JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Hepatosellüler Karsinomun Mikroçevresindeki Mast Hücreleri Olumlu Prognoz Sağlar: QuPath Görüntü Analiz Yazılımı Kullanılarak Retrospektif Bir Çalışma

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66743
, , , , , , , , , ,
1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine,Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 5Sikl’s Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen,Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology,German Cancer Research Center

Summary

Rezeksiyon sonrası hepatosellüler karsinomun iç kenarında ve peritümör bölgelerinde mast hücrelerinin varlığı olumlu bir prognoz sağlar. Bu çalışma, QuPath görüntü analiz yazılımını dijital patolojide tekrarlanabilirlik, tutarlılık ve doğruluk ihtiyacını karşılayabilecek umut verici bir platform olarak onaylamaktadır.

Abstract

Hepatoselüler karsinom (HCC) içindeki bağışıklık hücrelerinin yerinde tespiti ile sağlanan içgörüler, hasta sonuçları hakkında bilgi sunabilir. Tümör dokuları içindeki bağışıklık hücrelerinin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu araştıran çalışmalar, tümör bölgeleri için kesin açıklama eksikliği ve mikroskobik görüş alanlarının rastgele seçimi dahil olmak üzere çeşitli zorluklarla ilişkilidir. QuPath, tam slayt görüntü (WSI) analizinde dijital patolojiye yönelik artan ihtiyacı karşılayabilecek açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir yazılımdır.

CD1a+ immatür dendritik hücreler (iDC’ler), CD117+ mast hücreleri ve NKp46+ doğal öldürücü hücreler (NK’ler) hücreleri tarafından HCC ve komşu dokuların infiltrasyonu, küratif rezeksiyon uygulanan HCC’li 67 hastanın temsili örneklerinde immünohistokimyasal olarak değerlendirildi. Pozitif boyanmış hücrelerin alan fraksiyonu (AF), tümör merkezinde (TC), iç kenarda (IM), dış kenarda (OM) ve peritümör (PT) alanında QuPath kullanılarak WSI’larda otomatik olarak değerlendirildi. İmmün hücrelerin prognostik önemi, nüks süresi (TTR), hastalıksız sağkalım (DFS) ve genel sağkalım (OS) için değerlendirildi.

Mast hücrelerinin AF’si, NK’lerin AF’sinden önemli ölçüde daha yüksekti ve iDC’lerin AF’si, ilgilenilen her bölgedeki NK’lere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü. IM ve PT alanlarındaki mast hücrelerinin yüksek AF’leri daha uzun DFS ile ilişkilendirildi. Ek olarak, IM’deki mast hücrelerinin yüksek AF’si daha uzun OS ile ilişkilendirildi.

Bu yazılımı kullanan bilgisayar destekli analiz, rezeksiyon sonrası HCC’nin farklı bölgelerindeki tümör infiltre eden immün hücreler (iDC’ler, mast hücreleri ve NK’ler) için prognostik bilgi elde etmek için uygun bir araçtır. Mast hücreleri, tüm ilgi bölgelerinde (ROI’ler) en yüksek AF’yi gösterdi. Peritümör ve İM’deki mast hücreleri prognostik açıdan pozitif anlamlılık gösterdi.

Introduction

Tümöre sızan bağışıklık hücrelerinin mekansal organizasyonu ve bolluğunun, hepatoselüler karsinom (HCC)dahil olmak üzere farklı kanserlerde sağkalımı etkilediği kanıtlanmıştır 1,2,3,4. Kanserlerde tümör infiltre yapan lenfositlerin prognostik önemi ilk olarak hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış kesitlerdegösterilmiştir 5,6. Daha sonra, Galon ve ark. tarafından immünohistokimya (IHC) kullanılarak yapılan öncü bir çalışma, kolon kanseri dokusundaki CD3+ ve CD8+ T hücrelerinin yoğunluklarının prognoz4 ile ilişkisini göstermiştir.

IHC, klinik sonuçlarla daha fazla ilişki için tümör dokusu içindeki bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için altın bir standarttır7. IHC, düşük maliyet, yaygın kullanılabilirlik ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku ile uyumluluk gibi çeşitli avantajlar sunar8. Bununla birlikte, IHC lekeli bağışıklık hücrelerinin doğru değerlendirilmesi büyük bir zorluktur. Seçilen mikroskobik görüş alanlarında geleneksel skorlama zaman alıcıdır ve artık aday biyobelirteç seçimi için gerekli olan yüksek kaliteli, tekrarlanabilir, objektif analizi ve güvenilir klinik korelasyonu sağlamak için yeterli değildir9. Tam slayt taramaları, tüm görüntü olarak veya10 alt örneklemeden sonra değerlendirilebilir.

Doku örneklerinde bağışıklık hücrelerinin bolluğunun bilgisayarlı kantitatif değerlendirmesi, pratik, doğru, güvenilir ve klinik olarak ilgili veriler sağlayabilir11. QuPath, IHC lekeli slaytların dijital görüntü analizini sağlayan ve tek tek örneklerden elde edilen bilgi miktarını en üst düzeye çıkaran ücretsiz, açık kaynaklı bir yazılımdır12.

Olgunlaşmamış dendritik hücreler (iDC’ler), doğal öldürücü (NK) hücreler ve mast hücreleri anti-tümör immün yanıtlarında yer aldığından ve hastaların sonuçlarıyla ilişkili olduğu gösterildiğinden 13,14,15, burada FFPE HCC dokusundaki mekansal dağılımlarını değerlendirmek ve prognostik etkilerini araştırmak için adım adım bir protokol sunuyoruz. CD1a esas olarak, yoğunluğu çeşitli insan tümörlerinde klinik sonuçlarla ilişkilendirilen olgunlaşmamış dendritik hücrelerin zarı üzerinde eksprese edilir16,17. Mast hücreleri, tümör mikroçevresi (TME) içinde protümör veya anti-tümör rolü oynayabilir18. Anjiyogenezi destekleyebilir ve metastazı kolaylaştırabilirler19. Tersine, mast hücrelerinin IL-420 üretimi yoluyla tümör hücresi apoptozuna aracılık edebileceği bildirilmiştir. Anti-CD117 boyama, tümör dokusu21 içindeki mast hücrelerini görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılır. NK hücrelerinin, kanser hücrelerini23 öldürerek HCC22’nin gözetimine ve kontrolüne katkıda bulunduğu düşünülmektedir. NK tarafından NKp46 ekspresyonu, anti-tümör aktiviteleri için çok önemli bir parametredir24. Bununla birlikte, NKp46 + NK hücreleri, HCC hastalarında tümör çapı ile pozitif korelasyon gösterdi25. Buna rağmen, hasta sağkalımı ile korelasyonları hakkında çok az şey bilinmektedir.

Bu çalışmada, HCC’nin farklı bölgelerinde CD1a+ iDC’ler, CD117+ mast hücreleri ve NKp46+ NK hücrelerinin bolluğunu kantitatif olarak değerlendirmeyi ve prognostik önemlerini vurgulamayı amaçladık. 1997-2019 yılları arasında Pilsen Üniversitesi Hastanesi’nde küratif amaçlı karaciğer rezeksiyonu yapılan, BCLC kılavuzlarına göre rezeksiyon için uygun olan, patolojik olarak doğrulanmış evre I-IV HCC’li toplam 70 ardışık hasta mevcut retrospektif çalışmaya dahil edildi. Hastaların patoloji raporları incelendi. Bu çalışmaya dahil edilen hastaların hiçbirinde uzak metastaz yoktu ve cerrahi öncesi kemoterapi veya radyoterapi gibi neoadjuvan tedavi almamıştı. Düşük kaliteli histolojik örneği olan toplam 3 hasta çalışma dışı bırakıldı ve kalan 67 hasta çalışmaya dahil edildi (Tablo 1).

