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Cancer Research

I mastociti nel microambiente del carcinoma epatocellulare conferiscono una prognosi favorevole: uno studio retrospettivo utilizzando il software di analisi delle immagini QuPath

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66743
, , , , , , , , , ,
1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine,Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 5Sikl’s Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen,Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology,German Cancer Research Center

Summary

La presenza di mastociti nel margine interno e nelle aree peritumorali del carcinoma epatocellulare dopo la resezione conferisce una prognosi favorevole. Questo studio sostiene che il software di analisi delle immagini QuPath è una piattaforma promettente che potrebbe soddisfare le esigenze di riproducibilità, coerenza e accuratezza nella patologia digitale.

Abstract

Le informazioni fornite dal rilevamento in situ delle cellule immunitarie all’interno del carcinoma epatocellulare (HCC) potrebbero presentare informazioni sugli esiti dei pazienti. Gli studi che indagano l’espressione e la localizzazione delle cellule immunitarie all’interno dei tessuti tumorali sono associati a diverse sfide, tra cui la mancanza di un’annotazione precisa per le regioni tumorali e la selezione casuale di campi visivi microscopici. QuPath è un software open source e di facile utilizzo in grado di soddisfare la crescente esigenza di patologia digitale nell’analisi delle immagini dell’intero vetrino (WSI).

L’infiltrazione dell’HCC e dei tessuti adiacenti da parte delle cellule dendritiche immature CD1a+ (iDC), dei mastociti CD117+ e delle cellule natural killer (NK) NKp46+ è stata valutata immunoistochimicamente in campioni rappresentativi di 67 pazienti con HCC sottoposti a resezione curativa. La frazione di area (AF) delle cellule colorate positivamente è stata valutata automaticamente nei WSI utilizzando QuPath nell’area del centro tumorale (TC), del margine interno (IM), del margine esterno (OM) e del peritumore (PT). Il significato prognostico delle cellule immunitarie è stato valutato per il tempo di recidiva (TTR), la sopravvivenza libera da malattia (DFS) e la sopravvivenza globale (OS).

L’AF dei mastociti era significativamente maggiore dell’AF degli NK e l’AF degli iDC era significativamente più bassa rispetto agli NK in ciascuna regione di interesse. Alti AF dei mastociti nelle aree IM e PT erano associati a DFS più lunghi. Inoltre, un’elevata FA dei mastociti nell’IM era associata a una OS più lunga.

L’analisi computerizzata con questo software è uno strumento adatto per ottenere informazioni prognostiche per le cellule immunitarie infiltranti il tumore (iDC, mastociti e NK) in diverse regioni dell’HCC dopo la resezione. I mastociti hanno mostrato la maggiore FA in tutte le regioni di interesse (ROI). I mastociti nella regione peritumorale e nell’IM hanno mostrato un significato prognostico positivo.

Introduction

È stato dimostrato che l’organizzazione spaziale e l’abbondanza di cellule immunitarie infiltranti il tumore influiscono sulla sopravvivenza in diversi tumori, incluso il carcinoma epatocellulare (HCC) 1,2,3,4. Il significato prognostico dei linfociti infiltranti il tumore nei tumori è stato dimostrato per la prima volta nelle sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) 5,6. Quindi, uno studio pionieristico di Galon et al. utilizzando l’immunoistochimica (IHC) ha dimostrato le associazioni delle densità delle cellule T CD3+ e CD8+ nel tessuto del cancro del colon con la prognosi4.

L’IHC è un gold standard per la visualizzazione, la quantificazione e la mappatura delle cellule immunitarie all’interno del tessuto tumorale per un’ulteriore associazione con gli esiti clinici7. L’IHC presenta diversi vantaggi, come il basso costo, l’ampia disponibilità e la compatibilità con i tessuti FFPE (FFPE) fissati in formalina8. Tuttavia, una valutazione accurata delle cellule immunitarie colorate con IHC è una grande sfida. Il punteggio tradizionale in campi visivi microscopici selezionati richiede molto tempo e non è più sufficiente per garantire un’analisi obiettiva di alta qualità, riproducibile e di alta qualità, essenziale per la selezione dei biomarcatori candidati e una correlazione clinica affidabile9. Le scansioni di vetrini interi possono essere valutate come un’intera immagine o dopo il sottocampionamento10.

La valutazione quantitativa computerizzata dell’abbondanza di cellule immunitarie nei campioni di tessuto può garantire dati pratici, accurati, affidabili e clinicamente rilevanti11. QuPath è un software gratuito e open source che consente l’analisi digitale delle immagini di vetrini colorati con IHC e massimizza la quantità di informazioni ottenute dai singoli campioni12.

