JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Тучные клетки в микроокружении гепатоцеллюлярной карциномы обеспечивают благоприятный прогноз: ретроспективное исследование с использованием программного обеспечения для анализа изображений QuPath

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66743
, , , , , , , , , ,
1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine,Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 5Sikl’s Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen,Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology,German Cancer Research Center

Summary

Наличие тучных клеток во внутреннем крае и околоопухолевых областях гепатоцеллюлярной карциномы после резекции дает благоприятный прогноз. Это исследование одобряет программное обеспечение для анализа изображений QuPath как многообещающую платформу, которая может удовлетворить потребность в воспроизводимости, согласованности и точности в цифровой патологии.

Abstract

Информация, полученная при обнаружении иммунных клеток в гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) in situ , может предоставить информацию о результатах лечения пациентов. Исследования, изучающие экспрессию и локализацию иммунных клеток в опухолевых тканях, связаны с рядом проблем, включая отсутствие точной аннотации для опухолевых областей и случайный выбор микроскопических полей зрения. QuPath — это удобное программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое может удовлетворить растущую потребность в цифровой патологии при анализе целых слайдовых изображений (WSI).

Иммуногистохимически оценивали инфильтрацию ГЦК и прилегающих тканей незрелыми дендритными клетками (iDCs) CD1a+, тучными клетками CD117+ и клетками естественных киллеров (NKs) NKp46+ в репрезентативных образцах 67 пациентов с ГЦК, перенесших лечебную резекцию. Доля площади (ФП) положительно окрашенных клеток оценивалась автоматически в WSI с использованием QuPath в опухолевом центре (TC), внутреннем крае (IM), внешнем крае (OM) и области периопухоли (PT). Прогностическое значение иммунных клеток оценивали по времени до рецидива (TTR), безрецидивной выживаемости (DFS) и общей выживаемости (ОВ).

ФП тучных клеток была значительно выше, чем ФП NKs, а ФП iDCs была значительно ниже по сравнению с NK в каждой области, представляющей интерес. Высокие ФП тучных клеток в зонах IM и PT ассоциировались с более длительными DFS. Кроме того, высокая ФП тучных клеток при ИМ ассоциировалась с более длительным ОВ.

Компьютерный анализ с использованием этого программного обеспечения является подходящим инструментом для получения прогностической информации о инфильтрирующих опухоль иммунных клетках (iDCs, тучных клетках и NKs) в различных областях ГЦК после резекции. Тучные клетки показали наибольшую ФП во всех областях интереса (ROI). Тучные клетки в периопухолевой области и ИМ показали положительную прогностическую значимость.

Introduction

Было доказано, что пространственная организация и обилие инфильтрирующих опухоль иммунных клеток влияют на выживаемость при различных видах рака, включая гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК) 1,2,3,4. Прогностическое значение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов при раке было впервые показано на участках, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E) 5,6. Затем пионерское исследование Galon et al. с использованием иммуногистохимии (ИГХ) продемонстрировало связь плотностей CD3+ и CD8+ Т-клеток в ткани рака толстой кишки с прогнозом4.

ИГХ является золотым стандартом визуализации, количественной оценки и картирования иммунных клеток в опухолевой ткани для дальнейшей связи с клиническими исходами7. ИГХ имеет ряд преимуществ, таких как низкая стоимость, широкая доступность и совместимость с фиксированными формалином тканями, залитыми парафином (FFPE)8. Тем не менее, точная оценка окрашенных ИГХ иммунных клеток является большой проблемой. Традиционная оценка в выбранных микроскопических полях зрения отнимает много времени и больше не достаточна для обеспечения высококачественного, воспроизводимого, объективного анализа, необходимого для выбора биомаркеров-кандидатов и надежной клиническойкорреляции. Сканирование всего предметного стекла может быть оценено как цельное изображение или после субдискретизации10.

Компьютерная количественная оценка обилия иммунных клеток в образцах тканей может обеспечить практические, точные, надежные и клинически значимыеданные. QuPath — это бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое позволяет анализировать цифровые изображения слайдов, окрашенных ИГХ, и максимально увеличивает объем информации, полученной из отдельных образцов12.

Поскольку незрелые дендритные клетки (iDCs), естественные киллеры (NK) и тучные клетки участвуют в противоопухолевых иммунных реакциях и, как было показано, коррелируют с исходами пациентов 13,14,15, мы представляем здесь пошаговый протокол для оценки их пространственного распределения в тканях FFPE HCC и изучения их прогностического воздействия. CD1a экспрессируется в основном на мембране незрелых дендритных клеток, плотность которых была связана с клиническими исходами при различных опухолях человека16,17. Тучные клетки могут играть проопухолевую или противоопухолевую роль в опухолевом микроокружении (ТМЭ)18. Они могут поддерживать ангиогенез и способствовать метастазированию19. С другой стороны, сообщалось, что тучные клетки могут опосредуть апоптоз опухолевых клеток посредством производства IL-420. Окрашивание анти-CD117 обычно используется для визуализации и количественного определения тучных клеток в опухолевой ткани21. Считается, что NK-клетки вносят свой вклад в наблюдение и контроль HCC22, убивая раковые клетки23. Экспрессия NKp46 NK является важнейшим параметром для их противоопухолевой активности24. Тем не менее, NKp46+ NK-клетки положительно коррелировали с диаметром опухоли у пациентов с ГЦК25. Несмотря на это, мало что известно об их корреляции с выживаемостью пациентов.

Мы стремились количественно оценить обилие CD1a+ iDCs, CD117+ тучных клеток и NKp46+ NK-клеток в различных областях ГЦК и подчеркнуть их прогностическую значимость. В настоящее ретроспективное исследование были включены в настоящее ретроспективное исследование в общей сложности 70 последовательных пациентов с патологически подтвержденной ГЦК I-IV стадии, которые имели право на резекцию в соответствии с рекомендациями BCLC и которым была выполнена резекция печени с лечебным намерением в Университетской клинике Пльзеня в период с 1997 по 2019 год. Были рассмотрены патологоанатомические заключения пациентов. Ни у одного из пациентов, включенных в это исследование, не было отдаленных метастазов и они не получали неоадъювантную терапию, такую как химиотерапия или лучевая терапия, до операции. Всего было исключено 3 пациента с некачественными гистологическими препаратами, а остальные 67 пациентов были включены в исследование (табл. 1).