Protocol

Bu protokol, Helsinki Bildirgesi’nde (2013 versiyonu) belirtilen etik standartlara uygun olarak yürütülen bir çalışmanın parçasıydı; Tıp Fakültesi ve Pilsen Üniversite Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (118/2021, 11 Mart 2021). Şekil 1 , kullanılan yöntemlerin bir özetini göstermektedir. 1. FFPE doku bloklarının seçimi Tedavi eden doktorların veya patologların yardımıyla hasta dosyalarından FFPE blok tanımlayıcılarını alın. FFPE bloklarını yerel patoloji arşivinden isteyin. Her hasta için, tercihen çevredeki peritümör alanı ve tümör olmayan karaciğer ile canlı tümör dokusu içeren 2-3 FFPE bloğu seçin.NOT: Bu seçim için uzman bir patologdan görüş alınması tavsiye edilir. Tümör olmayan karaciğerin histolojik değerlendirmesi, anamnestik, klinik ve laboratuvar verileri ile birlikte HCC’nin altta yatan etiyolojisini tanımlamak için kullanıldı. 2. FFPE dokusunun deparafinizasyonu ve rehidrasyonu Bir mikrotom üzerindeki FFPE doku bloklarının her birinden 4 μm kalınlığında bir veya iki doku kesiti kesin.NOT: Bölümlerin kalınlığı, gözle görülür lekelenme etkisi olmaksızın 3 μm ile 5 μm arasında olabilir; Bununla birlikte, 4 μm’lik bir kalınlık standarttır. Kırışıklıkları gidermek için bölümleri bir su banyosuna (42°C) yerleştirin. Slaytları alıp pozitif yüklü bir cam mikroskobik slayt üzerine yerleştirerek monte edin. Ardından, slaytları 24 saat boyunca ortam sıcaklığında (AT) kurutmak için uygulayın. Slaytları 1 saat boyunca bir termostata (56 °C) yerleştirin. Mum giderme çözeltisi-1 (72 ° C’de 30 sn), mum giderme çözeltisi-2 (72 ° C’de 10 s), mum giderme çözeltisi-3 (AT’de 10 s), etanol% 96 -1 (10 s), etanol% 96-2 (10 s) ve etanol% 96-3 (10 s). Yıkama solüsyonu-1 (10 s, AT), yıkama solüsyonu-2 (10 s, AT) ve yıkama solüsyonu-3 (5 dk, AT) içindeki bölümleri yeniden sulandırmak için bir otomatik boyayıcı kullanın. 3. IHC’nin tam otomatik bir boyayıcıda gerçekleştirilmesi NOT: IHC, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirilir. Adımlar aşağıda kısaca açıklanmıştır. Antijen elde etme yöntemiYüksek pH’lı bir ER çözeltisinde (örneğin, Tris-EDTA) ısıya bağlı epitop geri alma (ER) prosedürünü kullanarak antijen alın: ER çözeltisi-1 (10 s, AT), ER çözeltisi-2 (10 s, AT), ER çözeltisi-3 (100 ° C’de 20 dakika), ER çözeltisi-4 (12 dakika, AT). Slaytı 3x (her biri 30 s) ve 1x (3 dakika) boyunca bir yıkama solüsyonunda durulayın. AT’de 5 dakika boyunca Peroksit Blok çözeltisini kullanarak endojen peroksidazı bloke edin. 3 kez (her biri 30 saniye) bir yıkama solüsyonunda durulayın. NKp46 için bir protein bloğu ile antikorların spesifik olmayan bağlanmasını sadece 30 dakika boyunca bloke edin. Primer antikorlarla bağlanma: AT’de 15 dakika boyunca primer antikorlarla inkübe edin, ardından 3x (her biri 30 s) bir yıkama solüsyonu ile durulayın. İkincil antikor bağlanması için aşağıda açıklanan adımları izleyin.AT’de 8 dakika boyunca yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları ile inkübe edin. 2 kez (her biri 2 dakika) ve 1 kez deiyonize su ile yıkama solüsyonu ile durulayın. Slaytları diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ile durulayarak ve ardından AT’de 10 dakika boyunca DAB çözeltisi ile inkübe ederek reaksiyonu görselleştirin. Deiyonize su ile 3x (30 sn) durulayın. Bölümleri Mayer’in hematoksilen ile boyayın. 1x (30 sn) deiyonize su, 1x (30 s) yıkama solüsyonu ve 1x (30 s) deiyonize su ile durulayın. Bölümleri etanol (2 dakika), etanol (2 dakika), etanol -1 (3 dakika), etanol -2 (3 dakika), etanol 0 (3 dakika), ksilen-1 (4 dakika), ksilen-2 (4 dakika) ve ksilen-3 (4 dakika). Kızaklar üzerindeki bölümleri bir montaj ortamına monte etmek için tam otomatik bir cam terlik kullanın.NOT: Negatif ve pozitif (bademcikler) doku kontrol örnekleri kullanıldı. 4. Tam slayt taramaları elde etme 20x objektif ve tam slayt tarayıcıya odaklanmanın orta-yüksek yoğunluğunu kullanarak lekeli slaytları tarayın. 5. Yazılımı kullanarak IHC analizi Yazılımdaki IHC görüntüleri için bir proje oluşturun.QuPath-0.4.3 (veya üstü) indirin ve açın.exe Uygun bir adla yeni bir klasör oluşturun. Yazılımın sol üst köşesindeki Proje Oluştur düğmesine tıklayın ve yeni oluşturulan klasörü seçin. Taranan görüntüleri yazılım penceresine sürükleyin. Otomatik olarak yeni bir pencere açıldığında, Görüntü Türünü H-DAB > Ayarla’yı seçin ve İçe Aktar’a tıklayın (Şekil 2). Menünün sol penceresindeki resim listesine bakın; Görüntüyü açmak için çift tıklayın. Üstteki ana menüden seçin Dosya Görüntüleri bir proje olarak kaydetmek için.NOT: Yazılım, birçok tam slayt formatı da dahil olmak üzere çok çeşitli görüntü formatlarını işleyebilir. Ancak, ham verilerin ve ilişkili meta verilerin kaybını önlemek için tiff formatı tercih edilir. İlgilenilen bölgelere açıklama eklemeTümör alanına açıklama eklemek için üst kısımdaki ana menüden Fırça aracını veya Değnek aracını seçin. Tümörün süreksiz bölgeleri için 5.2.1.1-5.2.1.3 adımlarını izleyin.Bunlara ayrı ayrı açıklama ekleyin. Tüm tümör bölgelerini seçerken Ctrl