts-types sont indiqués. (B) Des plaques de gélose molle avec Salmonella enterica ont été obtenues en suivant la technique de recouvrement à l’aide d’aliquotes provenant de huit points de titrage. Les plaques correspondent de gauche à droite avec des points de titrage de 1 à 8. (C) Densité optique à 600 nm de culture bactérienne à différents moments du protocole d’élimination des phages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Test de détection des bactéries résistantes aux phages après la procédure d’élimination des bactériophages. (A) Schéma d’une plaque de gélose typique de l’EBU utilisée pour le test de gélose à stries croisées : la région sombre verticale au centre représente la zone de lysat 9NA. Le point représente l’endroit où les cellules testées sont inoculées à une distance de sécurité de la zone de lysat, et les lignes continues horizontales représentent soit les cellules résistantes aux phages qui se développent à travers la zone de lysat, soit les cellules sensibles aux phages qui ne se développent pas au-delà de la zone de lysat. (B) Des dosages sur plaque de l’UER pour l’essai de 11 colonies ont été obtenus à la fin du protocole d’élimination. Les témoins R et S sont des exemples d’isolats résistants aux phages et sensibles aux phages, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Diverses stratégies sont employées par les bactériophages pour reconnaître et infecter les hôtes bactériens. Différentes structures moléculaires à la surface des bactéries peuvent agir comme des récepteurs de phages : protéines, polysaccharides, lipopolysaccharides (LPS) et fractions glucidiques20. Chez les bactéries à Gram négatif, le LPS est un récepteur commun pour les phages. De plus, les autres récepteurs sont les protéines de la membrane externe, les pili et les flagelles21.

L’interaction spécifique entre bactériophages et bactéries basée sur la reconnaissance de LPS8 a été exploitée dans ce travail pour le développement d’un protocole très efficace d’élimination des bactériophages dans les cultures bactériennes infectées (Figure 1 et Figure 2). Notre protocole ne favorise pas la sélection de cellules résistantes aux phages ; il élimine uniquement les bactériophages (Figure 6). Les cellules sensibles aux phages et résistantes aux phages restent en culture bactérienne après l’exécution de ce protocole d’élimination des phages.

La pratique standard traditionnelle en cas d’infection lysologique est d’essayer d’éliminer tout le matériel contaminé, suivi d’un nettoyage et d’une stérilisation22. La procédure de décontamination consiste à exposer la culture bactérienne à des conditions stressantes, telles que des températures élevées, afin d’éliminer partiellement ou complètement les cellules bactériennes. Comme décrit dans des résultats représentatifs, l’étape cruciale de ce protocole est l’incubation de cultures bactériennes infectées par des phages avec du LPS commercial, une substance non nocive pour les cultures bactériennes. Cela permet de préserver la viabilité des cultures bactériennes et offre des avantages significatifs pour les applications industrielles dans les fermenteurs et les bioréacteurs.

Le temps d’incubation dans ce protocole est de 2 h pour assurer un temps suffisant pour la lyse des cellules bactériennes par phage. Si différentes souches bactériennes et bactériophages doivent être utilisés, ce paramètre doit être pris en compte et défini par l’utilisateur. Dans ce cas, un essai similaire à celui décrit à la figure 4 doit être effectué avant l’expérience.

Il est intéressant de noter que l’efficacité de ce protocole de nettoyage pourrait également être analysée en utilisant un test qui surveille la teneur en phages d’un échantillon donné. En ce sens, les biocapteurs épigénétiques sont un nouvel outil pour la détection des bactériophages23. Un biocapteur de phage bien connu capable de détecter les coliphages, qui utilisent le LPS comme récepteur, est le système opvAB ::gfp 13,18,23,24. Ce biocapteur de phages détecte une augmentation de la sous-population OpvABON en présence de phages qui utilisent l’antigène O comme récepteur. En ce sens, nous pourrions utiliser une fusion opvAB ::gfp pour surveiller les phages de liaison au LPS dans diverses étapes de ce protocole et/ou dans divers milieux et conditions. Ces approches pourraient être utiles pour déterminer le moment et les endroits où un protocole efficace pourrait être nécessaire.

Bien que la reconnaissance du LPS soit courante, les phages peuvent également utiliser une variété d’autres récepteurs de surface sur les cellules bactériennes pour la fixation et l’infection. Ici, nous avons utilisé la Salmonella à Gram négatif comme entérobactérie représentative et le bactériophage 9NA qui utilise le LPS comme récepteur et déclencheur d’éjection du génome. D’autres phages d’entérobactéries (p. ex., Escherichia coli T5) se lient faiblement au LPS et nécessitent une protéine de membrane externe pour l’injection du génome. Le protocole décrit s’applique aux bactériophages qui reconnaissent et ont besoin de l’antigène O du LPS pour une infection réussie, tels que 9NA, Det7 et P22 13,25,26,27. Par conséquent, la mise en œuvre réussie de ce protocole pour la décontamination des cultures bactériennes par les phages implique de déterminer si la source de l’infection par les phages nécessite la reconnaissance du LPS chez l’hôte.

En conclusion, et malgré les limites potentielles du protocole, nos résultats représentatifs démontrent clairement que cette méthode est un outil puissant pour nettoyer les cultures bactériennes de Salmonella de bactériophages qui utilisent le LPS comme récepteur et déclencheur d’éjection du génome.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Carmen R. Beuzón et Rocío Carvajal-Holguera pour leurs discussions et suggestions utiles. Ce travail a été soutenu par la subvention PID2020-116995RB-I00 financée par MICIU/AEI/ 10.13039/5011100011033 et le VI Plan Propio de Investigación y Transferencia de l’Universidad de Sevilla.

Materials

20 mL syringe BD Discardit II 300296 No special requirements
50 mL conical tubes Avantor 525-0610 No special requirements
90 x 14 mm Petri dishes Deltalab 200209 No special requirements
Agar Sigma-Aldrich A1296 No special requirements
Bacteriophage lysate Minimal concentration: 109 PFU/mL
Centrifuge Eppendorf No special requirements
Chloroform Panreac 131252 No special requirements
Citric acid · H2O Merck 1.00247
Colony counter No special requirements
Evans Blue  Sigma-Aldrich E-2129
Flasks No special requirements
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F-6377
Forceps No special requirements
Glass tubes No special requirements
Glass tubes for lysate  No special requirements
Glucose  Sigma-Aldrich G7021
K2HPO4 Merck 1.05104.1000
K2HPO4 anhydrous  Merck 1.05104
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype Typhimurium Sigma-Aldrich L6511-25 mg Dissolved in sterile water
Membrane 0.45 µm  MF-Millipore HAWP02500 No special requirements
MgSO4 · 7 H2O Merck 1.05886
NaCl Sigma-Aldrich S9888 No special requirements
NaNH4HPO4 · 4 H2O Sigma-Aldrich S9506
Peptone iNtRON Ba2001 No special requirements
Syringe Filter 0.22 µm Millex SLGSR33SB No special requirements
Toothpicks No special requirements
Tryptone Panreac 403682.1210 No special requirements
Vacuum pump Thermo Scientific No special requirements
Yeast extract iNtRON 48045 No special requirements
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References

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Fernández-Fernández, R., Olivenza, D. R., Sánchez-Romero, M. A. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (208), e66855, doi:10.3791/66855 (2024).
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