Mastzellen in der Mikroumgebung des hepatozellulären Karzinoms bieten günstige Prognose: Eine retrospektive Studie mit der Bildanalysesoftware QuPath

Durch die Überwachung der in situ Immunorganisation bei TME kann der Bereich der Immunonkologie neue krebsprognostische und prädiktive Biomarker hinzufügen. Unsere zuvor veröffentlichte Arbeit zur Rolle adaptiver Immunzellen in der TME von HCC zeigte positive prognostische Assoziationen von CD3+ und CD8+ T-Zellen sowie CD20+ B-Zellen in ausgewählten ROIs bis zum Zeitpunkt des Rezidivs². Hier wurde die Bildanalysesoftware QuPath verwendet, um die Häufigkeit von CD1a+ iDCs, CD117+ Mastzellen und NKp46+ NK-Zellen in mehreren verschiedenen Regionen des HCC zu beurteilen und ihre prognostische Bedeutung zu bewerten. Aufgrund der unregelmäßigen Formen einiger angeborener Immunzellen kann ihre Quantifizierung ungenau sein. Aus diesem Grund war die Bewertung des Flächenanteils immunpositiver Zellen die optimale Option. Von den drei Zelltypen zeigten nur CD117+-Mastzellen einen signifikanten prognostischen Einfluss: Ein höheres Vorhofflimmern von Mastzellen im IM- und PT-Bereich war mit einem längeren Überleben verbunden.

Mastzellen waren bei allen ROIs am häufigsten, und die Assoziation ihres Vorhofflimmerns im Peritumorbereich und am inneren Rand mit einem besseren Überleben spiegelt die Anti-Tumor-Rolle von Mastzellen wider. Mastzellen können durch tumorzellfreigesetzte Chemolockstoffe wie SCF oder CCL15¹⁸ in die TME gelockt werden. Mastzellen können die Anti-Tumor-Reaktion beeinflussen, indem sie Tumorzellen direkt zytotoxisch behandeln²⁷ oder indem sie entzündungsfördernde Zytokine sezernieren, die das Tumorwachstum hemmen können¹⁸. Eine erhöhte Mastzelldichte schützte vor dem Wiederauftreten von Prostatakrebs²⁸, Magenkrebs²⁷ und HCC nach Lebertransplantation²⁹. Eine umfassende Untersuchung, bestehend aus einer größeren Kohorte von 245 HCC-Patienten, fand eine positive Korrelation zwischen einer signifikanteren Mastzellinfiltration in Tumorproben und einem längeren Überleben nach Tumorresektion³⁰. Rohr-Udilova et al. berichteten über ähnliche Ergebnisse von höheren Dichten von Mastzellen im umgebenden HCC-Gewebe; Allerdings war nur die intratumorale Mastzelldichte mit einer niedrigeren Rezidivrate assoziiert²⁹.

In dieser Studie übten Mastzellen nur in der IM- und PT-Leber eine Anti-Tumor-Wirkung aus. Die TME verschiedener Tumoren ist hinsichtlich der räumlichen Verteilung der Immunzellen heterogen³¹. Die prognostische Bedeutung von Immunzellen bei TME hängt auch entscheidend mit ihrer räumlichen Verteilung zusammen^32,33. Es wurden verschiedene Ansätze zur Annotation des tumorinvasiven Randes vorgeschlagen, darunter ein ganzer Rand mit unterschiedlichen Breiten ^4,34,35, Innen- und Außenrand, wiederum mit unterschiedlichen Breiten^36,37, mit oder ohne PT ^2,7. Wir folgten der reproduzierbaren, standardisierten Methodik der International Immunooncology Biomarkers Working Group, um den invasiven Rand als eine 1 mm Region zu definieren, die auf der Grenze zentriert ist, die die malignen Zellnester vom Wirtsgewebe trennt und den zentralen Tumor als verbleibenden Tumorbereich darstellt³⁸. Da die frühere Studie signifikante Unterschiede in den Ergebnissen des inneren und äußeren invasiven Randes² aufzeigte, wurden diese Regionen (jeweils 500 μm Breite) separat analysiert. Das räumliche Immunprofiling des Peritumorbereichs hat seine ausgeprägte prädiktive Bedeutung^39,40, weshalb auch das PT-Areal einbezogen wurde.