tuşunu basılı tutun Sağ tıklayın ve Birden Çok Düzenle > Seçileni Birleştir’i seçin. Tümör ek açıklamasının seçili olduğundan emin olun (kenarlıklar sarı renktedir). Ana menüde Otomatikleştir’e tıklayın ve Komut Dosyası Düzenleyicisini Göster’i seçin. Ek Dosya 1’de veya https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls’da bulunan komut dosyasını kopyalayın ve Komut Dosyası Düzenleyicisi’ne yapıştırın, ardından Çalıştır’ı tıklayın. ROI’ler: tümör merkezi (TC), iç kenar (IM), dış kenar (OM) ve peritümör alanı (PT) otomatik olarak oluşturulacak ve etiketlenecektir. İlgi alanları oluşturmanın alternatif bir yolu için 5.2.5.1-5.2.5.5 adımlarını izleyin.Kötü huylu hücre yuvalarını ve bitişik tümör olmayan dokuyu ayıran bir kenarlık çizmek için üstteki ana menüden Çoklu Çizgi aracını seçin. Ortaya çıkan kenarlığı seçin. Üst kısımdaki ana menüden Nesneler > Açıklama > Genişletme Yarıçapı için 500 μm’ye > Genişletme Yarıçapı > Satır Kapağı için Düz olanı seçin. İçini Kaldır’ı etkinleştirin ve Üst öğeye sınırla’yı etkinleştirin. Ortaya çıkan ek açıklamayı sağ tıklayın, Tek Düzenle > Böl. İki ayrı ek açıklama, sınırın her iki tarafında 500 μm genişliğinde bölgeler olarak otomatik olarak genişletilecektir. Soldaki listede ek açıklamaya sağ tıklayarak, Özellikleri Ayarla’yı seçerek ve adı girerek açıklamalı bölgeleri IM ve OM için uygun şekilde adlandırın. TC, kalan tümör alanını temsil eder. Aynı prosedürü kullanarak OM’ye bitişik 500 μm genişliğindeki PT alanını genişletin.NOT: Açıklamalı slaytlar ve QuPath AF algılamaları uzman bir histopatolog tarafından incelenmiştir. Piksel sınıflandırmasının optimizasyonuAna menüden Dikdörtgen aracını seçin. Ardından, ayırt edilecek tüm piksel türlerini içeren bir bölgeye açıklama ekleyin (örneğin, hematoksilen, DAB ve arka plan). Ana menüden Analiz Et > Ön İşleme > Leke Vektörünü Tahmin Et’i seçin. Görsel Leke Düzenleyici penceresi otomatik olarak açıldığında, Otomatik > Tamam’ı seçin ve leke vektörünün adı olarak tahmini H-DAB’ı ayarlayın. Alternatif bir yöntem için 5.3.4.1-5.3.4.3 adımlarını izleyin.Ana menüden Dikdörtgen aracını seçin ve hematoksilen ile boyanmış tipik bir çekirdeğin küçük bir bölgesine açıklama ekleyin. Soldaki menüden Görüntü’yü seçin ve Leke 1 > Evet’e çift tıklayın. Ana menüden Dikdörtgen aracını seçin ve DAB ile küçük bir pozitif boyama bölgesine açıklama ekleyin. Soldaki menüden Görüntü’yü seçin ve Leke 2 > Evet’e çift tıklayın. Piksel Sınıflandırma seçeneği kullanılarak pozitif bağışıklık hücrelerinin alan fraksiyonunun değerlendirilmesi.Ana menüden Sınıflandır > Piksel sınıflandırması’na > Eşitleyici oluştur’a tıklayın. Çözünürlük > kanalı için Yüksek’i seçin : DAB > Ön filtre: Gauss > Sigma: 0,5 > (Şekil 3) Eşik: (0,2-0,3) > Eşiğin Üstünde: Pozitif > Eşiğin altında: Negatif. Bölge için Herhangi Bir Ek Açıklama’yı seçin, Sınıflandırıcı için bir ad yazın > Kaydet > Ölçü > Tamam’ı seçin. DAB pozitif hücreler kırmızı renge dönüştürülecektir (Şekil 4). Sonuçları sol taraftaki menüden bir e-tabloya kopyalayın. Alternatif olarak, üst ana menüde Ölçü’yü açın, Ek Açıklama Ölçümlerini Göster > Panoya Kopyala’yı seçin ve sonuçları bir elektronik tabloya yapıştırın. Görüntüyü kapatmak için Çoklu Görünüm’> sağ tıklayın > Görüntüleyiciyi Kapat’ı tıklatın.NOT: Nicelemeden önce, herhangi bir artefakt elimine edildi. Eşik, zayıf bir spesifik pozitif boyama olan her vaka için ayarlandı. Ek açıklamaların ve piksel sınıflandırmasının doğruluğu önce çapraz kontrol edildi ve ardından kıdemli bir histopatolog tarafından gözden geçirildi. Tüm analizler kör bir şekilde yapıldı. Yazılımı kullanarak IHC analizi hakkında daha fazla bilgiyi https://forum.image.sc/tag/QP adresinde bulabilirsiniz. 6. İstatistiksel yöntemler ve veri analizi Çalışma uç noktaları nüks süresi (TTR), hastalıksız sağkalım (DFS) ve genel sağkalım (OS) idi. Nüks veya ölüm olmayan hastalar son takiplerinde sansürlendi.NOT: Normal olmayan sürekli dağılım gösteren veriler medyan (min-maks) olarak ifade edilir. Oranlar ham veri (yüzde) olarak ifade edilir. Farklı ilgi bölgelerindeki (ROI’ler) immün hücrelerin alan fraksiyonları Friedman ANOVA ile karşılaştırıldı, ardından Bonferroni düzeltmesi ile Wilcoxon eşleşen çiftler testi yapıldı. Değişkenlerin çoğunun parametrik olmayan dağılımı nedeniyle, sıralı veya nicel değişken çiftleri arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Spearman korelasyonu kullanıldı. Uç noktalar için bireysel prediktörlerin prognostik değerini belirlemek için, tek değişkenli ve ardından çok değişkenli Cox regresyon analizi yapıldı. Tehlike oranları (HR) hesaplandı. HR, düşük grup için 1’e kıyasla birleşik orta yüksek grup için göreceli riski gösteriyordu. Tüm sağkalım tahminleri Kaplan-Meier yöntemi ile hesaplandı ve log-rank testi ile gruplar arasında karşılaştırıldı. İstatistiksel analizler için GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) kullanıldı. 2 taraflı p değerinin 0.05 < istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Representative Results