Protocol

Этот протокол был частью исследования, проведенного в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации (версия 2013 года); он был одобрен Этическим комитетом медицинского факультета и Университетской клиники в Пльзене (118/2021, 11 марта 2021 г.). На рисунке 1 приведена краткая информация об использованных методах. 1. Подбор тканевых блоков FFPE Извлекайте идентификаторы блоков FFPE из карт пациентов с помощью лечащих врачей или патологоанатомов. Запросите блоки FFPE из архива местных патологоанатомических исследований. Для каждого пациента подбирают 2-3 блока FFPE, содержащих жизнеспособную опухолевую ткань, преимущественно с окружающей периопухолевой областью и неопухолевой печенью.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого выбора рекомендуется получить заключение эксперта-патологоанатома. Гистологическая оценка неопухолевой печени, анамнестические, клинические и лабораторные данные была использована для определения основной этиологии ГЦК. 2. Депарафинизация и регидратация ткани FFPE Вырежьте один или два среза ткани толщиной 4 мкм из каждого из тканевых блоков FFPE на микротоме.ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина секций может составлять от 3 мкм до 5 мкм без заметного окрашивания; Тем не менее, толщина 4 мкм является стандартом. Поместите пряди на водяную баню (42°C), чтобы убрать морщины. Установите предметные стекла, подняв их и поместив на положительно заряженное стеклянное микроскопическое предметное стекло. Затем нанесите предметные стекла на сушку при температуре окружающей среды (AT) в течение 24 часов. Поместите предметные стекла в термостат (56 °C) на 1 час. Используйте автоокрашиватель для депарафинизации срезов в растворе депарафина-1 (30 с при 72 °C), растворе депарафина-2 (10 с при 72 °C), растворе депарафина-3 (10 с при AT), этаноле 96%-1 (10 с), этаноле 96%-2 (10 с) и этаноле 96%-3 (10 с). С помощью автопятнителя увлажните участки в растворе для стирки-1 (10 с, AT), растворе для стирки-2 (10 с, AT) и растворе для стирки-3 (5 мин, AT). 3. Выполнение ИГХ в полностью автоматизированном морилке ПРИМЕЧАНИЕ: ИГХ выполняется в соответствии с протоколом производителя. Эти шаги кратко объясняются ниже. Метод забора антигенаПолучите антиген с помощью процедуры индуцированного нагреванием эпитопов (ER) в растворе ER с высоким pH (например, Tris-EDTA): раствор ER-1 (10 с, AT), раствор ER-2 (10 с, AT), раствор ER-3 (20 мин при 100 °C), раствор ER-4 (12 мин, AT). Промойте предметное стекло в моющем растворе 3x (по 30 секунд каждая) и 1x (3 минуты). Блокировать эндогенную пероксидазу раствором Пероксидного блока в течение 5 мин при АТ. Прополощите в растворе для стирки 3 раза (по 30 с каждый). Блокируйте неспецифическое связывание антител с белковым блоком для NKp46 только на 30 мин. при АТ. Связывание с первичными антителами: Инкубировать с первичными антителами в течение 15 мин при АТ, затем промыть промывочным раствором в течение 3 раз (по 30 с каждый). Для вторичного связывания антител выполните описанные ниже действия.Инкубировать с пероксидазой-конъюгированными вторичными антителами хрена в течение 8 мин при АТ. Промойте моющим раствором 2x (по 2 мин каждый) и 1x деионизированной водой. Визуализируйте реакцию, промыв предметные стекла раствором диаминобензидина (DAB), а затем инкубируя их с раствором DAB в течение 10 минут при AT. Промойте в течение 3 раз (30 с) деионизированной водой. Противозаправьте срезы гематоксилином Майера. Промойте деионизированной водой в течение 1x (30 с), промывочным раствором в течение 1x (30 с) и деионизированной водой в течение 1x (30 с). Используйте полностью автоматизированную морилку для обезвоживания срезов в этаноле 70% (2 мин), этаноле 80% (2 мин), этаноле 96%-1 (3 мин), этаноле 96%-2 (3 мин), этаноле 100% (3 мин), ксилоле-1 (4 мин), ксилоле-2 (4 мин) и ксилоле-3 (4 мин). Используйте полностью автоматизированную стеклянную покровную туфельку для крепления секций на предметных стеклах в монтажный материал.ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего исследования использовались отрицательные и положительные (миндалины) контрольные образцы тканей. 4. Получение сканов всего слайда Сканируйте испачканные предметные стекла с помощью 20-кратного объектива и умеренно-высокой плотности фокусировки на сканере цельного предметного стекла. 5. Анализ ИГХ с помощью программного обеспечения Создайте проект для изображений IHC в программном обеспечении.Скачайте и откройте QuPath-0.4.3 (или выше).exe Создайте новую папку с подходящим именем. Нажмите кнопку « Создать проект » в левом верхнем углу программы и выберите только что созданную папку. Перетащите отсканированные изображения в окно программы. Когда автоматически появится новое окно, выберите Set Image Type > H-DAB и нажмите Import (рисунок 2). Следите за списком изображений в левом окне меню; Дважды кликните, чтобы открыть изображение. Выберите в главном меню вверху Файл , чтобы сохранить изображения как проект.ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение может работать с широким спектром форматов изображений, включая множество форматов целых слайдов. Тем не менее, формат tiff предпочтительнее, чтобы предотвратить потерю исходных данных и связанных с ними метаданных. Аннотирование областей интересаВыберите инструмент «Кисть » или « Палочка » в главном меню вверху, чтобы добавить примечания к области опухоли. Для прерывистых участков опухоли выполните шаги 5.2.1.1-5.2.1.3.