Poiché le cellule dendritiche immature (iDC), le cellule natural killer (NK) e i mastociti sono coinvolti nelle risposte immunitarie antitumorali e hanno dimostrato di essere correlati con gli esiti dei pazienti 13,14,15, presentiamo qui un protocollo passo-passo per valutare la loro distribuzione spaziale nel tessuto FFPE HCC ed esplorare il loro impatto prognostico. Il CD1a è espresso principalmente sulla membrana delle cellule dendritiche immature, la cui densità è stata associata a esiti clinici in una varietà di tumori umani16,17. I mastociti possono svolgere un ruolo protumorale o antitumorale all’interno del microambiente tumorale (TME)18. Possono supportare l’angiogenesi e facilitare le metastasi19. Al contrario, è stato riportato che i mastociti possono mediare l’apoptosi delle cellule tumorali attraverso la produzione di IL-420. La colorazione anti-CD117 è comunemente usata per visualizzare e quantificare i mastociti all’interno del tessuto tumorale21. Si ritiene che le cellule NK contribuiscano alla sorveglianza e al controllo dell’HCC22 uccidendo le cellule tumorali23. L’espressione di NKp46 da parte di NK è un parametro cruciale per la loro attività antitumorale24. Tuttavia, le cellule NK NKp46+ erano correlate positivamente con il diametro del tumore nei pazienti con HCC25. Nonostante ciò, si sa poco sulla loro correlazione con la sopravvivenza dei pazienti.

Abbiamo mirato a valutare quantitativamente l’abbondanza di iDC CD1a+, mastociti CD117+ e cellule NK NKp46+ in diverse regioni di HCC e ad evidenziare il loro significato prognostico. Un totale di 70 pazienti consecutivi con hcc in stadio I-IV patologicamente confermato, che erano eleggibili per la resezione secondo le linee guida BCLC e sottoposti a resezione epatica con intento curativo presso l’ospedale universitario di Pilsen tra il 1997 e il 2019, sono stati inclusi nell’attuale studio retrospettivo. Sono stati esaminati i referti patologici dei pazienti. Nessuno dei pazienti inclusi in questo studio presentava metastasi a distanza né aveva ricevuto terapia neoadiuvante come la chemioterapia o la radioterapia prima dell’intervento chirurgico. Sono stati esclusi un totale di 3 pazienti con campioni istologici di scarsa qualità e i restanti 67 pazienti sono stati inclusi nello studio (Tabella 1).

