Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi

NOT: Fajların eliminasyon prosedürünü gerçekleştirmeden önce, 9NA bakteriyofajları ile enfekte olmuş bir Salmonella kültürünün hazırlanmasını tarif ediyoruz. Şekil 1’de, bakteri kültürlerinde bakteriyofaj giderimi için tam prosedürün genel bir temsili gösterilmektedir. 1. Bakteriyofajlarla enfekte olmuş Salmonella kültürlerinin hazırlanması Bakteri kültürü hazırlamaNOT: Bu çalışmada Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium suşu ATCC 14028 opvAB::lacZ (SV8011)13 kullanılmıştır.-80 ° C’den alınan ve ilgilenilen S. enterica suşunu içeren şişeyi buz üzerine koyarak yavaşça çözdürün. Çözülmüş dimetil sülfoksit stoğundan S. enterica suşunu bir Lennox suyu (LB) plakasına (10 g/L tripton, 5 g/L NaCl, 5 g/L maya özütü ve 15 g/L agar, bkz . Plakayı 37 °C’de 24 saat inkübe edin. Bir aşılama iğnesi kullanarak, S. enterica plakasından bir koloniyi aktarın ve bir cam tüpte 5 mL sıvı LB’ye aşılayın. 37 °C’de 24 saat inkübe edin ve 200 rpm’de çalkalayarak havalandırın. Bakteriyofaj hazırlamaNOT: Bu protokolde Siphoviridae (Caudovirales takımı)14 familyasına ait bakteriyofaj 9NA kullanılmıştır. Özellikle, lipopolisakkaritin O-antijenini bir reseptör olarak kullanan diğer Salmonella enterica bakteriyofajları kullanılabilir.100 mL besin suyu (NB; 5 g/L pepton ve 3 g/L maya özütü), 2 mL 50x E tuzu (38.78 mM MgSO47 H2O, 520.5 mM Sitrik asit H2O, 2.87 M K2HPO4 susuz ve 829 mM NaNH4HPO44 H2O) ve 0.4 mL karışımına 0.1 mL konsantre bakteriyofaj lizat ekleyerek bakteriyofaj suyunu hazırlayın glikoz. Ters çevirerek iyice karıştırın.Bakteriyofaj konsantrasyonunun temsili bir örneği 109 PFU/mL (Plak Oluşturan Birimler/mL) olabilir, ancak benzer sonuçlarla daha düşük konsantrasyonlar kullanılabilir (bkz. Adım 1.2.3’ü izleyerek bakteriyofaj konsantrasyonunu tahmin edin. Aşağıda açıklanan adımları izleyerek lizat hazırlayın.S. enterica inokulumunu 5 mL LB (10 g/L tripton, 5 g/L NaCl ve 5 g/L maya özütü) içinde hazırlayın. 37 °C ve 200 rpm’de 24 saat inkübe edin. 4 mL bakteriyofaj suyunu 1 mL gece boyunca S. enterica kültürü ile karıştırın. Karışımı 37 °C ve 200 rpm’de 8 saat inkübe edin. Bakteriler ve bakteriyofajlar arasında ayrım yapmak için, karışımı 2,377 x g’da 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı bir cam tüpte geri kazanın, 800 μL kloroform ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve girdaplayın. Üst fazı yalnızca kloroform içeren bir karışım kullanıldığında aktardığınızdan emin olun.NOT: Prosedürün verimliliğini etkileyebilecek kalıntı kloroformun transferini önlemek önemlidir. Kloroform basamağı, salınan fajları maksimize etmenin bir yolu olarak hem izolasyon hem de yayılma protokollerinde yaygındır. Bununla birlikte, kloroform bazı fajları etkisiz hale getirebilir veya enfektiviteleriniyok edebilir 15. Bu nedenle, bu adım sadece kloroforma dirençli fajlar için geçerlidir. Lizatları oda sıcaklığında 2 saat koruyun ve ardından 4 °C’de saklayın. Hazırlanan lizatta bulunan bakteriyofaj sayısını/mL başına PFU sayısını ölçmek için lizatı titre edin. Bunu yapmak için, aşağıda açıklanan kaplama tekniğini uygulayın.S. enterica için 5 mL LB aşı hazırlayın. 37 °C’de 24 saat inkübe edin ve 200 rpm’de çalkalayarak havalandırın. Sayılabilir bir PFU / mL sayısına ulaşmak için lizatın LB’ye seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Gerekli seyreltme faktörlerini belirlemek için, konsantre olan ilk bakteriyofaj lizatını tanımlayın. Yaklaşık 109 PFU/mL’de bakteriyofaj konsantrasyonunun temsili bir örneği için, sayılabilir sayıda plak ile sonuçlanan seyreltme faktörleri 10 6-1010 arasındadır. 