Hastaların demografik özellikleri ve klinik özellikleri Tablo 1’de sunulmuştur. Hastaların ortanca yaşı 69 idi ve çoğu erkekti (.6). HKK etiyolojisi ile ilgili olarak, kronik viral olmayan hepatit en sık görülen arka plan hastalığı olup, non-alkolik steatohepatit (NASH) prevalansı (.9) idi. Sadece 15 hastada (.4) arka plan hastalığı siroz vardı. Hastaların çoğunluğunda (.7) TNM evre I vardı. Daha detaylı klinik ve patolojik bulgular daha önce yayınlanmışçalışmamızda tanımlanmıştır 2,26. Sonuç -larıSon kontrolde 29 (.8) hastada tümör nüksü gözlenirken, bunların .7’sinde lokal nüks görüldü ve 38 (.7) hasta kaybedildi. Ameliyattan 5 yıl sonra DFS oranı .2, OS oranı .4 ve nükssüz oran (RFP) .7 idi (Tablo 2). İmmün hücrelerin farklı ilgi alanlarındaki dağılımıCD117 proteini ağırlıklı olarak yuvarlak hücrelerin sitoplazmik zarında bulundu (Şekil 5A). TC ve IM’de çoğunlukla stroma ve perivasküler boşlukta lokalizeydiler. OM ve PT alanlarında, CD117+ hücreleri tümör kapsülünde ve perivasküler boşlukta gözlendi. NKp46 proteini çoğunlukla, TC ve IM’deki sinüzoid benzeri boşlukların içinde bulunan ve aynı zamanda stroma ile ilişkili olan yuvarlak hücrelerin sitoplazmik zarında bulundu (Şekil 5B). OM ve PT alanında, NKp46+ hücreleri, tümör yuvalarının etrafındaki kapsüllerde ve portal yolların stromasında gözlendi. CD1a-proteini, TC ve IM’de, çoğunlukla stromadaki yuvarlak hücrelerin sitoplazmik zarında (dağınık veya agregalar halinde), sinüzoid benzeri boşlukların içinde ve sınırları boyunca bulundu (Şekil 5C). PT alanında, sinüsoidlerin içinde ve sınırları boyunca ve portal traktlarda biliyer epitel içinde CD1a+ DC izlendi. Mast hücrelerinin AF’si, NKp46+ hücrelerinin AF’sinden anlamlı derecede yüksekti (p < 0.001) (Şekil 6). Her ROI’deki CD1a+ iDC’ler, mast hücreleri ve NK hücrelerine kıyasla en düşük AF’yi gösterdi (p < 0.001) (Şekil 6). TC veya IM’deki CD117+ ve NKp46+ hücrelerinin AF’si, PT alanı ve OM’dakilerden anlamlı olarak daha küçüktü (p < 0.001) (Şekil 6). CD1a + hücreleri için, AF bölgeler arasında önemli ölçüde farklılık göstermedi. Tüm ROI’ler arasındaki bireysel bağışıklık hücreleri için önemli ilişkiler Tablo 3’te gösterilmektedir. Şekil 7 , farklı bölgelerdeki farklı bağışıklık hücreleri arasındaki önemli ilişkiler için ısı haritasını göstermektedir. TC’deki CD117 + mast hücrelerinin AF’si, TC ve IM’deki CD1a’nın AF’si ile önemli ölçüde korelasyon gösterdi. Klinik ve patolojik değişkenlerin prognostik değeriKlinik ve patolojik değişkenler arasında sadece genç yaş daha yüksek nüks riski ile ilişkiliydi (HR = 0.96, CI: 0.93-0.99, p = 0.007), oysa DFS ve OS ile ilişkili hiçbir değişken yoktu (Tablo 4). Sızan immün hücrelerin prognostik değerleriİM’de CD117+ mast hücrelerinin yüksek AF’si daha uzun DFS (HR = 0.48, CI: 0.241 – 0.935, p = 0.031) ve OS (HR = 0.34, CI: 0.167 – 0.703, p = 0.004) ile ilişkilendirildi (Şekil 8, Tablo 5). Ek olarak, PT alanındaki CD117+ mast hücrelerinin yüksek AF’si daha uzun DFS ile ilişkilendirildi (HR = 0.48, CI: 0.247 – 0.945, p = 0.034) (Şekil 8, Tablo 5). Buna karşılık, iDC ve NK hücrelerinin AF’leri sonuçların hiçbiri ile ilişkili değildi. İç kenardaki CD117 + mast hücreleri, TNM evresi için ayarlamadan sonra DFS (HR = 0.46, CI: 0.23-0.91, p = 0.027) ve OS (HR = 0.33, CI: 0.16-0.68, p = 0.003) ile anlamlı ilişkileri korudu (Tablo 6). PT bölgesindeki mast hücrelerine gelince, DFS ile ilişki de anlamlı kalmıştır (HR = 0.47, CI: 0.24-0.93, p = 0.029) (Tablo 6). Şekil 1: Yöntemler için temsili şema. HCC’de mast hücrelerinin, dendritik hücrelerin ve doğal öldürücü hücrelerin prognostik rolünün tanımlanması için iş akışının şematik diyagramı. Kısaltmalar: FFPE, formalin ile sabitlenmiş parafine gömülü; H&E, Hematoksilen ve Eozin; ROI’ler, ilgi alanları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Yazılım penceresinin ekran görüntüsü. Görüntüleri yazılımdaki bir projeye aktarma adımını gösteren açıklayıcı bir ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Alan kesri seçeneğinin ekran görüntüsü. Pozitif boyamanın alan fraksiyonunu ölçmek için seçilen parametreleri gösteren yazılımdan bir ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Piksel sınıflandırma seçeneğinin ekran görüntüsü. Piksel sınıflandırmasından önce ve sonra DAB pozitif hücrelerini gösteren yazılımdan ekran görüntüsü. Kahverengimsi DAB boyama, piksel sınıflandırmasından sonra kırmızı renge dönüştürüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: HCC hastalarında doğuştan gelen immün hücrelerin temsili immün boyaması. HCC’nin TC (400x) ve TIM’inde (A) CD117 +, (B) NKp46 + ve (C) CD1a + hücrelerinin temsili immün boyama. Kısaltmalar: HCC, hepatosellüler karsinom; TC, tümör merkezi; TIM, tümör invaziv sınırı, iç kenar (IM) ve dış kenar (OM). Noktalı çizgi, tümör ile tümör olmayan doku arasındaki bir sınırı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: HCC hastalarında doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin alan fraksiyonunu tanımlayan istatistikler. HCC’nin TC, IM, OM ve PT alanlarındaki CD1a+ dendritik hücrelerin, CD117+ mast hücrelerinin ve NKp46+ NK hücrelerinin alan fraksiyonu için istatistikler. Siyah çizgiler medyandır. Karşılaştırmalar için Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler testi ve Bonferroni düzeltmesi kullanıldı. Kısaltmalar: HCC, hepatosellüler karsinom; TC, tümör merkezi; IM, iç kenar boşluğu; OM, dış kenar boşluğu; PT, peritümör alanı. : p <0.001 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Farklı ilgi bölgelerindeki mast hücrelerinin, DC’lerin ve NK’lerin alan fraksiyonları arasındaki önemli korelasyonların ısı haritası. TC, IM, OM ve PT’de CD117+ mast hücrelerinin, CD1a+ DC’lerin ve NKp46+NK’lerin alan fraksiyonları arasındaki önemli korelasyonların ısı haritası (Spearman ρ, p < 0.05). Kısaltmalar: TC, tümör merkezi; IM, iç kenar boşluğu; OM, dış kenar boşluğu; PT, peritümör alanı; DC, dendritik hücreler; NK, doğal öldürücü hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: HCC hastalarında tümör infiltre eden mast hücreleri için Kaplan-Meier DFS ve OS eğrileri. HCC’nin iç kenarındaki (A, C) ve PT (B) tümör infiltre eden mast hücrelerinin düşük ve yüksek AF’sine göre DFS ve OS’nin Kaplan-Meier analizi. Kısaltmalar: HCC, hepatosellüler karsinom; DFS, hastalıksız sağkalım; IM, iç invaziv; PT, peritümör alanı. Şekil, Ali ve ark.26’nın izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Kayıtlı hepatosellüler karsinom hastalarının klinik geçmişi. Kayıtlı hepatosellüler karsinom vakalarının klinik geçmişi. Kısaltmalar: NAFLD, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 2: Kaplan-Meier analizinde sonuçların tahmini olasılığı. Kaplan-Meier analizinde RFP, DFS ve OS’nin tahmini olasılığı. Kısaltmalar: RFP, tekrarlamayan oran; DFS, hastalıksız sağkalım; İşletim sistemi, genel sağkalım. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 3: Farklı ROI’lerde tümör infiltre eden mast hücrelerinin, dendritik hücrelerin ve doğal öldürücü hücrelerin alan fraksiyonu arasındaki korelasyon. Farklı ROI’lerde tümör infiltre eden mast hücrelerinin, dendritik hücrelerin ve doğal öldürücü hücrelerin alan fraksiyonu arasındaki Spearman korelasyonu (ρ), p < 0.038. Kısaltmalar: TC, tümör merkezi; IM, iç kenar boşluğu; OM, dış kenar boşluğu; PT, peritümör alanı; ROI'ler, ilgi alanları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 4: Nüks süresi (TTR), hastalıksız sağkalım (DFS) ve genel sağkalım (OS) ile ilişkili klinik ve patoloji değişkenlerinin tek değişkenli analizi. ” Hayır”, kadın cinsiyet veya “A” ikili değişkenler için referans kategorileriydi. Kalın değerler p < 0.05 düzeyinde istatistiksel anlamlılığı göstermektedir. Kısaltmalar: HR, tehlike oranı; CI, güven aralığı; TTR, tekrarlama zamanı; DFS, hastalıksız sağkalım. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 5: CD117+ mast hücrelerinin, CD1a+denderitik hücrelerin ve NKp46+doğal öldürücü hücrelerin alan fraksiyonunun, Cox regresyonu kullanılarak (67 HCC hastası) bireysel ilgilenilen bölge başına TTR, DFS ve OS ile ilişkisinin tek değişkenli analizi. Alan bölümü başına bağışıklık hücrelerinin alan fraksiyonu (mm2) persentillere dönüştürüldü ve daha sonra düşük (0-25 persentil) ve yüksek (25-100 persentil) olarak kategorize edildi. Tehlike oranları, düşük AF için 1 ile karşılaştırıldığında göreceli riski gösterir. Kalın değerler p < 0.05 düzeyinde istatistiksel anlamlılığı göstermektedir. Kısaltmalar: AF, alan kesri; DFS, hastalıksız sağkalım; İşletim sistemi, genel sağkalım; İK, tehlike oranı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 6: Hastalıksız sağkalım ve genel sağkalım ile ilişkili bireysel ROI başına CD117+ mast hücrelerinin alan fraksiyonu (çok değişkenli analiz). Cox regresyonu kullanılarak (67 HCC hastası) CD117+ mast hücrelerinin alan fraksiyonunun IM ve PT alanında DFS ve OS ile ilişkisinin çok değişkenli analizi. Alan bölümü başına bağışıklık hücrelerinin alan fraksiyonu (mm2) persentillere dönüştürüldü ve daha sonra düşük (0-24 persentil) ve yüksek (25-100 persentil) olarak kategorize edildi. Tehlike oranları, düşük AF için 1 ile karşılaştırıldığında göreceli riski gösterir. Kalın değerler p > 0.05 düzeyinde istatistiksel anlamlılığı göstermektedir. Kısaltmalar: AF, alan kesri; DFS, hastalıksız sağkalım; İşletim sistemi, genel sağkalım; İK, tehlike oranı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: ROI oluşturmak için komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