Protocol

Questo protocollo faceva parte di uno studio condotto in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki (versione 2013); è stato approvato dal Comitato etico della Facoltà di Medicina e dell’Ospedale universitario di Pilsen (118/2021, 11 marzo 2021). La Figura 1 mostra un riepilogo dei metodi impiegati. 1. Selezione dei blocchi di tessuto FFPE Recupera gli identificatori di blocco FFPE dalle cartelle cliniche dei pazienti con l’aiuto di medici curanti o patologi. Richiedi i blocchi FFPE all’archivio di patologia locale. Per ogni paziente, selezionare 2-3 blocchi FFPE contenenti tessuto tumorale vitale, preferenzialmente con l’area peritumorale circostante e il fegato non tumorale.NOTA: Si consiglia di ottenere il parere di un patologo esperto per questa selezione. La valutazione istologica del fegato non tumorale, insieme a dati anamnetici, clinici e di laboratorio è stata utilizzata per definire l’eziologia sottostante dell’HCC. 2. Deparaffinazione e reidratazione del tessuto FFPE Tagliare una o due sezioni di tessuto di 4 μm di spessore da ciascuno dei blocchi di tessuto FFPE su un microtomo.NOTA: Lo spessore delle sezioni può essere compreso tra 3 μm e 5 μm senza evidenti impatti di macchia; Tuttavia, uno spessore di 4 μm è lo standard. Mettere le sezioni a bagnomaria (42°C) per rimuovere le rughe. Montare i vetrini prelevandoli e posizionandoli su un vetrino microscopico in vetro caricato positivamente. Quindi, applicare le vetrine per l’asciugatura a temperatura ambiente (AT) per 24 ore. Mettere i vetrini in un termostato (56 °C) per 1 ora. Utilizzare un autostainer per deparaffinare le sezioni nella soluzione di decera-1 (30 s a 72 °C), nella soluzione di decera-2 (10 s a 72 °C), nella soluzione di deceratura-3 (10 s ad AT), nell’etanolo 96%-1 (10 s), nell’etanolo 96%-2 (10 s) e nell’etanolo 96%-3 (10 s). Utilizzare un autostainer per reidratare le sezioni nella soluzione di lavaggio-1 (10 s, AT), nella soluzione di lavaggio-2 (10 s, AT) e nella soluzione di lavaggio-3 (5 min, AT). 3. Esecuzione dell’IHC in un coloratore completamente automatizzato NOTA: L’IHC viene eseguito secondo il protocollo del produttore. I passaggi sono brevemente spiegati di seguito. Metodo di recupero dell’antigeneRecuperare l’antigene utilizzando la procedura di recupero dell’epitopo (ER) indotto dal calore in una soluzione ER con un pH elevato (ad es. Tris-EDTA): soluzione ER-1 (10 s, AT), soluzione ER-2 (10 s, AT), soluzione ER-3 (20 min a 100 °C), soluzione ER-4 (12 min, AT). Sciacquare il vetrino in una soluzione di lavaggio per 3 volte (30 s ciascuno) e 1 volta (3 min). Bloccare la perossidasi endogena utilizzando la soluzione di blocco perossido per 5 minuti ad AT. Risciacquare in una soluzione di lavaggio per 3 volte (30 s ciascuno). Bloccare il legame aspecifico degli anticorpi con un blocco proteico per NKp46 solo per 30 minuti ad AT. Legame con gli anticorpi primari: incubare con gli anticorpi primari per 15 minuti ad AT, quindi risciacquare con una soluzione di lavaggio per 3 volte (30 s ciascuno). Per il legame degli anticorpi secondari, seguire i passaggi descritti di seguito.Incubare con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano per 8 minuti ad AT. Risciacquare con una soluzione di lavaggio per 2 volte (2 minuti ciascuno) e 1 volta con acqua deionizzata. Visualizzare la reazione risciacquando i vetrini con la soluzione di diaminobenzidina (DAB) e quindi incubandoli con la soluzione DAB per 10 minuti ad AT. Sciacquare per 3 volte (30 s) con acqua deionizzata. Controcolorare le sezioni con l’ematossilina di Mayer. Sciacquare con acqua deionizzata per 1x (30 s), soluzione di lavaggio per 1x (30 s) e acqua deionizzata per 1x (30 s). Utilizzare un coloratore per vetrini completamente automatizzato per disidratare le sezioni in etanolo 70% (2 min), etanolo 80% (2 min), etanolo 96%-1 (3 min), etanolo 96%-2 (3 min), etanolo 100% (3 min), xilene-1 (4 min), xilene-2 (4 min) e xilene-3 (4 min). Utilizzare un montavetrini in vetro completamente automatizzato per montare le sezioni sui vetrini in un supporto di montaggio.NOTA: Sono stati utilizzati campioni di controllo tissutale negativi e positivi (tonsille). 4. Ottenere scansioni di vetrini interi Scansiona i vetrini colorati utilizzando l’obiettivo 20x e la densità di messa a fuoco moderata-alta su uno scanner per vetrini interi. 5. Analisi IHC utilizzando il software Creare un progetto per le immagini IHC nel software.Scarica e apri QuPath-0.4.3 (o versioni successive).exe Crea una nuova cartella con un nome appropriato. Fare clic sul pulsante Crea progetto nell’angolo in alto a sinistra del software e selezionare la cartella appena creata. Trascinare le immagini scansionate nella finestra del software. Quando viene visualizzata automaticamente una nuova finestra, selezionare Imposta tipo di immagine > H-DAB e fare clic su Importa (Figura 2). Osservare l’elenco delle immagini nella finestra di sinistra del menu; Fare doppio clic per aprire l’immagine. Seleziona dal menu principale in alto File per salvare le immagini come progetto.NOTA: Il software è in grado di gestire un’ampia gamma di formati di immagine, inclusi molti formati di diapositive intere. Tuttavia, il formato tiff è preferito per evitare la perdita di dati grezzi e metadati associati. Annotare le regioni di interesseSeleziona lo strumento Pennello o lo strumento Bacchetta dal menu principale in alto per annotare l’area del tumore. Per le regioni discontinue del tumore, seguire i passaggi 5.2.1.1-5.2.1.3.Annotali separatamente. Tenere premuto il tasto Ctrl mentre si selezionano tutte le regioni tumorali Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Modifica più > Unisci selezionati. Assicurati che l’annotazione del tumore sia selezionata (i bordi hanno un colore giallo). Fai clic su Automatizza nel menu principale e seleziona Mostra editor di script. Copiare lo script disponibile nel file supplementare 1 o in https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls e incollarlo nell’editor di script, quindi fare clic su Esegui. Le ROI: centro tumorale (TC), margine interno (IM), margine esterno (OM) e area peritumorale (PT) verranno create ed etichettate automaticamente. Per un modo alternativo per creare regioni di interesse, seguire i passaggi 5.2.5.1-5.2.5.5.Seleziona lo strumento Polilinea dal menu principale in alto per disegnare un bordo che separa i nidi di cellule maligne e il tessuto non tumorale adiacente. Selezionare il bordo risultante. Selezionare dal menu principale in alto Oggetti > Annotazione > Espandi annotazioni > 500 μm per Raggio di espansione > Piatto per Estremità linea. Attivare Rimuovi interno e Vincola al padre. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull’annotazione risultante, Modifica singolo > Dividi. Due annotazioni separate verranno estese automaticamente come regioni larghe 500 μm su ciascun lato del bordo. Assegnare un nome appropriato alle aree annotate per la messaggistica istantanea e l’OM facendo clic con il pulsante destro del mouse sull’annotazione nell’elenco a sinistra, selezionando Imposta proprietà e immettendo il nome. Il TC rappresenta l’area tumorale rimanente. Estendere l’area PT larga 500 μm adiacente all’OM utilizzando la stessa procedura.NOTA: I vetrini annotati e i rilevamenti di AF QuPath sono stati esaminati da un istopatologo esperto. Ottimizzazione della classificazione dei pixelSeleziona lo strumento Rettangolo dal menu principale. Quindi annota una regione, che contiene tutti i tipi di pixel da distinguere (ad esempio, ematossilina, DAB e sfondo). Dal menu principale, selezionare Analizza > Pre-elaborazione > Stima vettore macchia. Quando viene visualizzata automaticamente la finestra Visual Stain Editor , selezionare Auto > OK e impostare H-DAB stimato come nome per il vettore della macchia. Per un metodo alternativo, seguire i passaggi 5.3.4.1-5.3.4.3.Seleziona lo strumento Rettangolo dal menu principale e annota una piccola regione di un nucleo tipico colorato con ematossilina. Seleziona Immagine dal menu a sinistra e fai doppio clic su Macchia 1 > Sì. Selezionare lo strumento Rettangolo dal menu principale e annotare una piccola regione di colorazione positiva con DAB. Seleziona Immagine dal menu a sinistra e fai doppio clic su Macchia 2 > Sì. Valutazione della frazione di area delle cellule immunitarie positive utilizzando l’opzione Classificazione pixel.Dal menu principale, fai clic su Classifica > Classificazione pixel > Crea soglia. Selezionare Alto per la risoluzione > Canale: DAB > Prefiltro: Gaussiano > Sigma: 0,5 > (Figura 3) Soglia: (0,2-0,3) > sopra la soglia: positivo > sotto soglia: negativo. Per l’area, selezionare Qualsiasi annotazione, digitare un nome per il classificatore > Salva > misura > OK. Le celle DAB-positive verranno modificate in colore rosso (Figura 4). Copia i risultati dal menu a sinistra in un foglio di calcolo. In alternativa, apri Misura nel menu principale in alto, seleziona Mostra misure annotazione > Copia negli appunti e incolla i risultati in un foglio di calcolo. Per chiudere l’immagine, fare clic con il pulsante destro del mouse > Vista multipla > Chiudi visualizzatore.NOTA: Prima della quantificazione, tutti gli artefatti venivano eliminati. La soglia è stata aggiustata per ogni caso con una debole colorazione specifica positiva. La correttezza delle annotazioni e la classificazione dei pixel sono state prima controllate e poi riviste da un istopatologo senior. Tutte le analisi sono state fatte alla cieca. Ulteriori informazioni sull’analisi dell’IHC utilizzando il software sono disponibili all’indirizzo https://forum.image.sc/tag/QP. 6. Metodi statistici e analisi dei dati Gli endpoint dello studio erano il tempo di recidiva (TTR), la sopravvivenza libera da malattia (DFS) e la sopravvivenza globale (OS). I pazienti senza recidiva o morte sono stati censurati al loro ultimo follow-up.NOTA: I dati continui distribuiti in modo non normale sono espressi come mediana (min-max). Le proporzioni sono espresse come dati grezzi (percentuali). Le frazioni di area delle cellule immunitarie in diverse regioni di interesse (ROI) sono state confrontate da Friedman ANOVA, seguito dal test di coppie abbinate di Wilcoxon con correzione di Bonferroni. A causa della distribuzione non parametrica della maggior parte delle variabili, la correlazione di Spearman è stata utilizzata per valutare le associazioni tra coppie di variabili ordinali o quantitative. Per determinare il valore prognostico dei singoli predittori per gli endpoint, è stata eseguita un’analisi di regressione di Cox univariata seguita da multivariata. Sono stati calcolati gli hazard ratio (HR). L’HR mostrava il rischio relativo per il gruppo intermedio alto combinato rispetto a 1 per il gruppo basso. Tutte le stime di sopravvivenza sono state calcolate con il metodo Kaplan-Meier e confrontate tra i gruppi mediante il test log-rank. Per le analisi statistiche è stato utilizzato GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). Un valore p su 2 lati < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Representative Results