Аннотируйте их отдельно. Нажмите и удерживайте клавишу Ctrl во время выделения всех областей опухоли Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Редактировать несколько» > «Объединить выбранное». Убедитесь, что аннотация опухоли выбрана (границы имеют желтый цвет). Нажмите «Автоматизировать » в главном меню и выберите «Показать редактор скриптов». Скопируйте сценарий, доступный в дополнительном файле 1 или в https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls, и вставьте его в редактор сценариев, затем нажмите «Выполнить». ROI: центр опухоли (TC), внутренний край (IM), внешний край (OM) и периопухолевая область (PT) будут созданы и помечены автоматически. Для получения альтернативного способа создания областей интереса выполните шаги 5.2.5.1-5.2.5.5.Выберите инструмент « Полилиния» в главном меню вверху, чтобы нарисовать границу, разделяющую гнезда злокачественных клеток и прилегающие неопухолевые ткани. Выделите получившуюся границу. Выберите в главном меню вверху Объекты > аннотацию > Развернуть аннотации > 500 мкм для Радиуса расширения > Плоский для Конца линии. Активируйте функцию Удалить интерьер и активируйте функцию Ограничить родительский элемент. Щелкните правой кнопкой мыши результирующую аннотацию, Редактировать сингл > разделить. Две отдельные аннотации будут автоматически расширены в виде областей шириной 500 мкм по обе стороны границы. Присвойте аннотированным регионам соответствующие имена для IM и OM, щелкнув правой кнопкой мыши аннотацию в списке слева, выбрав «Задать свойства» и введя имя. TC представляет собой оставшуюся площадь опухоли. Увеличьте область PT шириной 500 мкм, прилегающую к ОМ, используя ту же процедуру.ПРИМЕЧАНИЕ: Аннотированные слайды и обнаруженные с помощью QuPath AF были рассмотрены экспертом-гистопатологом. Оптимизация классификации пикселейВыберите инструмент «Прямоугольник » в главном меню. Затем аннотируйте область, которая содержит все типы пикселей, которые необходимо различать (например, гематоксилин, DAB и фон). В главном меню выберите «Анализ > предварительная обработка» > «Оценка вектора пятен». Когда автоматически появится окно Визуальный редактор пятен , выберите Авто > OK и установите H-DAB estimated в качестве имени вектора пятна. В качестве альтернативного метода выполните шаги 5.3.4.1-5.3.4.3.Выберите инструмент «Прямоугольник » в главном меню и аннотируйте небольшую область типичного ядра, окрашенного гематоксилином. Выберите «Изображение» в меню слева и дважды кликните на «Пятно 1» > «Да». Выберите инструмент «Прямоугольник » в главном меню и аннотируйте небольшую область положительного окрашивания с помощью DAB. Выберите «Изображение » в меню слева и дважды кликните на «Пятно 2» > «Да». Оценка доли площади положительных иммунных клеток с помощью опции «Классификация пикселей ».В главном меню нажмите Классифицировать > классификацию пикселей > Создать пороговое значение. Выберите высокое для разрешения > канала: DAB > Предварительный фильтр: Гауссов > Сигма: 0,5 > (рис. 3) Порог: (0,2-0,3) > выше порога: положительный > ниже порога: отрицательный. Для региона выберите Любая аннотация, введите имя классификатора > Сохранить > Измерить > OK. DAB-положительные клетки будут окрашены в красный цвет (Рисунок 4). Скопируйте результаты из левого бокового меню в таблицу. Или откройте «Измерить » в верхнем главном меню, выберите «Показать измерения аннотаций» > «Копировать в буфер обмена» и вставьте результаты в таблицу. Чтобы закрыть изображение, щелкните правой кнопкой мыши > Multi View > Close Viewer.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед количественной оценкой любые артефакты были устранены. Порог корректировался для каждого случая со слабым специфическим положительным окрашиванием. Правильность аннотаций и классификации пикселей была сначала перепроверена, а затем проверена старшим гистопатологом. Все анализы проводились вслепую. Более подробную информацию об анализе ИГХ с помощью программного обеспечения можно найти в https://forum.image.sc/tag/QP. 6. Статистические методы и анализ данных Конечными точками исследования были время до рецидива (TTR), безрецидивная выживаемость (DFS) и общая выживаемость (ОВ). Пациенты без рецидива или смерти подвергались цензуре при последнем последующем наблюдении.ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывные ненормально распределенные данные выражаются как медиана (min-max). Пропорции выражаются в виде исходных данных (процентов). Доли площадей иммунных клеток в различных областях интереса (ROI) сравнивали с помощью ANOVA Фридмана, за которым последовал тест на подобранные пары Вилкоксона с коррекцией Бонферрони. Из-за непараметрического распределения большинства переменных корреляция Спирмена использовалась для оценки связей между парами порядковых или количественных переменных. Для определения прогностической ценности отдельных предикторов для конечных точек был проведен однофакторный анализ с последующей многомерной регрессионным анализом Кокса. Были рассчитаны отношения рисков (ОР). ОР показывала относительный риск для комбинированной группы с промежуточным высоким уровнем по сравнению с 1 для группы с низким уровнем заболеваемости. Все оценки выживаемости рассчитывались по методу Каплана-Мейера и сравнивались между группами по логарифмическому критерию. Для статистического анализа использовался GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). Двустороннее p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Representative Results