İmmüno-onkoloji alanı, TME’deki in situ immün organizasyonun izlenmesi yoluyla yeni kanser prognostik ve prediktif biyobelirteçler ekleyebilir. HCC’nin TME’sinde adaptif immün hücrelerin rolü hakkında daha önce yayınlanmış makalemiz, CD3 + ve CD8 + T hücrelerinin yanı sıra CD20 + B hücrelerinin nüks süresi 2 ile seçilen ROI’lerde pozitifprognostik ilişkilerini göstermiştir. Burada, HCC’nin birkaç farklı bölgesinde CD1a+ iDC’lerin, CD117+ mast hücrelerinin ve NKp46+ NK hücrelerinin bolluğunu değerlendirmek ve prognostik önemlerini değerlendirmek için görüntü analiz yazılımı QuPath kullanıldı. Bazı doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin düzensiz şekilleri nedeniyle, nicelikleri yanlış olabilir. Bu nedenle immün pozitif hücrelerin alan fraksiyonunun değerlendirilmesi en uygun seçenekti. Üç hücre tipi arasında, sadece CD117 + mast hücreleri önemli prognostik etki gösterdi: IM ve PT alanındaki mast hücrelerinin daha yüksek AF’si daha uzun sağkalım ile ilişkilendirildi.

Mast hücreleri, tüm ROI’lerde en bol olanıydı ve peritümör alanı ve iç kenardaki AF’lerinin daha iyi sağkalım ile ilişkisi, mast hücrelerinin anti-tümör rolünü yansıtmaktadır. Mast hücreleri, SCF veya CCL1518 gibi tümör hücresi tarafından salınan kemoatraktanlar tarafından TME’ye çekilebilir. Mast hücreleri, tümör hücrelerine27 doğrudan sitotoksisite veya tümör büyümesini inhibe edebilen proinflamatuar sitokinler salgılayarak18 anti-tümör yanıtını etkileyebilir. Artan mast hücre yoğunluğu, karaciğer nakli sonrası prostat kanseri28, mide kanseri27 ve HCC’nin29 nüksetmesine karşı koruyucuydu. 245 HCC hastasından oluşan daha geniş bir kohorttan oluşan kapsamlı bir araştırma, tümör örneklerinde daha belirgin mast hücre infiltrasyonu ile tümör rezeksiyonu sonrası daha uzun süreli sağkalım arasında pozitif bir korelasyon buldu30. Rohr-Udilova ve ark. çevredeki HCC dokusunda daha yüksek mast hücresi yoğunluklarının benzer sonuçlarını bildirmiştir; Bununla birlikte, sadece intratümör mast hücre yoğunluğu daha düşük bir nüks oranı ile ilişkilendirildi29.

Bu çalışmada, mast hücreleri sadece IM ve PT karaciğerde anti-tümör etkisi göstermiştir. Farklı tümörlerin TME’si, immün hücrelerin mekansal dağılımı ile ilgili olarak heterojendir31. TME’deki immün hücrelerin prognostik önemi, mekansal dağılımları ile de kritik bir şekilde ilişkilidir32,33. Tümör invaziv sınırını açıklamak için, farklı genişliklerde 4,34,35, iç ve dış kenar boşlukları, yine farklı genişliklerde36,37, PT 2,7 ile veya PT 2,7 olmadan farklı kenar boşlukları dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar önerilmiştir. Uluslararası İmmünoonkoloji Biyobelirteçleri Çalışma Grubu’nun tekrarlanabilir, standartlaştırılmış metodolojisini takip ettik ve invaziv sınırı, malign hücre yuvalarını konakçı dokudan ayıran ve merkezi tümörü kalan tümör alanı olarak temsil eden sınırda ortalanmış 1 mm’lik bir bölge olarak tanımladık38. Önceki çalışma, iç ve dış invaziv sınır2’nin sonuçlarında önemli farklılıklar olduğunu vurguladığından, bu bölgeler (her biri 500 μm genişliğinde) ayrı ayrı analiz edilmiştir. Peritümör alanının mekansal immün profilinin belirgin prediktif önemivardır 39,40 ve bu nedenle PT alanı da dahil edilmiştir.

TC, tümör sınırı ve PT karaciğerinin analizi, ilgili bölgelerde seçilen görüş alanlarını değerlendirme seçeneğinin aksine, WSI’lerde gerçekleştirildi. Tüm slayt görüntüleme, potansiyel olarak zengin bir veri kaynağıdır41. Alt örnekleme yapmadığımız için “gerçek beklenen değer” zaman açısından verimli bir şekilde elde edilmiştir10. Ek olarak, bu sistem mantıklıydı çünkü blok başına yalnızca 1 veya 2 slayt analiz edildi, bu da yama seçimi42’nin yanlılığından kaçınmamızı sağladı. Yavaş iş akışı, bağışıklık hücrelerinin2 miktarının belirlenmesi için stereoloji uygulandığında önceki çalışmada bize meydan okudu.

IHC, karaciğer dokusunda CD1a+ iDC’ler, NKp46+NK ve CD117+ mast hücre ekspresyonunun doğrudan lokalizasyonuna, dağılımlarının nicelleştirilmesine ve dolayısıyla kohortun alt sınıflandırmasına izin verir. IHC analizi, bu çalışmaya, sadece birkaç biyobelirteç pozitif hücremevcut olduğunda 43 ve immün hücrelerin histopatolojik özelliklere bölgesel reaksiyonunu yansıtmadığında44 yanlış negatif sonuçlara yol açabilen çözünmüş dokudaki biyokimyasal tahlillere göre önemli avantajlar sağlar. IHC ayrıca H & E lekeli bölümlerde analiz yerine tercih edilir. Kolorektal kanser ve küçük hücreli akciğer kanseri üzerine yapılan çalışmalar, H&E lekeli kesitlerin değerlendirilmesinin sağlam, kantitatif tümör-immün biyobelirteçler sağlayabileceğini göstermiştir 45,46,47; Bununla birlikte, belirli alt tiplerin gerçek varlığını yansıtmak için sınırlamalar hala mevcuttur.