Die Analyse von TC, Tumorrand und PT-Leber wurde in WSIs durchgeführt, im Gegensatz zur Möglichkeit, ausgewählte Sichtfelder in den jeweiligen Regionen zu evaluieren. Die Bildgebung ganzer Objektträger ist eine potenziell reichhaltige Datenquelle⁴¹. Da wir keine Subsampling durchgeführt haben, wurde der “wahre Erwartungswert” auf zeiteffiziente Weise ermittelt¹⁰. Darüber hinaus war dieses System sinnvoll, da nur 1 oder 2 Folien pro Block analysiert wurden, was es uns ermöglichte, den Bias der Patch-Auswahl⁴² zu vermeiden. Der langsame Arbeitsablauf stellte uns in der vorherigen Studie vor eine Herausforderung, als die Stereologie zur Quantifizierung von Immunzellen angewendet wurde².

IHC ermöglicht die direkte Lokalisierung der Mastzellexpression von CD1a+, NKp46+NK und CD117+ im Lebergewebe, die Quantifizierung ihrer Verteilungen und damit die Unterklassifizierung der Kohorte. Die IHC-Analyse gibt dieser Studie wichtige Vorteile gegenüber biochemischen Assays in solubilisiertem Gewebe, die zu falsch negativen Ergebnissen führen können, wenn nur wenige Biomarker-positive Zellen vorhanden sind⁴³ und die regionale Reaktion von Immunzellen auf histopathologische Merkmale nicht widerspiegeln⁴⁴. Die IHC ist auch der Analyse in H&E-gefärbten Schnitten vorzuziehen. Studien zu Darmkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs zeigten, dass die Beurteilung von H&E-gefärbten Schnitten robuste, quantitative Tumor-Immun-Biomarker liefern könnte 45,46,47; Es gibt jedoch nach wie vor Einschränkungen, um das tatsächliche Vorhandensein bestimmter Subtypen widerzuspiegeln.

Eine hohe Qualität der Gewebeschnitte und der IHC-Färbung ist Voraussetzung für eine genaue Beurteilung. Hoher Hintergrund, Kantenartefakte und spezifische, aber unerwünschte Färbungen (z. B. Färbung von Endothelzellen der sinusförmigen Leberräume mit Anti-CD4-Antikörpern) können alle Ergebnisse verfälschen. Ein CD56-Antikörper war in der aktuellen Studie die erste Wahl zum Nachweis natürlicher Killerzellen, wurde aber aufgrund der Expression von CD56 in unreifen Gallengängen durch den NKp46-Antikörper ersetzt. Die Auswahl des am besten geeigneten Markers in Bezug auf Spezifität, robustes Färbemuster und Stabilität in FFPE-Blöcken stellt ein weiteres zu berücksichtigendes Thema dar. Zum Beispiel wurde CD117 anstelle von Tryptase gewählt, weil die Tryptase-Expression stark herunterreguliert sein kann, außerdem sind Zellen, die CD117 nicht exprimieren, keine Mastzellen⁴⁸.

QuPath bietet die Möglichkeit, die Grenzen des ROI von außen zu glätten und Artefakte, große Gefäße, nekrotisches Gewebe, unspezifische Färbungen, Hintergründe und Aggregationen von Erythrozyten zu entfernen, die nicht Teil des ROI sein sollten. Der Bediener muss den ROI auswählen und die “Alt”-Taste drücken, während er diese Artefakte kommentiert. Unspezifische Färbungen wurden in dieser Studie als Artefakte vor der Quantifizierung eliminiert, so dass sie die Ergebnisse nicht beeinflussten. Im Falle einer systematisch niedrigen spezifischen Färbung oder eines hohen Hintergrunds sollte das Protokoll überprüft werden, um mögliche Verzerrungen zu vermeiden. Der Schwellenwert wurde für jeden Fall mit einer schwachen spezifischen positiven Färbung angepasst. Vor jedem routinemäßigen Einsatz sollte das Protokoll optimiert werden. Alle Analysen sollten blind durchgeführt werden, und im Idealfall verdient die Genauigkeit der Schwellenwertbestimmung eine Gegenprüfung.