I dati demografici e le caratteristiche cliniche dei pazienti sono presentati nella Tabella 1. L’età mediana dei pazienti era di 69 anni e la maggior parte erano maschi (77,6%). Per quanto riguarda l’eziologia dell’HCC, l’epatite cronica non virale è stata la malattia di fondo più frequente, con una prevalenza di steatoepatite non alcolica (NASH) (23,9%). Solo 15 pazienti (22,4%) presentavano la cirrosi come malattia di base. La maggior parte dei pazienti (68,7%) aveva TNM in stadio I. Risultati clinici e patologici più dettagliati sono stati descritti nel nostro lavoro precedentemente pubblicato 2,26. RisultatiAll’ultimo follow-up, la recidiva del tumore è stata osservata in 29 (41,8%) pazienti, di cui l’89,7% aveva una recidiva locale e 38 (56,7%) pazienti erano deceduti. A 5 anni dall’intervento chirurgico, la percentuale di DFS era del 33,2%, la percentuale di OS era del 49,4% e la percentuale libera da recidiva (RFP) era del 48,7% (Tabella 2). Distribuzione delle cellule immunitarie nelle diverse regioni di interesseLa proteina CD117 è stata trovata prevalentemente nella membrana citoplasmatica delle cellule arrotondate (Figura 5A). Nella TC e nell’IM, erano per lo più localizzati nello stroma e nello spazio perivascolare. Nelle aree OM e PT, le cellule CD117+ sono state osservate nella capsula tumorale e nello spazio perivascolare. La proteina NKp46 è stata trovata principalmente nella membrana citoplasmatica delle cellule arrotondate, che erano presenti all’interno di spazi sinusoidi nel TC e nell’IM, oltre ad essere associate allo stroma (Figura 5B). Nell’area OM e PT, le cellule NKp46+ sono state osservate nelle capsule attorno ai nidi tumorali e nello stroma dei tratti portali. La proteina CD1a è stata trovata nel TC e nell’IM, principalmente nella membrana citoplasmatica di cellule arrotondate (sparse o in aggregati) nello stroma, all’interno e lungo i confini di spazi sinusoidi (Figura 5C). Nell’area PT, CD1a+ DC è stato osservato all’interno e lungo i confini dei sinusoidi e all’interno dell’epitelio biliare nei tratti portali. La FA dei mastociti era significativamente maggiore della FA delle cellule NKp46+ (p < 0,001) (Figura 6). Le iDC CD1a+ in ciascuna ROI hanno mostrato la FA più bassa rispetto ai mastociti e alle cellule NK (p < 0,001) (Figura 6). L’AF delle cellule CD117+ e NKp46+ in TC o IM era significativamente più piccola di quelle nell’area PT e OM (p < 0,001) (Figura 6). Per le cellule CD1a+, la FA non differiva significativamente tra le regioni. Le associazioni significative per le singole cellule immunitarie tra tutte le ROI sono mostrate nella Tabella 3. La Figura 7 mostra la mappa di calore per le associazioni significative tra diverse cellule immunitarie all’interno di diverse regioni. La FA dei mastociti CD117+ nel TC era correlata in modo significativo con la FA del CD1a nel TC e nell’IM. Valore prognostico delle variabili cliniche e patologicheTra le variabili cliniche e patologiche, solo l’età più giovane era associata a un maggior rischio di recidiva (HR = 0,96, CI: 0,93-0,99, p = 0,007), mentre nessuna variabile era associata a DFS e OS (Tabella 4). Valori prognostici delle cellule immunitarie infiltrantiUn’elevata AF dei mastociti CD117+ nell’IM è stata associata a DFS (HR = 0,48, CI: 0,241 – 0,935, p = 0,031) e OS (HR = 0,34, CI: 0,167 – 0,703, p = 0,004) (Figura 8, Tabella 5). Inoltre, un’elevata AF dei mastociti CD117+ nell’area PT era associata a DFS più lunga (HR = 0,48, CI: 0,247 – 0,945, p = 0,034) (Figura 8, Tabella 5). Al contrario, le AF delle cellule iDC e NK non erano associate a nessuno degli esiti. I mastociti CD117+ nel margine interno hanno mantenuto associazioni significative con DFS (HR = 0,46, CI: 0,23-0,91, p = 0,027) e OS (HR = 0,33, CI: 0,16-0,68, p = 0,003) dopo l’aggiustamento per lo stadio TNM (Tabella 6). Per quanto riguarda i mastociti nella regione PT, anche l’associazione con DFS è rimasta significativa (HR = 0,47, CI: 0,24-0,93, p = 0,029) (Tabella 6). Figura 1: Schema rappresentativo dei metodi. Diagramma schematico del flusso di lavoro per l’identificazione del ruolo prognostico dei mastociti, delle cellule dendritiche e delle cellule natural killer nell’HCC. Abbreviazioni: FFPE, formalina-fissato-paraffina-embedded; H&E, ematossilina ed eosina; ROI, regioni di interesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Screenshot della finestra del software. Uno screenshot descrittivo che mostra la fase di importazione delle immagini in un progetto nel software. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Screenshot dell’opzione della frazione di area. Uno screenshot del software che mostra i parametri selezionati per quantificare la frazione di area della colorazione positiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Screenshot dell’opzione di classificazione dei pixel. Screenshot del software che mostra le celle positive DAB prima e dopo la classificazione dei pixel. La colorazione DAB brunastra è stata convertita in colore rosso dopo la classificazione dei pixel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Immunocolorazione rappresentativa delle cellule immunitarie innate nei pazienti con HCC. Immunocolorazione rappresentativa delle cellule (A) CD117+, (B) NKp46+ e (C) CD1a+ in TC (400x) e TIM (200x) di HCC. Abbreviazioni: HCC, carcinoma epatocellulare; TC, centro tumorale; TIM, margine tumorale invasivo, con margine interno (IM) e margine esterno (OM). La linea tratteggiata rappresenta un confine tra il tessuto tumorale e quello non tumorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Statistiche che descrivono la frazione di area delle cellule immunitarie innate nei pazienti con HCC. Statistiche per la frazione di area delle cellule dendritiche CD1a+, dei mastociti CD117+ e delle