Демографические и клинические характеристики пациентов представлены в таблице 1. Средний возраст пациентов составил 69 лет, большинство из них были мужчинами (77,6%). Что касается этиологии ГЦК, то хронический невирусный гепатит был наиболее частым фоновым заболеванием, с преобладанием неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) (23,9%). Только у 15 пациентов (22,4%) цирроз был фоновым заболеванием. У большинства пациентов (68,7%) была ТНМ I стадии. Более подробные клинические и патологические данные были описаны в нашей ранее опубликованной работе 2,26. РезультатыПри последнем наблюдении рецидив опухоли наблюдался у 29 (41,8%) пациентов, из которых у 89,7% наблюдался местный рецидив и 38 (56,7%) пациентов умерли. Через 5 лет после операции доля СДС составила 33,2%, доля ОВ – 49,4%, а доля безрецидивных препаратов (ЗКП) – 48,7% (табл. 2). Распределение иммунных клеток в различных областях интересаБелок CD117 был обнаружен преимущественно в цитоплазматической мембране округлых клеток (рис. 5A). В ТК и ИМ они были преимущественно локализованы в строме и в периваскулярном пространстве. В зонах ОМ и ПТ клетки CD117+ наблюдались в капсуле опухоли и в периваскулярном пространстве. Белок NKp46 был обнаружен в основном в цитоплазматической мембране округлых клеток, которые присутствовали внутри синусоидоподобных пространств в TC и IM, а также были связаны со стромой (рис. 5B). В области ОМ и ПТ клетки NKp46+ наблюдались в капсулах вокруг опухолевых гнезд и в строме портальных трактов. CD1a-белок был обнаружен в TC и IM, преимущественно в цитоплазматической мембране округлых клеток (рассеянных или в агрегатах) в строме, внутри и вдоль границ синусоидоподобных пространств (рис. 5C). В области ПТ CD1a+ DC наблюдался внутри и вдоль границ синусоид и в пределах билиарного эпителия в портальных трактах. ФП тучных клеток была значительно больше, чем ФП NKp46+ клеток (p < 0,001) (рис. 6). CD1a+ iDC в каждом ROI показали самую низкую AF по сравнению с тучными клетками и NK-клетками (p < 0,001) (рис. 6). ФП клеток CD117+ и NKp46+ в TC или IM была значительно меньше, чем в области PT и OM (p < 0,001) (рис. 6). Для CD1a+ клеток ФП существенно не различалась между регионами. Значимые ассоциации отдельных иммунных клеток между всеми ROI показаны в таблице 3. На рисунке 7 показана тепловая карта значимых ассоциаций между различными иммунными клетками в разных регионах. ФП CD117+ тучных клеток в ТК достоверно коррелировала с ФП CD1a в ТК и ИМ. Прогностическое значение клинических и патологических переменныхСреди клинических и патологических переменных только более молодой возраст был связан с более высоким риском рецидива (ОР = 0,96, ДИ: 0,93-0,99, p = 0,007), в то время как ни одна переменная не была связана с СДС и ОВ (Таблица 4). Прогностические значения инфильтрирующих иммунных клетокВысокая ФП CD117+ тучных клеток при ИМ ассоциировалась с более длительным ДФС (ОР = 0,48, ДИ: 0,241 – 0,935, p = 0,031) и ОВ (ОР = 0,34, ДИ: 0,167 – 0,703, p = 0,004) (рис. 8, табл. 5). Кроме того, высокая ФП CD117+ тучных клеток в области ПТ ассоциировалась с более длительной СДС (ОР = 0,48, ДИ: 0,247 – 0,945, р = 0,034) (рис. 8, табл. 5). Напротив, ФП iDC и NK-клеток не были связаны ни с одним из исходов. Тучные клетки CD117+ во внутреннем крае сохраняли значимые ассоциации с DFS (HR = 0,46, CI: 0,23-0,91, p = 0,027) и OS (HR = 0,33, CI: 0,16-0,68, p = 0,003) после поправки на стадию TNM (табл. 6). Что касается тучных клеток в области ПТ, то связь с ДФС также оставалась значимой (HR = 0,47, ДИ: 0,24-0,93, p = 0,029) (табл. 6). Рисунок 1: Репрезентативная схема для методов. Принципиальная схема хода работ по выявлению прогностической роли тучных клеток, дендритных клеток и естественных киллеров при ГЦК. Сокращения: FFPE, формалин-фиксированный парафин; H&E, гематоксилин и эозин; ROI, регионы интересов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Скриншот окна программы. Описательный скриншот, показывающий шаг импорта изображений в проект в программном обеспечении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Скриншот опции доли площади. Скриншот из программного обеспечения, показывающий выбранные параметры для количественной оценки доли площади положительного окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 4: Скриншот опции классификации пикселей. Скриншот из программного обеспечения, показывающий DAB-положительные ячейки до и после классификации пикселей. Коричневатое окрашивание DAB было преобразовано в красный цвет после классификации пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5: Репрезентативное иммуноокрашивание клеток врожденного иммунитета у пациентов с ГЦК. Репрезентативное иммуноокрашивание (A) CD117+, (B) NKp46+ и (C) CD1a+ клеток в TC (400x) и TIM (200x) ГЦК. Сокращения: ГЦК, гепатоцеллюлярная карцинома; ТК, опухолевый центр; TIM, инвазивный край опухоли, с внутренним краем (IM) и наружным краем (OM). Пунктирная линия представляет собой границу между опухолью и неопухолевой тканью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 6: Статистические данные, описывающие долю клеток врожденного иммунитета в области у пациентов с ГЦК. Статистические данные для доли площади CD1a+ дендритных клеток, CD117+ тучных клеток и NKp46+ NK-клеток) в зонах TC, IM, OM и PT ГЦК. Черные линии — это медианы. Для сравнения использовался тест сопоставленных пар Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Сокращения: ГЦК, гепатоцеллюлярная карцинома; ТК, опухолевый центр; IM, внутреннее поле; OM, наружное поле; ПТ, периопухолевая область. : p <0.001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 7: Тепловая карта значимых корреляций между фракциями площади тучных ячеек, ДК и NK в различных областях интереса. Тепловая карта значимых корреляций между фракциями площади тучных клеток CD117+, CD1a+ DC и NKp46+NK в TC, IM, OM и PT (Spearman ρ, p < 0,05). Сокращения: TC – опухолевый центр; IM, внутреннее поле; OM, наружное поле; ПТ, периопухолевая область; ДК, дендритные клетки; NK, естественные клетки-киллеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 8: Кривые DFS и OS Каплана-Мейера для инфильтрирующих опухоль тучных клеток у пациентов с ГЦК. Анализ СДС и ОВ по методу Каплана-Мейера в зависимости от низкой и высокой ФП инфильтрирующих опухоль тучных клеток во внутреннем крае (А, С) и ПТ (В) ГЦК. Сокращения: ГЦК, гепатоцеллюлярная карцинома; DFS, безрецидивная выживаемость; ИМ, внутренний инвазивный; ПТ, периопухолевая область. Рисунок был адаптирован с разрешения Ali et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Таблица 1: Клинический фон включенных пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой. Клинический фон зарегистрированных случаев гепатоцеллюлярной карциномы. Сокращения: НАЖБП, неалкогольная жировая болезнь печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 2: Оценка вероятности исходов в анализе Каплана-Мейера. Оценка вероятности RFP, DFS и OS в анализе Каплана-Мейера. Сокращения: RFP, безрецидивная пропорция; DFS, безрецидивная выживаемость; OS, общая выживаемость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 3: Корреляция между долей площади инфильтрирующих опухоль тучных клеток, дендритных клеток и естественных клеток-киллеров в различных ROI. Корреляция Спирмена (ρ) между долей площади инфильтрирующих опухоль тучных клеток, дендритных клеток и естественных киллеров в различных ROI, p < 0,038. Сокращения: TC – опухолевый центр; IM, внутреннее поле; OM, наружное поле; ПТ, периопухолевая область; ROI, регионы интересов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 4: Однофакторный анализ клинических и патологических переменных, связанных со временем до рецидива (TTR), безрецидивной выживаемостью (DFS) и общей выживаемостью (OS). Нет», женский пол или «А» были эталонными категориями для дихотомических переменных. Жирные значения указывают на статистическую значимость на уровне p < 0,05. Сокращения: HR, отношение рисков; ДИ — доверительный интервал; TTR — время до рецидива; DFS, безрецидивная выживаемость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 5: Однофакторный анализ ассоциации доли площади CD117+ тучных клеток, CD1a+дендеритных клеток и NKp46+естественных клеток-киллеров с TTR, DFS и OS для каждой отдельной области интереса с использованием регрессии Кокса (67 пациентов с ГЦК). Доля площади иммунных клеток на участок площади (мм2) была преобразована в процентили, а затем разделена на низкую (0-25 процентиль) и высокую (25-100 процентиль). Отношения рисков показывают относительный риск по сравнению с 1 для низкой ФП. Жирные значения указывают на статистическую значимость на уровне p < 0,05. Сокращения: AF, доля площади; DFS, безрецидивная выживаемость; ОС, общая выживаемость; HR, отношение рисков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Таблица 6: Доля площади CD117+ тучных клеток на индивидуальную ROI, связанная с безрецидивной выживаемостью и общей выживаемостью (многофакторный анализ). Многофакторный анализ ассоциации площадной фракции тучных клеток CD117+ с ДФС и ОВ в области ИМ и ПТ с использованием регрессии Кокса (67 пациентов с ГЦК). Доля иммунных клеток на участке площади (мм2) была преобразована в процентили, а затем разделена на низкую (0-24 процентиль) и высокую (25-100 процентиль). Отношения рисков показывают относительный риск по сравнению с 1 для низкой ФП. Жирные значения указывают на статистическую значимость на уровне p > 0,05. Сокращения: AF, доля площади; DFS, безрецидивная выживаемость; ОС, общая выживаемость; HR, отношение рисков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Дополнительный файл 1: Скрипт для создания ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