Yüksek kaliteli doku kesitleri ve IHC boyama, doğru bir değerlendirme için bir ön koşuldur. Yüksek arka plan, kenar artefaktları ve spesifik ancak istenmeyen boyama (ör., karaciğer sinüzoidal boşluklarının endotel hücrelerinin anti-CD4 antikorları ile boyanması) tüm sonuçları bozabilir. Bir CD56 antikoru, mevcut çalışmada doğal öldürücü hücreleri tespit etmek için ilk seçenekti, ancak olgunlaşmamış safra kanallarında CD56 ekspresyonu nedeniyle NKp46 antikoru ile değiştirildi. FFPE bloklarında özgüllük, sağlam boyama deseni ve stabilite açısından en uygun işaretleyicinin seçimi, dikkate alınması gereken başka bir konuyu temsil eder. Örneğin, triptaz yerine CD117 seçildi, çünkü triptaz ekspresyonu güçlü bir şekilde aşağı regüle edilebilir, ayrıca CD117 eksprese etmeyen hücreler mast hücreleri değildir48.

QuPath, ROI’nin sınırlarını dışarıdan yumuşatma ve ROI’nin bir parçası olmaması gereken artefaktları, büyük damarları, nekrotik dokuları, spesifik olmayan boyamaları, arka planı ve eritrosit agregasyonunu kaldırma seçeneği sunar. Operatörün ROI’yi seçmesi ve bu eserlere açıklama eklerken “Alt” tuşuna basması gerekir. Bu çalışmada, sonuçları etkilememesi için nicelleştirmeden önce artefaktlar olarak spesifik olmayan boyama elimine edildi. Sistematik olarak düşük spesifik boyama veya yüksek arka plan durumunda, olası yanlılığı önlemek için protokol gözden geçirilmelidir. Eşik, zayıf bir spesifik pozitif boyama olan her vaka için ayarlandı. Herhangi bir rutin kullanımdan önce protokol optimize edilmelidir. Tüm analizler kör bir şekilde yapılmalıdır ve ideal olarak, eşiklemenin doğruluğu çapraz kontrolü hak eder.

QuPath, daha önce HCC49 ve farklı kanserlerde50,51 görüntü analizi için testedilmiş, dijital patoloji ve tüm slayt görüntü analizi 9 için kullanıcı dostu, sezgisel, genişletilebilir, açık kaynaklı bir çözümdür. Yazılımın WSI’lar için kolay kullanımı ve ilgilenilen bölgelerin (örneğin, tümöral veya peritümöral alanlar) açıklama seçenekleri ana avantajlardır.

Mevcut, değiştirilmiş veya de novo oluşturulan komut dosyalarının uygulanması, analizi önemli ölçüde hızlandırabilir. ROI’ler için ek açıklamalar oluşturma komut dosyası uygulandı, bu da manuel tanımlama yerine hızlı ve doğru bölgesel segmentasyon sağladı. Komut dosyası sabit değildir ve yetersiz doku sınırlarına sahip bölgeler için 500 μm’den daha az kenar boşluklarına kolayca özelleştirilebilir. IM, OM veya PT alanının genişliği, 30 Çift Genişletme Marjı Mikron = 500 μm satırını Çalıştır’> mevcut genişliğe uyarlamak > Otomatikleştir > Show komut dosyası düzenleyicisi aracılığıyla özelleştirilebilir. ROI’ler de eklenebilir veya kaldırılabilir. Genel olarak, yazılımdaki iş akışları sabit değildir ve operatör bunları geliştirmekte ve değiştirmekte özgürdür.

CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser ve diğerleri dahil olmak üzere patolojik görüntü analizi için çok sayıda mevcut yazılım aracı şu anda mevcuttur. Ancak QuPath, açık kaynak mimarisi, kullanıcı dostu arayüz, algoritma özelleştirme yetenekleri ve gelişmiş makine öğrenimi araçlarının entegrasyonu gibi bir dizi avantajla kendini farklı kılar. Bu özellikler toplu olarak, bu görüntü analiz yazılımını dijital patoloji alanında kanser dokularının incelikli analizi için sağlam bir seçim olarak konumlandırır.

QuPath, meme kanserinde Ki67 ekspresyonunun tespiti için ticari yazılım HALO (IndicaLab) ve QuantCenter (3DHistech) ile karşılaştırıldığında en düşük değişkenliği gösterdi52. Yazılım ayrıca, tüm proje görüntüleri için tekrarlanabilir bir toplu işleme tarzında bir komut dosyası çalıştırma talimatı verilme potansiyeline de sahiptir.

QuPath, sıralı (yarı kantitatif) veriler yerine nicel sürekli veriler oluşturmamızı sağladı. Görsel puanlama ile elde edilen sıralı veriler, yorumlamadaki öznellik, gözlemciler arası değişkenlik ve zayıf tekrarlanabilirlik nedeniyle sorunlarla doludur53. Mevcut analizin çabukluğu, kapsamlı histopatoloji geçmişine ve programlama uzmanlığına sahip olmayan kişilerin, ek açıklamaların doğruluğunun bir patolog tarafından kontrol edilmesi koşuluyla otomatik analiz yapabilmesi gerçeğiyle iyileştirildi. Baş ve boyun tümörleri üzerine yapılan bir çalışma, QuPath’in CD57+ tümör infiltre eden lenfositlerin50 prognostik değerinin hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesi için uygunluğunu göstermiştir. Çalışma ayrıca insan gözlemciler ve QuPath arasında önemli bir uyum olduğunu gösterdi. QuPath kullanılarak manuel gözlem ve değerlendirme arasındaki yüksek uyum, ağız kanseri54 ve meme kanseri55’te de sunulmuştur. Yukarıda bahsedilen makale, QuPath ve 2 ticari yazılım ürünü (Definiens Tissue Studio ve inForm) kullanılarak 5 klinik meme kanseri biyobelirtecinin IHC miktar tayinini bir patolog tarafından yapılan manuel skorlama ile karşılaştırdı. Bu çalışma boyunca, QuPath sürekli olarak en iyi performansı ve kurulum ve uygulama için en az zamanı sergiledi ve böylece görsel izleme ve ticari yazılımlara gelecekte mükemmel bir alternatif olduğunu gösterdi. Biyomedikal görüntü analizi için en iyi bilinen açık kaynaklı yazılım olan ImageJ ile karşılaştırıldığında bile QuPath, büyük boyutlu WSI’larla başa çıkmada mükemmeldir56.

QuPath için, kullanıcıların dijital patoloji yöntemleri hakkında sorularını gönderdikleri ve görüntü analizi (https://forum.image.sc/tag/qupath) araçlarının geliştirilmesini desteklemek için aktif ve ilgili bir topluluk sundukları açık bir çevrimiçi forum bulunmaktadır.

Bu çalışmada kullanılan kohort benzersizdi ve HCC’li genel popülasyonu temsil etmiyordu, çünkü sadece karaciğer rezeksiyonu için uygun olan hastaları kapsıyordu. Genel olarak, HCC’li hastaların küçük bir kısmı (%20-30) karaciğer rezeksiyonu için uygundur57. Bu aynı zamanda daha az hastanın sirozu doğrulamasının bir nedeni olabilir, çünkü bu HCC etiyolojisine sahip hastalar muhtemelen daha yüksek Child-Pugh skorlarına sahipti ve rezektabl olarak kabul edilmedi. Kohort da oldukça küçüktü ve hastaların çoğunda hastalığın erken TNM evreleri vardı. Bu nedenle, sonuçların diğer popülasyonlara ekstrapolasyonu dikkatle yapılmalıdır.