cellule NK NKp46+) nelle aree TC, IM, OM e PT dell’HCC. Le linee nere sono spartitraffico. Per i confronti è stato utilizzato il test delle coppie abbinate di Wilcoxon con correzione di Bonferroni. Abbreviazioni: HCC, carcinoma epatocellulare; TC, centro tumorale; IM, margine interno; OM, margine esterno; PT, area peritumorale. : p <0.001 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Mappa termica delle correlazioni significative tra frazioni di area di mastociti, DC e NK in diverse regioni di interesse. Mappa termica delle correlazioni significative tra le frazioni di area dei mastociti CD117+, DC CD1a+ e NKp46+NKs in TC, IM, OM e PT (Spearman ρ, p < 0,05). Abbreviazioni: TC, centro tumorale; IM, margine interno; OM, margine esterno; PT, area peritumorale; DC, cellule dendritiche; NK, cellule natural killer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Curve DFS e OS di Kaplan-Meier per mastociti infiltranti il tumore in pazienti con HCC. Analisi di Kaplan-Meier di DFS e OS in base a AF bassa vs. alta di mastociti infiltranti il tumore nel margine interno (A, C) e PT (B) di HCC. Abbreviazioni: HCC, carcinoma epatocellulare; DFS, sopravvivenza libera da malattia; IM, interno invasivo; PT, area peritumorale. La figura è stata adattata con il permesso di Ali et al.26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Background clinico dei pazienti arruolati con carcinoma epatocellulare. Background clinico dei casi arruolati di carcinoma epatocellulare. Abbreviazioni: NAFLD, steatosi epatica non alcolica. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Probabilità stimata di esiti nell’analisi di Kaplan-Meier. La probabilità stimata di RFP, DFS e OS nell’analisi di Kaplan-Meier. Abbreviazioni: RFP, proporzione senza ricorrenza; DFS, sopravvivenza libera da malattia; OS, sopravvivenza globale. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Correlazione tra la frazione di area dei mastociti infiltranti il tumore, delle cellule dendritiche e delle cellule natural killer in diversi ROI. Correlazione di Spearman (ρ) tra la frazione di area dei mastociti infiltranti il tumore, delle cellule dendritiche e delle cellule natural killer in diversi ROI, p < 0,038. Abbreviazioni: TC, centro tumorale; IM, margine interno; OM, margine esterno; PT, area peritumorale; ROI, regioni di interesse. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Analisi univariata delle variabili cliniche e patologiche associate al tempo di recidiva (TTR), alla sopravvivenza libera da malattia (DFS) e alla sopravvivenza globale (OS). No”, genere femminile o “A” erano le categorie di riferimento per le variabili dicotomiche. I valori in grassetto indicano la significatività statistica a livello di p < 0,05. Abbreviazioni: HR, hazard ratio; CI, intervallo di confidenza; TTR, tempo di recidiva; DFS, sopravvivenza libera da malattia. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 5: Analisi univariata dell’associazione della frazione di area dei mastociti CD117+, delle cellule CD1a+denderitiche e delle cellule natural killer NKp46+ con TTR, DFS e OS per singola regione di interesse utilizzando la regressione di Cox (67 pazienti con HCC). La frazione di area delle cellule immunitarie per sezione di area (mm2) è stata convertita in percentili e quindi classificata in bassa (0-25 percentile) vs alta (25-100 percentile). Gli hazard ratio mostrano il rischio relativo rispetto a 1 per la fibrillazione atriale bassa. I valori in grassetto indicano la significatività statistica a livello di p < 0,05. Abbreviazioni: AF, frazione di area; DFS, sopravvivenza libera da malattia; OS, sopravvivenza globale; HR, hazard ratio. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 6: La frazione di area dei mastociti CD117+ per ROI individuale associata alla sopravvivenza libera da malattia e alla sopravvivenza globale (analisi multivariata). Analisi multivariata dell’associazione della frazione areale dei mastociti CD117+ con DFS e OS nell’area IM e PT mediante regressione di Cox (67 pazienti con HCC). La frazione di area delle cellule immunitarie per sezione di area (mm2) è stata convertita in percentili e quindi classificata in bassa (0-24 percentile) vs alta (25-100 percentile). Gli hazard ratio mostrano il rischio relativo rispetto a 1 per la fibrillazione atriale bassa. I valori in grassetto indicano la significatività statistica a livello di p > 0,05. Abbreviazioni: AF, frazione di area; DFS, sopravvivenza libera da malattia; OS, sopravvivenza globale; HR, hazard ratio. Clicca qui per scaricare questa tabella. File supplementare 1: Script per la creazione di ROI. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Attraverso il monitoraggio dell’organizzazione immunitaria in situ nell’ambito della TME, il campo dell’immuno-oncologia può aggiungere nuovi biomarcatori prognostici e predittivi del cancro. Il nostro articolo pubblicato in precedenza sul ruolo delle cellule immunitarie adattative nel TME dell’HCC ha mostrato associazioni prognostiche positive delle cellule T CD3+ e CD8+, nonché delle cellule B CD20+ in ROI selezionati al tempo di recidiva2. In questo caso, il software di analisi delle immagini QuPath è stato utilizzato per valutare l’abbondanza di iDC CD1a+, mastociti CD117+ e cellule NK NKp46+ in diverse regioni distinte di HCC e ha valutato il loro significato prognostico. A causa delle forme irregolari di alcune cellule immunitarie innate, la loro quantificazione può essere imprecisa. Questo è il motivo per cui valutare la frazione di area delle cellule immunopositive era l’opzione ottimale. Tra i tre tipi di cellule, solo i mastociti CD117+ hanno dimostrato un impatto prognostico significativo: una FA più elevata dei mastociti nell’area IM e PT era associata a una sopravvivenza più lunga.