С помощью мониторинга иммунной организации in situ в TME в области иммуноонкологии могут быть добавлены новые прогностические и прогностические биомаркеры рака. Наша ранее опубликованная статья о роли адаптивных иммунных клеток в ТМЭ ГЦК показала положительные прогностические ассоциации CD3+ и CD8+ Т-клеток, а также CD20+ В-клеток в отдельных ROI до момента рецидива2. В данной работе программное обеспечение для анализа изображений QuPath было использовано для оценки обилия CD1a+ iDCs, CD117+ тучных клеток и NKp46+ NK-клеток в нескольких различных областях ГЦК и оценки их прогностической значимости. Из-за неправильной формы некоторых клеток врожденного иммунитета их количественная оценка может быть неточной. Вот почему оценка доли площади иммуноположительных клеток была оптимальным вариантом. Среди трех типов клеток только CD117+ тучные клетки продемонстрировали значительный прогностический эффект: более высокая AF тучных клеток в области IM и PT была связана с более длительной выживаемостью.

Тучные клетки были наиболее распространены во всех ROI, и связь их ФП в области периопухоли и внутреннего края с лучшей выживаемостью отражает противоопухолевую роль тучных клеток. Тучные клетки могут быть привлечены в ТМЭ хемоаттрактантами, высвобождаемыми опухолевыми клетками, такими как SCF или CCL1518. Тучные клетки могут влиять на противоопухолевый ответ путем прямого цитотоксичного воздействия на опухолевые клетки27 или путем секреции провоспалительных цитокинов, которые могут ингибировать рост опухоли18. Повышенная плотность тучных клеток защищала от рецидива рака предстательной железы28, рака желудка27 и ГЦК после трансплантации печени29. Всестороннее исследование, состоящее из более крупной когорты из 245 пациентов с ГЦК, обнаружило положительную корреляцию между более значительной инфильтрацией тучных клеток в образцах опухоли и более длительной выживаемостьюпосле резекции опухоли. Rohr-Udilova et al. сообщили об аналогичных результатах увеличения плотности тучных клеток в окружающей ткани ГЦК; Однако только плотность внутриопухолевых тучных клеток была связана с более низкой частотой рецидивов29.

В этом исследовании тучные клетки оказывали противоопухолевое действие только в печени ИМ и ПТ. ТМЭ различных опухолей неоднородна в отношении пространственного распределения иммунных клеток31. Прогностическое значение иммунных клеток в ТМЭ также критически связано с их пространственным распределением 32,33. Были предложены различные подходы к аннотированию инвазивного края опухоли, включая целое поле разной ширины 4,34,35, внутренний и внешний края, опять же с разной шириной36,37, с PT 2,7 или без него. Мы следовали воспроизводимой, стандартизированной методологии Международной рабочей группы по иммуноонкологическим биомаркерам, чтобы определить инвазивный край как область размером 1 мм, центрированную на границе, отделяющей гнезда злокачественных клеток от ткани хозяина, и представляющую центральную опухоль как оставшуюся площадь опухоли38. Поскольку более раннее исследование выявило значительные различия в результатах внутреннего и внешнего инвазивного края2, эти области (каждая шириной 500 мкм) были проанализированы отдельно. Пространственное иммунное профилирование периопухолевой области имеет отчетливое прогностическое значение39,40, в связи с чем была включена и область ПТ.

Анализ ТК, опухолевого края и ПТ печени проводился в WSI в отличие от возможности оценки выбранных полей зрения в соответствующих областях. Визуализация всего слайда является потенциально богатым источником данных41. Поскольку мы не проводили субвыборку, «истинное математическое ожидание» было получено эффективным по времениспособом10. Кроме того, эта система была разумной, потому что анализировались только 1 или 2 слайда на блок, что позволило нам избежать предвзятости выбора патча42. Медленный рабочий процесс поставил перед нами задачу в предыдущем исследовании, когда стереология применялась для количественной оценки иммунных клеток2.

ИГХ позволяет напрямую локализовать экспрессию CD1a+ iDCs, NKp46+NK и CD117+ тучных клеток в ткани печени, количественно оценить их распределение и, следовательно, подклассифицировать когорту. Анализ ИГХ дает этому исследованию важные преимущества по сравнению с биохимическими анализами в солюбилизированных тканях, которые могут привести к ложноотрицательным результатам, когда присутствуют только несколько биомаркер-положительных клеток43 и не отражают регионарную реакцию иммунных клеток на гистопатологические особенности44. ИГХ также предпочтительнее анализа в срезах, окрашенных H&E. Исследования колоректального рака и мелкоклеточного рака легких показали, что оценка окрашенных H&E срезов может обеспечить надежные количественные иммуномаркеры опухоли 45,46,47; Тем не менее, ограничения, отражающие фактическое присутствие конкретных подтипов, все еще присутствуют.

Высокое качество срезов тканей и окрашивание ИГХ является предпосылкой для точной оценки. Высокий фон, краевые артефакты и специфическое, но нежелательное окрашивание (например, окрашивание эндотелиальных клеток синусоидальных пространств печени анти-CD4 антителами) могут испортить все результаты. Антитело к CD56 было первым выбором в текущем исследовании для обнаружения естественных клеток-киллеров, но было заменено антителом NKp46 из-за экспрессии CD56 в незрелых желчных протоках. Выбор наиболее подходящего маркера с точки зрения специфичности, надежного рисунка окрашивания и стабильности в блоках FFPE представляет собой еще один вопрос, который следует учитывать. Например, вместо триптазы был выбран CD117, поскольку экспрессия триптазы может быть сильно подавлена, кроме того, клетки, не экспрессирующие CD117, не являются тучными клетками48.

QuPath дает возможность сгладить границы ROI извне и удалить любые артефакты, крупные сосуды, некротизированную ткань, неспецифическое окрашивание, фон и агрегацию эритроцитов, которые не должны быть частью ROI. Оператору необходимо выбрать ROI и нажать клавишу «Alt» при аннотировании этих артефактов. Неспецифическое окрашивание было исключено в этом исследовании в виде артефактов до количественной оценки, так что оно не повлияло на результаты. В случае систематически низкого специфического окрашивания или высокого фона протокол следует пересмотреть, чтобы избежать возможной систематической ошибки. Порог корректировался для каждого случая со слабым специфическим положительным окрашиванием. Перед любым рутинным использованием протокол должен быть оптимизирован. Все анализы должны проводиться вслепую, и в идеале точность определения пороговых значений заслуживает перекрестной проверки.