QuPath ist eine benutzerfreundliche, intuitive, erweiterbare Open-Source-Lösung für die digitale Pathologie und die Analyse ganzer Objektträger⁹, die zuvor für die Bildanalyse bei HCC⁴⁹ und verschiedenen Krebsarten^{getestet wurde 50,51}. Die einfache Bedienung der Software für WSIs und die Möglichkeiten zur Annotation von Regionen von Interesse (z.B. tumorale oder peritumorale Areale) sind die Hauptvorteile.

Die Anwendung vorhandener, modifizierter oder de novo erstellter Skripte kann die Analyse erheblich beschleunigen. Es wurde das Skript zur Erstellung von Annotationen für ROIs angewendet, das eine schnelle und genaue regionale Segmentierung anstelle einer manuellen Abgrenzung ermöglichte. Das Skript ist nicht festgelegt und kann für Regionen mit unzureichenden Gewebegrenzen problemlos auf Ränder von weniger als 500 μm angepasst werden. Die Breite des IM-, OM- oder PT-Bereichs kann über den Skripteditor Automate > Show angepasst werden, > die Linie 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm an die verfügbare Breite > Run angepasst wird. ROIs können auch hinzugefügt oder entfernt werden. In der Regel sind die Arbeitsabläufe in der Software nicht festgelegt, und der Bediener ist frei, sie zu entwickeln und zu modifizieren.

Eine Vielzahl verfügbarer Software-Tools für die pathologische Bildanalyse, darunter CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser und andere, sind ab sofort verfügbar. QuPath zeichnet sich jedoch durch eine Reihe von Vorteilen aus, wie z. B. die Open-Source-Architektur, die benutzerfreundliche Oberfläche, die Möglichkeit zur Anpassung von Algorithmen und die Integration fortschrittlicher Tools für maschinelles Lernen. Diese Funktionen machen diese Bildanalysesoftware zu einer robusten Wahl für die nuancierte Analyse von Krebsgeweben im Bereich der digitalen Pathologie.

QuPath zeigte im Vergleich zu den kommerziellen Softwares HALO (IndicaLab) und QuantCenter (3DHistech) die geringste Variabilität für den Nachweis der Ki67-Expression bei Brustkrebs⁵². Die Software verfügt auch über das Potenzial, angewiesen zu werden, ein Skript für alle Projektbilder in einer reproduzierbaren Batch-Verarbeitung auszuführen.

QuPath ermöglichte es uns, quantitative kontinuierliche Daten anstelle von ordinalen (semiquantitativen) Daten zu erstellen. Ordinale Daten, die durch visuelles Scoring gewonnen werden, sind aufgrund der Subjektivität bei der Interpretation, der Variabilität zwischen den Beobachtern und der schlechten Reproduzierbarkeit mit Problemen behaftet⁵³. Die Schnelligkeit der aktuellen Analyse wurde durch die Tatsache verbessert, dass Personen ohne umfangreichen histopathologischen Hintergrund und Programmierkenntnisse automatische Analysen durchführen können, sofern die Genauigkeit der Annotationen von einem Pathologen überprüft wurde. Eine Studie an Kopf-Hals-Tumoren zeigte die Eignung von QuPath für eine schnelle und reproduzierbare Beurteilung des prognostischen Wertes von CD57+-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten⁵⁰. Die Studie zeigte auch eine substanzielle Übereinstimmung zwischen menschlichen Beobachtern und QuPath. Eine hohe Übereinstimmung zwischen manueller Beobachtung und Beurteilung mit QuPath zeigte sich auch bei Mundkrebs⁵⁴ und Brustkrebs⁵⁵. In der oben genannten Arbeit wurde die IHC-Quantifizierung von 5 klinischen Brustkrebs-Biomarkern mit QuPath und 2 kommerziellen Softwareprodukten (Definiens Tissue Studio und inForm) mit einer manuellen Bewertung durch einen Pathologen verglichen. Während dieser Studie zeigte QuPath durchweg die beste Leistung sowie die geringste Zeit für die Einrichtung und Anwendung, was sich als hervorragende zukünftige Alternative zu visueller Überwachung und kommerzieller Software erwies. Selbst im Vergleich zu ImageJ, der bekanntesten Open-Source-Software für die biomedizinische Bildanalyse, zeichnet sich QuPath durch den Umgang mit großformatigen WSIs^{aus 56}.