I mastociti erano i più abbondanti in tutte le ROI e l’associazione della loro AF nell’area peritumorale e nel margine interno con una migliore sopravvivenza riflette il ruolo antitumorale dei mastociti. I mastociti possono essere attratti all’interno della TME da chemioattrattivi rilasciati dalle cellule tumorali, come l’SCF o il CCL1518. I mastociti possono influenzare la risposta antitumorale attraverso la citotossicità diretta alle cellule tumorali27 o secernendo citochine pro-infiammatorie che possono inibire la crescita tumorale18. L’aumento della densità dei mastociti è stato protettivo contro la recidiva del cancro alla prostata28, del cancro gastrico27 e dell’HCC dopo il trapianto di fegato29. Un’indagine completa che ha coinvolto una coorte più ampia di 245 pazienti con HCC ha trovato una correlazione positiva tra un’infiltrazione più significativa dei mastociti nei campioni tumorali e una sopravvivenza più prolungata dopo la resezione del tumore30. Rohr-Udilova et al. hanno riportato risultati simili di una maggiore densità di mastociti nel tessuto HCC circostante; Tuttavia, solo la densità intratumorale dei mastociti è stata associata a un tasso di recidiva inferiore29.

In questo studio, i mastociti hanno esercitato un effetto antitumorale solo nel fegato IM e PT. La TME di diversi tumori è eterogenea per quanto riguarda la distribuzione spaziale delle cellule immunitarie31. Il significato prognostico delle cellule immunitarie nella TME è anche criticamente correlato alla loro distribuzione spaziale32,33. Sono stati proposti diversi approcci per l’annotazione del margine invasivo del tumore, tra cui un margine intero di diverse larghezze 4,34,35, margini interni ed esterni, sempre con diverse larghezze36,37, con o senza PT 2,7. Abbiamo seguito la metodologia standardizzata e riproducibile dell’International Immunooncology Biomarkers Working Group per definire il margine invasivo come una regione di 1 mm centrata sul bordo che separa i nidi di cellule maligne dal tessuto ospite e rappresenta il tumore centrale come l’area tumorale rimanente38. Poiché lo studio precedente ha evidenziato differenze significative nei risultati del margine invasivo interno ed esterno2, queste regioni (ciascuna di 500 μm di larghezza) sono state analizzate separatamente. Il profilo immunitario spaziale dell’area peritumorale ha la sua distinta importanza predittiva39,40, e quindi è stata inclusa anche l’area PT.