QuPath – это удобное в использовании, интуитивно понятное, расширяемое решение с открытым исходным кодом для цифровой патологии и анализа целых слайдовых изображений9, ранее протестированное для анализа изображений при HCC49 и различных видах рака50,51. Основными преимуществами являются простота работы с программным обеспечением для WSI и возможность аннотирования областей интереса (например, опухолевых или перитухолевых областей).

Применение существующих, измененных или созданных заново скриптов может значительно ускорить анализ. Был применен скрипт для создания аннотаций для ROI, что позволило быстро и точно сегментировать регионы вместо ручного разграничения. Скрипт не является фиксированным и может быть легко настроен на поля менее 500 мкм для областей с недостаточным количеством границ тканей. Ширину области IM, OM или PT можно настроить с помощью редактора скриптов Automate > Show > адаптации строки 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm к доступной ширине > Run. Окупаемость инвестиций также может быть добавлена или удалена. В целом, рабочие процессы в программном обеспечении не являются фиксированными, и оператор волен их разрабатывать и модифицировать.

В настоящее время доступно множество доступных программных инструментов для анализа патологических изображений, включая CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser и другие. Тем не менее, QuPath отличается набором преимуществ, таких как архитектура с открытым исходным кодом, удобный интерфейс, возможности настройки алгоритмов и интеграция передовых инструментов машинного обучения. Эти функции в совокупности позиционируют данное программное обеспечение для анализа изображений как надежный выбор для детального анализа раковых тканей в области цифровой патологии.

QuPath показал наименьшую вариабельность по сравнению с коммерческим программным обеспечением HALO (IndicaLab) и QuantCenter (3DHistech) для выявления экспрессии Ki67 при раке молочной железы52. Программное обеспечение также обладает потенциалом для запуска сценария для всех изображений проекта в воспроизводимой пакетной обработке.

QuPath позволил нам создавать количественные непрерывные данные вместо порядковых (полуколичественных). Порядковые данные, полученные с помощью визуальной оценки, сопряжены с проблемами из-за субъективности интерпретации, вариабельности между наблюдателями и плохой воспроизводимости53. Оперативность текущего анализа была повышена за счет того, что лица без обширного опыта в области гистопатологии и программирования могут выполнять автоматический анализ при условии, что точность аннотаций была проверена патологоанатомом. Исследование опухолей головы и шеи продемонстрировало пригодность QuPath для быстрой и воспроизводимой оценки прогностической ценности CD57+ инфильтрирующих опухоль лимфоцитов50. Исследование также показало существенное соответствие между наблюдателями-людьми и QuPath. Высокая степень соответствия между ручным наблюдением и оценкой с использованием QuPath также была продемонстрирована при раке полости рта54 и раке молочной железы55. В вышеупомянутой статье сравнивали количественную оценку ИГХ 5 клинических биомаркеров рака молочной железы с использованием QuPath и 2 коммерческих программных продуктов (Definiens Tissue Studio и inForm) с ручной оценкой патологоанатомом. На протяжении всего этого исследования QuPath неизменно демонстрировал наилучшую производительность, а также наименьшее время на настройку и применение, тем самым показав себя отличной будущей альтернативой визуальному мониторингу и коммерческому программному обеспечению. Даже по сравнению с ImageJ, самым известным программным обеспечением с открытым исходным кодом для биомедицинского анализа изображений, QuPath превосходно справляется с WSIбольшого размера 56.

Для QuPath существует открытый онлайн-форум, где пользователи задают свои вопросы о методах цифровой патологии и представляют активное и заинтересованное сообщество для поддержки разработки инструментов для анализа изображений (https://forum.image.sc/tag/qupath).

Когорта, использованная в этом исследовании, была уникальной и не была репрезентативной для общей популяции с ГЦК, поскольку она охватывала только пациентов, которым была показана резекция печени. Как правило, меньшинство пациентов с ГЦК (20%-30%) имеют право на резекцию печени57. Это также может быть причиной того, что у меньшего числа пациентов был подтвержден цирроз печени, потому что пациенты с этой этиологией ГЦК, вероятно, имели более высокие баллы по шкале Чайлд-Пью и не считались резектабельными. Когорта также была довольно небольшой, и у большинства пациентов наблюдались ранние стадии заболевания TNM. Поэтому экстраполяцию результатов на другие популяции следует проводить с осторожностью.

В текущем исследовании обилие клеток врожденного иммунитета в микроокружении ГЦК было оценено путем оценки их ФП, поскольку точный подсчет иммунных клеток неправильной формы, таких как дендритные клетки, может оказаться затруднительным. С другой стороны, доля площади иммунных клеток обычно сильно коррелирует с их плотностью58. Мечение иммунопероксидазы дает данные о локализации антигена, фракции площади или плотности клеток, которые его экспрессируют, но интенсивность окрашивания нелинейно связана с количеством антигена. Поэтому ИГХ не следует использовать для количественной оценки уровня экспрессии того или иного белка. Точность метода также зависит от равномерности толщины сечения, качества изображения и выбранного разрешения для классификации пикселей. Любые результаты анализа изображений должны быть проверены и относиться к ним с осторожностью. Поскольку один маркер не может полностью охватить всю сложность иммунных клеток, необходимо больше маркеров ИГХ и мультиплексное окрашивание для получения достоверной картины иммунной ТМЭ ГЦК. Использование только одного маркера ИГХ для фенотипирования иммунных клеток представляет собой приближение, и результаты следует интерпретировать с осторожностью.

Использование программного обеспечения для анализа изображений QuPath для оценки ИГХ-окрашенных стекол позволило нам оценить распределение и долю площади локальных ИДК, тучных клеток и NK в опухолях и периопухолях пациентов с ГЦК, а затем проанализировать их связь с прогнозом. Обилие тучных клеток во внутреннем крае и периопухолевой печени ГЦК связано с более длительными DFS и OS, что подчеркивает противоопухолевые эффекты этих клеток врожденного иммунитета. Аналитический рабочий процесс QuPath удобен для пользователя, быстр и прост в использовании, с полезными настройками по умолчанию и простым экспортом данных. Это программное обеспечение было одобрено как перспективная платформа для анализа цифровых изображений, которая может удовлетворить потребность в воспроизводимости, согласованности и точности в цифровой патологии.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы выражаем признательность монсеньору Ондржею Шебесте (Центр микроскопии Виничны, факультет естественных наук, Карлов университет) за его вклад в сканирование всего предметного стекла и за проект «e-Infrastruktura CZ» (e-INFRA LM2018140), который предоставил нам вычислительные ресурсы для этого исследования. Технические специалисты Яна Досудилова и Ян Явурек получили высокую оценку за их превосходную техническую помощь. Это исследование финансировалось в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020, грант N°856620, грант Министерства здравоохранения Чешской Республики AZV NU21-03-00506, а также программа Cooperatio (хирургические дисциплины). Основная микроскопическая установка Vinicna софинансируется крупным проектом Czech-BioImaging RI LM2023050.