100 μL uygun lizat seyreltmesi ve 60 μL gece boyunca S. enterica kültürü ekleyin. bir gün önce hazırlanan 5 mL LB yumuşak agar’a, sıvı LB ve LB-agar’ın 1: 1 oranında karıştırılması ve katılaşmayı önlemek için 56 ° C’de tutulmasıyla hazırlanır. Kabarcıklardan kaçınarak dikkatlice karıştırın. Her karışımı bir LB tabağının üstüne dökün ve ortam katılaşana kadar tezgahta tutun. Plakaları 37 °C’de 24 saat inkübe edin. Her plakadaki plak sayısını sayın. PFU/mL sayısını belirlemek için, her bir plakanın plak sayısını seyreltme faktörü (FD) ile çarpın. Etkili faj enfeksiyonu sağlamak için 109-10 12 PFU/mL gereklidir.PFU/mL= Hayır. plakadaki plaklar x FD Salmonella kültürlerinin bakteriyofajlarla enfeksiyonuBir gece boyunca seyreltin S. enterica 5 mL LB nihai hacminde 1:100’e kadar ve 0.1 mL lizat ekleyin (10 9-1012 PFU / mL’de konsantre edilmiştir). 37 °C ve 200 rpm’de 24 saat inkübe edin. Plaka tahlilinde faj titresinin PFU olarak belirlenmesiEnfekte kültürdeki bakteriyofajların sayısını ölçmek için, faj titresini aşağıda açıklandığı gibi PFU/mL olarak belirlemek için plaka testleri yapın.Kültürün 1 mL’sini bir tüpe aktarın. 17.115 x g’da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni etiketli bir şişeye dökün. Çözeltideki bakteri kalıntılarını gidermek için şişeye ve girdaba 100 μL kloroform ekleyin. Adım 1.2.3’ü izleyin. 2. Enfekte Salmonella enterica kültürlerinden bakteriyofaj giderimi (bkz. Şekil 2) NOT: Bakteriyofaj giderme işlemini izlemek için, titrasyon için temizleme protokolü boyunca farklı alikotlar alınır. Toplamda, PFU/mL sayısının tamamen ortadan kaldırılana kadar temizleme işlemi boyunca azaldığını doğrulamak için sekiz alikot vardır. Süspansiyonda bakteriyofajın uzaklaştırılmasıFaj içeren bakteri kültürünü, 50 mL’lik bir konik santrifüj tüpünde 5 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB’de 1:100’e seyreltin. Titrasyon noktası 1: Bu, titrasyon için ilk alikottur (başlangıç enfekte Salmonella kültürü). Süspansiyonu 10 dakika boyunca 2,377 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. Pipet kullanmayın; Tüpü dökün. Hücrelerin varlığından emin olmak için konik santrifüj tüpünün altında bir miktar hacim bırakmaya çalışın. Bakteri hücrelerini 10 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB ortamı ile yıkayın. Santrifüjleme ve yıkama adımlarını 3 kez tekrarlayın. Peleti 5 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB’de yeniden süspanse edin. Titrasyon noktası 2: Bu, titrasyon için ikinci alikottur. Yukarıdaki bakteriyel süspansiyonun 50 μL’sini bir vakum filtreleme sistemi kullanarak steril bir 0.45 μm filtreden ( Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın. Filtreyi 100 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB ile durulayın.NOT: Bakteriyofaj 9NA’nın kafa boyutu 0.067 μm’dir. Buna karşılık, Salmonella 2-5 μm uzunluğunda ve 0,5-1,5 μm genişliğindedir. Bu nedenle, 0.45 μm’lik membranlar kullanılırsa, çoğu bakteri 0.45 μm’den büyük oldukları için geçemezken, çoğu faj 0.45 μm’lik filtre gözeneklerinden geçecektir. Salmonella hücrelerinin içinde bulunan bakteriyofajın uzaklaştırılmasıBakteri hücrelerinden faj salınımını kolaylaştırmak için, hücreleri içeren 0.45 μm’lik filtreyi, sistemi sökmeden inkübatörün içinde 37 ° C’de 2 saat inkübe edin.NOT: Bu inkübasyon adımı, enfekte olmuş bakterilerin parçalanmasını ve hücre içi fajların filtreye salınmasını teşvik etmek için gereklidir. 