L’analisi del TC, del margine tumorale e del fegato PT è stata eseguita in WSI rispetto all’opzione di valutare campi visivi selezionati nelle rispettive regioni. L’imaging dell’intero vetrino è una fonte potenzialmente ricca di dati41. Poiché non abbiamo eseguito il sottocampionamento, il “vero valore atteso” è stato ottenuto in modo efficiente in termini di tempo10. Inoltre, questo sistema era ragionevole perché sono stati analizzati solo 1 o 2 vetrini per blocco, il che ci ha permesso di evitare la distorsione della selezione della patch42. Il flusso di lavoro lento ci ha messo alla prova nello studio precedente, quando la stereologia è stata applicata per la quantificazione delle cellule immunitarie2.

L’IHC consente la localizzazione diretta delle iDC CD1a+, NKp46+NK e CD117+ nell’espressione dei mastociti nel tessuto epatico, la quantificazione delle loro distribuzioni e, quindi, la sottoclassificazione della coorte. L’analisi IHC offre a questo studio importanti vantaggi rispetto ai saggi biochimici in tessuto solubilizzato, che possono portare a risultati falsi negativi quando sono presenti solo poche cellule positive al biomarcatore43 e non riflettono la reazione regionale delle cellule immunitarie alle caratteristiche istopatologiche44. L’IHC è anche preferibile all’analisi nelle sezioni colorate con H&E. Gli studi sul cancro del colon-retto e sul carcinoma polmonare a piccole cellule hanno dimostrato che la valutazione delle sezioni colorate con H&E potrebbe fornire biomarcatori tumorali robusti e quantitativi 45,46,47; Tuttavia, sono ancora presenti limitazioni per riflettere l’effettiva presenza di sottotipi specifici.

L’alta qualità delle sezioni di tessuto e la colorazione IHC sono un prerequisito per una valutazione accurata. Un elevato background, artefatti ai bordi e colorazioni specifiche ma indesiderabili (ad esempio, colorazione delle cellule endoteliali degli spazi sinusoidali del fegato con anticorpi anti-CD4) possono corrompere tutti i risultati. Un anticorpo CD56 è stata la prima scelta nell’attuale studio per rilevare le cellule natural killer, ma è stato sostituito con l’anticorpo NKp46 a causa dell’espressione di CD56 nei dotti biliari immaturi. La selezione del marcatore più appropriato in termini di specificità, robusto modello di colorazione e stabilità nei blocchi FFPE rappresenta un altro problema da considerare. Ad esempio, il CD117 è stato scelto al posto della triptasi perché l’espressione della triptasi può essere fortemente sottoregolata, inoltre, le cellule che non esprimono CD117 non sono mastociti48.