Bu çalışmada, HCC mikroçevresindeki doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin bolluğu, dendritik hücreler gibi düzensiz şekilli bağışıklık hücrelerinin kesin sayımı zor olabileceğinden, AF’lerinin değerlendirilmesi yoluyla tahmin edilmiştir. Öte yandan, bağışıklık hücrelerinin alan fraksiyonu genellikle yoğunlukları ile güçlü bir şekilde ilişkilidir58. İmmünoperoksidaz etiketlemesi, antijenin, alan fraksiyonunun veya onu eksprese eden hücrelerin yoğunluğunun lokalizasyonu için veri sağlar, ancak boyamanın yoğunluğu antijen miktarı ile doğrusal olarak ilişkili değildir. Bu nedenle, IHC, belirli bir proteinin ekspresyon seviyesini kantitatif olarak değerlendirmek için kullanılmamalıdır. Yöntemin doğruluğu ayrıca kesit kalınlığının tekdüzeliğine, görüntü kalitesine ve piksel sınıflandırması için seçilen çözünürlüğe de bağlıdır. Görüntü analizinin herhangi bir sonucu doğrulanmalı ve dikkatle ele alınmalıdır. Tek bir belirteç bağışıklık hücrelerinin karmaşıklığını tam olarak yakalayamadığından, HCC’nin bağışıklık TME’sinin güvenilir bir resmini elde etmek için daha fazla IHC belirteci ve multipleks boyamaya ihtiyaç vardır. İmmün hücrelerin fenotiplendirilmesi için sadece tek bir IHC markörü kullanmak bir yaklaşımı temsil eder ve sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.

IHC lekeli slaytları değerlendirmek için QuPath görüntü analiz yazılımını kullanmak, HCC hastalarının tümör ve peritümöründe lokal iDC’lerin, mast hücrelerinin ve NK’lerin dağılımını ve alan fraksiyonunu değerlendirmemizi ve ardından prognoz ile ilişkilerini analiz etmemizi sağladı. HCC’nin iç kenarındaki ve peritümör karaciğerindeki mast hücrelerinin bolluğu, daha uzun DFS ve OS ile ilişkilidir ve bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin anti-tümör etkilerini vurgular. QuPath’in analitik iş akışı, yararlı varsayılan ayarlar ve kolay veri dışa aktarma ile kullanıcı dostu, hızlı ve kullanımı kolaydır. Bu yazılım, dijital patolojide tekrarlanabilirlik, tutarlılık ve doğruluk ihtiyacını karşılayabilecek dijital görüntü analizi için umut verici bir platform olarak onaylanmıştır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Mgr. Ondřej Šebesta’nın (Vinicna Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Fen Fakültesi, Charles Üniversitesi) tüm slayt taraması ve bu çalışma için bize hesaplama kaynakları sağlayan “e-Infrastruktura CZ” (e-INFRA LM2018140) projesi için katkılarını takdir ediyoruz. Teknisyenler Jana Dosoudilova ve Jan Javurek, mükemmel teknik yardımları için teşekkür edilmektedir. Bu araştırma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı, hibe N°856620 ve Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı, AZV NU21-03-00506 hibesi ve İşbirliği Programı (Cerrahi disiplinler) tarafından finanse edilmiştir. Vinicna Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Çek Biyogörüntüleme büyük RI projesi LM2023050 tarafından ortaklaşa finanse edilmektedir.