Es gibt ein offenes Online-Forum für QuPath, in dem Benutzer ihre Fragen zu Methoden der digitalen Pathologie stellen und eine aktive und engagierte Community präsentieren, um die Entwicklung von Werkzeugen für die Bildanalyse (https://forum.image.sc/tag/qupath) zu unterstützen.

Die in dieser Studie verwendete Kohorte war einzigartig und nicht repräsentativ für die Allgemeinbevölkerung mit HCC, da sie nur Patienten umfasste, die für eine Leberresektion in Frage kamen. Im Allgemeinen kommt eine Minderheit der Patienten mit HCC (20 %-30 %) für eine Leberresektion^{in Frage 57}. Dies könnte auch ein Grund dafür sein, dass weniger Patienten eine bestätigte Zirrhose hatten, da Patienten mit dieser Ätiologie des HCC wahrscheinlich höhere Child-Pugh-Werte aufwiesen und nicht als resezierbar galten. Die Kohorte war auch eher klein, und die meisten Patienten hatten ein frühes TNM-Stadium der Krankheit. Daher ist eine Extrapolation der Ergebnisse auf andere Populationen mit Vorsicht zu genießen.

In der aktuellen Studie wurde die Häufigkeit von angeborenen Immunzellen in der HCC-Mikroumgebung durch die Bewertung ihres Vorhofflimmerns abgeschätzt, da sich eine genaue Zählung von unregelmäßig geformten Immunzellen wie dendritischen Zellen als schwierig erweisen kann. Auf der anderen Seite korreliert der Flächenanteil von Immunzellen in der Regel stark mit deren Dichte⁵⁸. Die Immunperoxidase-Markierung liefert Daten für die Lokalisierung des Antigens, den Flächenanteil oder die Dichte der Zellen, die es exprimieren, aber die Intensität der Färbung hängt nicht linear mit der Menge des Antigens zusammen. Daher sollte IHC nicht verwendet werden, um das Expressionsniveau eines bestimmten Proteins quantitativ zu beurteilen. Die Genauigkeit der Methode hängt auch von der Gleichmäßigkeit der Schnittdicke, der Bildqualität und der gewählten Auflösung für die Pixelklassifizierung ab. Alle Ergebnisse der Bildanalyse sollten validiert und mit Vorsicht behandelt werden. Da ein einzelner Marker die Komplexität von Immunzellen nicht vollständig erfassen kann, sind mehr IHC-Marker und Multiplex-Färbung erforderlich, um ein zuverlässiges Bild der Immun-TME von HCC zu erhalten. Die Verwendung von nur einem einzigen IHC-Marker für die Phänotypisierung von Immunzellen stellt eine Annäherung dar, und die Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden.

Die Verwendung der QuPath-Bildanalysesoftware zur Bewertung von IHC-gefärbten Objektträgern ermöglichte es uns, die Verteilung und den Flächenanteil von lokalen iDCs, Mastzellen und NKs in Tumoren und Peritumoren von HCC-Patienten zu beurteilen und dann ihre Beziehungen zur Prognose zu analysieren. Die Häufigkeit von Mastzellen am inneren Rand und in der Peritumorleber von HCC ist mit einem längeren DFS und OS verbunden, was die Anti-Tumor-Wirkung dieser angeborenen Immunzellen unterstreicht. Der analytische Workflow von QuPath ist benutzerfreundlich, schnell und einfach zu bedienen, mit hilfreichen Standardeinstellungen und einfachem Datenexport. Diese Software wurde als vielversprechende Plattform für die digitale Bildanalyse empfohlen, die die Anforderungen an Reproduzierbarkeit, Konsistenz und Genauigkeit in der digitalen Pathologie erfüllen könnte.