Materials

Anti-CD1a Leica Biosystems PA0235 Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
Anti-CD117 Leica Biosystems  PA0007 Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
BOND Plus Microscope Slides Leica Biosystems, Germany S21.2113.A
BOND RXm Leica Biosystems 49.1501 Fully Automated IHC Stainer  
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit Leica Biosystems CS9100
Bond Dewax Solution Leica Biosystems AR9222
Bond Polymer Refine Detection Kit Leica Biosystems DS9800
BondTM Epitope Retrieval 2 Leica Biosystems AR9640
BondTM Primary Antibody Diluent Leica Biosystems AR9352
BondTM Wash Solution 10X Concentrate Leica Biosystems AR9590
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz Installed RAM: 128 G Intel A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available
Coverslips Leica Biosystems, Germany 14071135636
CV Mount Leica Biosystems, Germany 14046430011
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper Leica Biosystems 149CVTS5025
Drying Oven UN30 Memmert GmbH  UN30
GraphPad Prism 9.0 GraphPad Software LLC  Version 12
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 R&D Systems, Inc., United States MAB1850 Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 – Water Bath Leica Biosystems 14041521466
Protein Block Agilent Dako, United States X0909
QuPath 0.3.2 or higher versions  version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 Rotary Microtome Leica Biosystems 149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Slide Stainer Leica Biosystems DEV-ST5010-CV5030
Statistica StatSoft Inc. version 7
Zeiss Axio Scan.Z1 ScienceServices GmbH, Germany 430038-9000-000  Slide scanner 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Du, M., Yin, Y. L., Xiao, L., Cai, Y. M., Ji, Y. Evaluating tumor-infiltrating lymphocytes in hepatocellular carcinoma using hematoxylin and eosin-stained tumor sections. World J Clin Cases. 10 (3), 856-869 (2022).
  2. Trailin, A., et al. T-and B-cells in the inner invasive margin of hepatocellular carcinoma after resection associate with favorable prognosis. Cancers (Basel). 14 (3), 604 (2022).
  3. Xiao, N., et al. CD74+ macrophages are associated with favorable prognosis and immune contexture in hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 71 (1), 57-69 (2022).
  4. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  5. Roxburgh, C. S. D., Salmond, J. M., Horgan, P. G., Oien, K. A., McMillan, D. C. Tumour inflammatory infiltrate predicts survival following curative resection for node-negative colorectal cancer. Eur J Cancer. 45 (12), 2138-2145 (2009).
  6. Klintrup, K., et al. Inflammation and prognosis in colorectal cancer. Eur J Cancer. 41 (17), 2645-2654 (2005).
  7. Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, e36967 (2018).
  8. Cho, J. Basic immunohistochemistry for lymphoma diagnosis. Blood Res. 57 (S1), 55-61 (2022).
  9. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878 (2017).
  10. Kolinko, Y., et al. Using virtual microscopy for the development of sampling strategies in quantitative histology and design-based stereology. Anat Histol Embryol. 51 (1), 3-22 (2022).
  11. Rodrigues, A., et al. Computer-assisted tumor grading, validation of PD-L1 scoring, and quantification of CD8-positive immune cell density in urothelial carcinoma, a visual guide for pathologists using QuPath. Surg Exp Pathol. 5, 12 (2022).
  12. Hein, A. L., et al. QuPath digital immunohistochemical analysis of placental tissue. J Pathol Inform. 12, 40 (2021).
  13. Lichterman, J. N., Reddy, S. M. Mast cells: A new frontier for cancer immunotherapy. Cells. 10 (6), 1270 (2021).
  14. Veglia, F., Gabrilovich, D. I. Dendritic cells in cancer: the role revisited. Curr Opin Immunol. 45, 43-51 (2017).
  15. Wu, S. -. Y., Fu, T., Jiang, Y. -. Z., Shao, Z. -. M. Natural killer cells in cancer biology and therapy. Mol Cancer. 19 (1), 120 (2020).
  16. Kai, K., et al. Immunohistochemical analysis of the aggregation of CD1a-positive dendritic cells in resected specimens and its association with surgical outcomes for patients with gallbladder cancer. Transl Oncol. 14 (1), 100923 (2021).
  17. Minesaki, A., Kai, K., Kuratomi, Y., Aishima, S. Infiltration of CD1a-positive dendritic cells in advanced laryngeal cancer correlates with unfavorable outcomes post-laryngectomy. BMC Cancer. 21 (1), 973 (2021).
  18. Komi, D. E. A., Redegeld, F. A. Role of mast cells in shaping the tumor microenvironment. Clin Rev Allergy Immunol. 58 (3), 313-325 (2020).
  19. Maltby, S., Khazaie, K., McNagny, K. M. Mast cells in tumor growth: Angiogenesis, tissue remodelling and immune-modulation. Biochim Biophys Acta. 1796 (1), 19-26 (2009).
  20. Gooch, J. L., Lee, A. V., Yee, D. Interleukin 4 inhibits growth and induces apoptosis in human breast cancer cells. Cancer Res. 58 (18), 4199-4205 (1998).
  21. Brockmeyer, P., et al. High mast cell density indicates a longer overall survival in oral squamous cell carcinoma. Sci Rep. 7 (1), 14677 (2017).
  22. Lee, H. A., et al. Natural killer cell activity is a risk factor for the recurrence risk after curative treatment of hepatocellular carcinoma. BMC Gastroenterol. 21 (1), 258 (2021).
  23. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  24. Barrow, A. D., Martin, C. J., Colonna, M. The natural cytotoxicity receptors in health and disease. Front Immunol. 10, 909 (2019).
  25. Guan, X., et al. Tumor-associated NK cells facilitate tumor growth via NKp46 in immunocompetent murine hepatocellular carcinoma. Immunol Lett. 258, 8-19 (2023).
  26. Ali, E., et al. Prognostic role of macrophages and mast cells in the microenvironment of hepatocellular carcinoma after resection. BMC Cancer. 24 (1), 142 (2024).
  27. Lin, C., et al. Tryptase expression as a prognostic marker in patients with resected gastric cancer. Br J Surg. 104 (8), 1037-1044 (2017).
  28. Hempel, H. A., et al. Low intratumoral mast cells are associated with a higher risk of prostate cancer recurrence. Prostate. 77 (4), 412-424 (2017).
  29. Rohr-Udilova, N., et al. Morphometric analysis of mast cells in tumor predicts recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation. Hepatol Commun. 5 (11), 1939-1952 (2021).