Materials

Anti-CD1a Leica Biosystems PA0235 Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
Anti-CD117 Leica Biosystems  PA0007 Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
BOND Plus Microscope Slides Leica Biosystems, Germany S21.2113.A
BOND RXm Leica Biosystems 49.1501 Fully Automated IHC Stainer  
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit Leica Biosystems CS9100
Bond Dewax Solution Leica Biosystems AR9222
Bond Polymer Refine Detection Kit Leica Biosystems DS9800
BondTM Epitope Retrieval 2 Leica Biosystems AR9640
BondTM Primary Antibody Diluent Leica Biosystems AR9352
BondTM Wash Solution 10X Concentrate Leica Biosystems AR9590
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz Installed RAM: 128 G Intel A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available
Coverslips Leica Biosystems, Germany 14071135636
CV Mount Leica Biosystems, Germany 14046430011
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper Leica Biosystems 149CVTS5025
Drying Oven UN30 Memmert GmbH  UN30
GraphPad Prism 9.0 GraphPad Software LLC  Version 12
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 R&D Systems, Inc., United States MAB1850 Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 – Water Bath Leica Biosystems 14041521466
Protein Block Agilent Dako, United States X0909
QuPath 0.3.2 or higher versions  version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 Rotary Microtome Leica Biosystems 149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Slide Stainer Leica Biosystems DEV-ST5010-CV5030
Statistica StatSoft Inc. version 7
Zeiss Axio Scan.Z1 ScienceServices GmbH, Germany 430038-9000-000  Slide scanner 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Du, M., Yin, Y. L., Xiao, L., Cai, Y. M., Ji, Y. Evaluating tumor-infiltrating lymphocytes in hepatocellular carcinoma using hematoxylin and eosin-stained tumor sections. World J Clin Cases. 10 (3), 856-869 (2022).
  2. Trailin, A., et al. T-and B-cells in the inner invasive margin of hepatocellular carcinoma after resection associate with favorable prognosis. Cancers (Basel). 14 (3), 604 (2022).
  3. Xiao, N., et al. CD74+ macrophages are associated with favorable prognosis and immune contexture in hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 71 (1), 57-69 (2022).
  4. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  5. Roxburgh, C. S. D., Salmond, J. M., Horgan, P. G., Oien, K. A., McMillan, D. C. Tumour inflammatory infiltrate predicts survival following curative resection for node-negative colorectal cancer. Eur J Cancer. 45 (12), 2138-2145 (2009).
  6. Klintrup, K., et al. Inflammation and prognosis in colorectal cancer. Eur J Cancer. 41 (17), 2645-2654 (2005).
  7. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, e36967 (2018).
  8. Cho, J. Basic immunohistochemistry for lymphoma diagnosis. Blood Res. 57 (S1), 55-61 (2022).
  9. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878 (2017).
  10. Kolinko, Y., et al. Using virtual microscopy for the development of sampling strategies in quantitative histology and design-based stereology. Anat Histol Embryol. 51 (1), 3-22 (2022).
  11. Rodrigues, A., et al. Computer-assisted tumor grading, validation of PD-L1 scoring, and quantification of CD8-positive immune cell density in urothelial carcinoma, a visual guide for pathologists using QuPath. Surg Exp Pathol. 5, 12 (2022).
  12. Hein, A. L., et al. QuPath digital immunohistochemical analysis of placental tissue. J Pathol Inform. 12, 40 (2021).
  13. Lichterman, J. N., Reddy, S. M. Mast cells: A new frontier for cancer immunotherapy. Cells. 10 (6), 1270 (2021).
  14. Veglia, F., Gabrilovich, D. I. Dendritic cells in cancer: the role revisited. Curr Opin Immunol. 45, 43-51 (2017).
  15. Wu, S. -. Y., Fu, T., Jiang, Y. -. Z., Shao, Z. -. M. Natural killer cells in cancer biology and therapy. Mol Cancer. 19 (1), 120 (2020).
  16. Kai, K., et al. Immunohistochemical analysis of the aggregation of CD1a-positive dendritic cells in resected specimens and its association with surgical outcomes for patients with gallbladder cancer. Transl Oncol. 14 (1), 100923 (2021).
  17. Minesaki, A., Kai, K., Kuratomi, Y., Aishima, S. Infiltration of CD1a-positive dendritic cells in advanced laryngeal cancer correlates with unfavorable outcomes post-laryngectomy. BMC Cancer. 21 (1), 973 (2021).
  18. Komi, D. E. A., Redegeld, F. A. Role of mast cells in shaping the tumor microenvironment. Clin Rev Allergy Immunol. 58 (3), 313-325 (2020).
  19. Maltby, S., Khazaie, K., McNagny, K. M. Mast cells in tumor growth: Angiogenesis, tissue remodelling and immune-modulation. Biochim Biophys Acta. 1796 (1), 19-26 (2009).
  20. Gooch, J. L., Lee, A. V., Yee, D. Interleukin 4 inhibits growth and induces apoptosis in human breast cancer cells. Cancer Res. 58 (18), 4199-4205 (1998).
  21. Brockmeyer, P., et al. High mast cell density indicates a longer overall survival in oral squamous cell carcinoma. Sci Rep. 7 (1), 14677 (2017).
  22. Lee, H. A., et al. Natural killer cell activity is a risk factor for the recurrence risk after curative treatment of hepatocellular carcinoma. BMC Gastroenterol. 21 (1), 258 (2021).
  23. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  24. Barrow, A. D., Martin, C. J., Colonna, M. The natural cytotoxicity receptors in health and disease. Front Immunol. 10, 909 (2019).
  25. Guan, X., et al. Tumor-associated NK cells facilitate tumor growth via NKp46 in immunocompetent murine hepatocellular carcinoma. Immunol Lett. 258, 8-19 (2023).
  26. Ali, E., et al. Prognostic role of macrophages and mast cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma after resection. BMC Cancer. 24 (1), 142 (2024).
  27. Lin, C., et al. Tryptase expression as a prognostic marker in patients with resected gastric cancer. Br J Surg. 104 (8), 1037-1044 (2017).
  28. Hempel, H. A., et al. Low intratumoral mast cells are associated with a higher risk of prostate cancer recurrence. Prostate. 77 (4), 412-424 (2017).
  29. Rohr-Udilova, N., et al. Morphometric analysis of mast cells in tumor predicts recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation. Hepatol Commun. 5 (11), 1939-1952 (2021).
  30. Lin, S. Z., et al. Prediction of recurrence and survival in hepatocellular carcinoma based on two cox models mainly determined by FoxP3+ regulatory T cells. Cancer Prev Res. 6 (6), 594-602 (2013).
  31. Jia, Q., Wang, A., Yuan, Y., Zhu, B., Long, H. Heterogeneity of the tumor immune microenvironment and its clinical relevance. Exp Hematol Oncol. 11 (1), 24 (2022).
  32. Pyo, J. -. S., Son, B. K., Lee, H. Y., Oh, I. H., Chung, K. H. Prognostic implications of intratumoral and peritumoral infiltrating lymphocytes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Curr Oncol. 28 (6), 4367-4376 (2021).
  33. Yusa, T., et al. Survival impact of immune cells infiltrating peritumoral area of hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. 113 (12), 4048-4058 (2022).
  34. Halama, N., et al. Localization and density of immune cells in the invasive margin of human colorectal cancer liver metastases are prognostic for response to chemotherapy. Cancer Res. 71 (17), 5670-5677 (2011).
  35. Zwing, N., et al. Analysis of spatial organization of suppressive myeloid cells and effector T cells in colorectal cancer-A potential tool for discovering prognostic biomarkers in clinical research. Front Immunol. 11, 550250 (2020).
  36. Soeratram, T. T. D., et al. Prognostic value of T-cell density in the tumor center and outer margins in gastric cancer. Mod Pathol. 36 (9), 100218 (2023).
  37. Gonzàlez-Farré, M., et al. Characterization and spatial distribution of the immune cell infiltrate in triple-negative breast cancer: a novel classification based on plasma cells and CD8+ T cells. Hum Pathol. 139, 91-105 (2023).
  38. Hendry, S., et al. Assessing tumor-infiltrating lymphocytes in solid tumors: A practical review for pathologists and proposal for a standardized method from the International Immunooncology Biomarkers Working Group: Part 1: Assessing the host immune response, TILs in invasive breast carcinoma and ductal carcinoma in situ, metastatic tumor deposits and areas for further research. Adv Anat Pathol. 24 (5), 235-251 (2017).
  39. Brück, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Mod Pathol. 34 (12), 2229-2241 (2021).
  40. Knebel, M., et al. Prognostic impact of intra- and peritumoral immune cell subpopulations in head and neck squamous cell carcinomas – comprehensive analysis of the TCGA-HNSC cohort and immunohistochemical validation on 101 patients. Front Immunol. 14, 1172768 (2023).
  41. Lee, S., et al. Interactive classification of whole-slide imaging data for cancer researchers. Cancer Res. 81 (4), 1171-1177 (2021).
  42. Ciga, O., et al. Overcoming the limitations of patch-based learning to detect cancer in whole slide images. Sci Rep. 11 (1), 8894 (2021).
  43. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
  44. Masuda, S., Nakanishi, Y. Application of immunohistochemistry in clinical practices as a standardized assay for breast cancer. Acta Histochem Cytochem. 56 (1), 1-8 (2023).
  45. Matsutani, S., et al. Tumor-infiltrating immune cells in H&E-stained sections of colorectal cancer tissue as a reasonable immunological biomarker. Anticancer Res. 38 (12), 6721-6727 (2018).
  46. Väyrynen, J. P., et al. Prognostic significance of immune cell populations identified by machine learning in colorectal cancer using routine hematoxylin and eosin-stained sections. Clin Cancer Res. 26 (16), 4326-4338 (2020).
  47. Zhou, G., et al. Clinical significance of tumor-infiltrating lymphocytes investigated using routine H&E slides in small cell lung cancer. Radiat Oncol. 17 (1), 127 (2022).
  48. Horny, H. -. P., Sotlar, K., Valent, P. Mastocytosis. Immunol Allergy Clin North Am. 34 (2), 315-321 (2014).
  49. Mi, H., Ho, W. J., Yarchoan, M., Popel, A. S. Multi-scale spatial analysis of the tumor microenvironment reveals features of cabozantinib and nivolumab efficacy in hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 892250 (2022).
  50. de Ruiter, E. J., et al. Assessing the prognostic value of tumor-infiltrating CD57+ cells in advanced stage head and neck cancer using QuPath digital image analysis. Virchows Archiv. 481 (2), 223-231 (2022).
  51. Fanucci, K. A., et al. Image analysis-based tumor infiltrating lymphocytes measurement predicts breast cancer pathologic complete response in SWOG S0800 neoadjuvant chemotherapy trial. NPJ Breast Cancer. 9 (1), 38 (2023).
  52. Acs, B., et al. Ki67 reproducibility using digital image analysis: an inter-platform and inter-operator study. Lab Invest. 99 (1), 107-117 (2019).
  53. Sobottka, B., et al. Establishing standardized immune phenotyping of metastatic melanoma by digital pathology. Lab Invest. 101 (12), 1561-1570 (2021).
  54. Moratin, J., et al. Digital pathology scoring of immunohistochemical staining reliably identifies prognostic markers and anatomical associations in a large cohort of oral cancers. Front Oncol. 11, 712944 (2021).
  55. Bankhead, P., et al. Integrated tumor identification and automated scoring minimizes pathologist involvement and provides new insights to key biomarkers in breast cancer. Lab Invest. 98 (1), 15-26 (2018).
  56. Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Comput Struct Biotechnol J. 19, 852-859 (2021).
  57. Koh, J. H., et al. Liver resection versus liver transplantation for hepatocellular carcinoma within Milan criteria: a meta-analysis of 18,421 patients. Hepatobiliary Surg Nutr. 11 (1), 78-93 (2022).
  58. Eriksen, A. C., et al. Computer-assisted stereology and automated image analysis for quantification of tumor infiltrating lymphocytes in colon cancer. Diagn Pathol. 12 (1), 65 (2017).

Tags

Mast CellsHepatocellular CarcinomaImmune CellsPrognosisQuPathImage AnalysisDendritic CellsNatural Killer CellsTime To RecurrenceDisease-free SurvivalOverall Survival

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ali, E., Červenková, L., Pálek, R., Ambrozkiewicz, F., Pavlov, S., Ye, W., Hošek, P., Daum, O., Liška, V., Hemminki, K., Trailin, A. Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software. J. Vis. Exp. (206), e66743, doi:10.3791/66743 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image