0,45 μm filtreyi bir vakum filtreleme sistemi kullanarak yıkayın ve filtreyi 100 mL 0,22 μm filtrelenmiş LB ile durulayın. Filtreden bakteri hücrelerini 2 mL 2x LB (20 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 10 g/L maya özütü; Malzeme Tablosuna bakınız) içinde geri kazanın. Bunu yapmak için, 0,45 μm filtreyi steril forseps kullanarak bir şişeye aktarın. Ardından, filtrenin üzerine 2 mL 2x LB ekleyin ve hücreleri filtreden ayırmak için birkaç kez pipetleyin. Bu süspansiyonun 1 mL’sini 10.354 x g’da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve bakteri hücrelerini 1 mL filtrelenmiş LB ortamı ile 3x yıkayın. Hücreleri 1 mL 2x LB içinde yeniden süspanse edin. Titrasyon noktası 3: Bu, titrasyon için üçüncü alikottur.NOT: Daha konsantre bir LB (2x LB) kullanılması şiddetle tavsiye edilir, çünkü aşağıda açıklandığı gibi ticari lipopolisakkarit (LPS) eklenecektir ve bu LPS suda çözünür, böylece ortam seyreltilir. Bakteri hücrelerinden salınan bakteriyofajları aşağıda tarif edildiği gibi ticari lipopolisakkarit ile kandırarak yeniden enfeksiyonu önleyin.Ticari bir S. enterica lipopolisakkarit varlığında 20 μL bakteriyel süspansiyonu inkübe edin (LPS; Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB’de 3.75 mg / mL’lik bir nihai konsantrasyona kadar 37 ° C’de 2 saat boyunca 200 rpm’de çalkalanarak.NOT: Hücrelerden ortama salınan fajlar, bakteriyel LPS yerine ticari S. enterica LPS’ye bağlanabilir. 2 saatlik inkübasyondan sonra, 1 mL kültürü bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu 10.354 x g’da 2 dakika santrifüjleyin.Titrasyon noktası 4: Süpernatanı titrasyon için dördüncü alikot olarak kullanın. Pelet 3x’i 1 mL filtrelenmiş LB ortamı ile yıkayın. Yıkadıktan sonra, peleti 1 mL 2x LB içinde yeniden süspanse edin. Bu karışımın 20 μL’sini 1 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB içinde 0.8 mg / mL ticari LPS ile 37 ° C’de 2 saat boyunca 200 rpm’de çalkalayarak inkübe edin. Titrasyon noktası 5: Beşinci titrasyon için bakteri süspansiyonunun geri kalanını kullanın. 2 saatlik inkübasyondan sonra, 1 mL kültürü bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10.354 x g’da 2 dakika santrifüjleme ile peletleyin. Titrasyon noktası 6: Süpernatanı yeni bir şişeye dökerek süpernatanı titrasyon için altıncı alikot olarak kullanın. Bakteri hücrelerini 3 kez filtrelenmiş LB ile yıkayın. Yıkadıktan sonra, toplanan hücreleri 1 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB içinde yeniden süspanse edin. Bir vakum filtrasyon sistemi kullanarak 1 mL bakteri süspansiyonunu steril 0.45 μm filtreden geçirin. Filtreyi 100 mL 0.22 μm filtrelenmiş LB kullanarak durulayın. 0.45 μm filtreden hücreleri 2 mL 2x LB ortamında kurtarın. Bu amaçla, 0,45 μm’lik filtreyi steril forseps kullanarak bir şişeye aktarın. Ardından, filtrenin üzerine 2 mL 2x LB ekleyin ve hücreleri filtreden serbest bırakmayı denemek için birkaç kez pipetleyin. 10.354 x g’da 2 dakika santrifüjleme ile 1 mL hücre peletleyin. 3x’i 0,22 μm filtrelenmiş LB ile yıkayın. Yıkadıktan sonra, toplanan hücreleri 1 mL 2x LB içinde yeniden süspanse edin. Titrasyon noktası 7: Bu, titrasyon için yedinci alikottur. Bu alikot, bakteri kültürlerinde fajların uzaklaştırılmasının etkinliği hakkında bilgi verecektir. 3. Bakteriyofaj gideriminden sonra bakteriyofaj içermeyen Salmonella kültürünün hazırlanması Faj içermeyen aşıyı hazırlayın. Bakteriyel süspansiyondan 100 μL hücreyi, 0.45 mg / mL LPS içeren 900 μL LB’ye ekleyin. 37 °C’de 24 saat inkübe edin ve 200 rpm’de çalkalayın. Titrasyon noktası 8: Titrasyon için sekizinci alikotu hazırlayın (son potansiyel enfekte olmamış kültür). Bu nokta, faj yeniden enfeksiyonunun olmadığını doğrulamak içindir.