  30. Lin, S. Z., et al. Prediction of recurrence and survival in hepatocellular carcinoma based on two cox models mainly determined by FoxP3+ regulatory T cells. Cancer Prev Res. 6 (6), 594-602 (2013).
  31. Jia, Q., Wang, A., Yuan, Y., Zhu, B., Long, H. Heterogeneity of the tumor immune microenvironment and its clinical relevance. Exp Hematol Oncol. 11 (1), 24 (2022).
  32. Pyo, J. -. S., Son, B. K., Lee, H. Y., Oh, I. H., Chung, K. H. Prognostic implications of intratumoral and peritumoral infiltrating lymphocytes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Curr Oncol. 28 (6), 4367-4376 (2021).
  33. Yusa, T., et al. Survival impact of immune cells infiltrating peritumoral area of hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. 113 (12), 4048-4058 (2022).
  34. Halama, N., et al. Localization and density of immune cells in the invasive margin of human colorectal cancer liver metastases are prognostic for response to chemotherapy. Cancer Res. 71 (17), 5670-5677 (2011).
  35. Zwing, N., et al. Analysis of spatial organization of suppressive myeloid cells and effector T cells in colorectal cancer-A potential tool for discovering prognostic biomarkers in clinical research. Front Immunol. 11, 550250 (2020).
  36. Soeratram, T. T. D., et al. Prognostic value of T-cell density in the tumor center and outer margins in gastric cancer. Mod Pathol. 36 (9), 100218 (2023).
  37. Gonzàlez-Farré, M., et al. Characterization and spatial distribution of the immune cell infiltrate in triple-negative breast cancer: a novel classification based on plasma cells and CD8+ T cells. Hum Pathol. 139, 91-105 (2023).
  38. Hendry, S., et al. Assessing tumor-infiltrating lymphocytes in solid tumors: A practical review for pathologists and proposal for a standardized method from the International Immunooncology Biomarkers Working Group: Part 1: Assessing the host immune response, TILs in invasive breast carcinoma and ductal carcinoma in situ, metastatic tumor deposits and areas for further research. Adv Anat Pathol. 24 (5), 235-251 (2017).
  39. Brück, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Mod Pathol. 34 (12), 2229-2241 (2021).
  40. Knebel, M., et al. Prognostic impact of intra- and peritumoral immune cell subpopulations in head and neck squamous cell carcinomas – comprehensive analysis of the TCGA-HNSC cohort and immunohistochemical validation on 101 patients. Front Immunol. 14, 1172768 (2023).
  41. Lee, S., et al. Interactive classification of whole-slide imaging data for cancer researchers. Cancer Res. 81 (4), 1171-1177 (2021).
  42. Ciga, O., et al. Overcoming the limitations of patch-based learning to detect cancer in whole slide images. Sci Rep. 11 (1), 8894 (2021).
  43. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
  44. Masuda, S., Nakanishi, Y. Application of immunohistochemistry in clinical practices as a standardized assay for breast cancer. Acta Histochem Cytochem. 56 (1), 1-8 (2023).
  45. Matsutani, S., et al. Tumor-infiltrating immune cells in H&E-stained sections of colorectal cancer tissue as a reasonable immunological biomarker. Anticancer Res. 38 (12), 6721-6727 (2018).
  46. Väyrynen, J. P., et al. Prognostic significance of immune cell populations identified by machine learning in colorectal cancer using routine hematoxylin and eosin-stained sections. Clin Cancer Res. 26 (16), 4326-4338 (2020).
  47. Zhou, G., et al. Clinical significance of tumor-infiltrating lymphocytes investigated using routine H&E slides in small cell lung cancer. Radiat Oncol. 17 (1), 127 (2022).
  48. Horny, H. -. P., Sotlar, K., Valent, P. Mastocytosis. Immunol Allergy Clin North Am. 34 (2), 315-321 (2014).
  49. Mi, H., Ho, W. J., Yarchoan, M., Popel, A. S. Multi-scale spatial analysis of the tumor microenvironment reveals features of cabozantinib and nivolumab efficacy in hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 892250 (2022).
  50. de Ruiter, E. J., et al. Assessing the prognostic value of tumor-infiltrating CD57+ cells in advanced stage head and neck cancer using QuPath digital image analysis. Virchows Archiv. 481 (2), 223-231 (2022).
  51. Fanucci, K. A., et al. Image analysis-based tumor infiltrating lymphocytes measurement predicts breast cancer pathologic complete response in SWOG S0800 neoadjuvant chemotherapy trial. NPJ Breast Cancer. 9 (1), 38 (2023).
  52. Acs, B., et al. Ki67 reproducibility using digital image analysis: an inter-platform and inter-operator study. Lab Invest. 99 (1), 107-117 (2019).
  53. Sobottka, B., et al. Establishing standardized immune phenotyping of metastatic melanoma by digital pathology. Lab Invest. 101 (12), 1561-1570 (2021).
  54. Moratin, J., et al. Digital pathology scoring of immunohistochemical staining reliably identifies prognostic markers and anatomical associations in a large cohort of oral cancers. Front Oncol. 11, 712944 (2021).
  55. Bankhead, P., et al. Integrated tumor identification and automated scoring minimizes pathologist involvement and provides new insights to key biomarkers in breast cancer. Lab Invest. 98 (1), 15-26 (2018).
  56. Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Comput Struct Biotechnol J. 19, 852-859 (2021).
  57. Koh, J. H., et al. Liver resection versus liver transplantation for hepatocellular carcinoma within Milan criteria: a meta-analysis of 18,421 patients. Hepatobiliary Surg Nutr. 11 (1), 78-93 (2022).
  58. Eriksen, A. C., et al. Computer-assisted stereology and automated image analysis for quantification of tumor infiltrating lymphocytes in colon cancer. Diagn Pathol. 12 (1), 65 (2017).

Tags

Mast CellsHepatocellular CarcinomaImmune CellsPrognosisQuPathImage AnalysisDendritic CellsNatural Killer CellsTime To RecurrenceDisease-free SurvivalOverall Survival

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ali, E., Červenková, L., Pálek, R., Ambrozkiewicz, F., Pavlov, S., Ye, W., Hošek, P., Daum, O., Liška, V., Hemminki, K., Trailin, A. Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software. J. Vis. Exp. (206), e66743, doi:10.3791/66743 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image