QuPath offre la possibilità di smussare i confini della ROI dall’esterno e di rimuovere eventuali artefatti, grandi vasi, tessuto necrotico, colorazione non specifica, sfondo e aggregazione di eritrociti che non dovrebbero far parte della ROI. L’operatore deve selezionare il ROI e premere il tasto “Alt” mentre annota tali artefatti. La colorazione aspecifica è stata eliminata in questo studio come artefatti prima della quantificazione in modo che non influenzasse i risultati. In caso di colorazione specifica sistematicamente bassa o di fondo elevato, il protocollo deve essere rivisto per evitare possibili distorsioni. La soglia è stata aggiustata per ogni caso con una debole colorazione specifica positiva. Prima di qualsiasi uso di routine, il protocollo deve essere ottimizzato. Tutte le analisi dovrebbero essere eseguite alla cieca e, idealmente, l’accuratezza della soglia merita un controllo incrociato.

QuPath è una soluzione facile da usare, intuitiva, estensibile e open-source per la patologia digitale e l’analisi dell’immagine dell’intero vetrino9, testata in precedenza per l’analisi delle immagini nell’HCC49 e in diversi tumori50,51. I principali vantaggi sono la facilità d’uso del software per i WSI e le opzioni per l’annotazione delle regioni di interesse (ad esempio, aree tumorali o peritumorali).

L’applicazione di script esistenti, modificati o creati de novo può velocizzare notevolmente l’analisi. È stato applicato lo script per creare annotazioni per i ROI, che ha consentito una segmentazione regionale rapida e accurata invece della delineazione manuale. Lo script non è fisso e può essere facilmente personalizzato con margini inferiori a 500 μm per regioni con bordi di tessuto insufficienti. La larghezza dell’area IM, OM o PT può essere personalizzata tramite l’editor di script Automate > Show > adattando la linea 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm alla larghezza disponibile > Run. Le ROI possono anche essere aggiunte o rimosse. In generale, i flussi di lavoro nel software non sono fissi e l’operatore è libero di svilupparli e modificarli.

Una pletora di strumenti software disponibili per l’analisi patologica delle immagini, tra cui CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser e altri, sono ora disponibili. Tuttavia, QuPath si distingue per una serie di vantaggi come l’architettura open source, l’interfaccia user-friendly, le capacità di personalizzazione degli algoritmi e l’integrazione di strumenti avanzati di apprendimento automatico. Queste caratteristiche posizionano collettivamente questo software di analisi delle immagini come una scelta robusta per l’analisi sfumata dei tessuti tumorali nel regno della patologia digitale.

QuPath ha mostrato la variabilità più bassa rispetto ai software commerciali HALO (IndicaLab) e QuantCenter (3DHistech) per il rilevamento dell’espressione di Ki67 nel carcinoma mammario52. Il software ha anche il potenziale per essere istruito a eseguire uno script per tutte le immagini del progetto in modo riproducibile in batch.

QuPath ci ha permesso di creare dati quantitativi continui invece di quelli ordinali (semi-quantitativi). I dati ordinali ottenuti dal punteggio visivo sono irti di problemi dovuti alla soggettività nell’interpretazione, alla variabilità inter-osservatore e alla scarsa riproducibilità53. La tempestività dell’analisi attuale è stata migliorata dal fatto che gli individui senza un ampio background istopatologico e competenze di programmazione possono eseguire analisi automatiche, a condizione che l’accuratezza delle annotazioni sia stata controllata da un patologo. Uno studio sui tumori della testa e del collo ha dimostrato l’idoneità di QuPath per una valutazione rapida e riproducibile del valore prognostico dei linfociti infiltranti il tumore CD57+50. Lo studio ha anche mostrato una sostanziale concordanza tra gli osservatori umani e QuPath. Un’elevata concordanza tra l’osservazione manuale e la valutazione utilizzando QuPath è stata presentata anche nel cancro orale54 e nel cancro al seno55. Il suddetto articolo ha confrontato la quantificazione IHC di 5 biomarcatori clinici del cancro al seno utilizzando QuPath e 2 prodotti software commerciali (Definiens, Tissue Studio e inForm) con un punteggio manuale da parte di un patologo. Nel corso di questo studio, QuPath ha costantemente mostrato le migliori prestazioni e il minor tempo per la configurazione e l’applicazione, dimostrando così di essere un’eccellente alternativa futura al monitoraggio visivo e al software commerciale. Anche rispetto a ImageJ, il più noto software open source per l’analisi delle immagini biomediche, QuPath eccelle nella gestione di WSI di grandi dimensioni56.

C’è un forum online aperto per QuPath in cui gli utenti pubblicano le loro domande sui metodi di patologia digitale e presentano una comunità attiva e impegnata per supportare lo sviluppo di strumenti per l’analisi delle immagini (https://forum.image.sc/tag/qupath).

La coorte utilizzata in questo studio era unica e non rappresentativa della popolazione generale con HCC perché comprendeva solo i pazienti che erano eleggibili per la resezione epatica. In generale, una minoranza di pazienti con HCC (20%-30%) è eleggibile per la resezione epatica57. Questo potrebbe anche essere un motivo per cui un minor numero di pazienti aveva confermato la cirrosi, perché i pazienti con questa eziologia di HCC probabilmente avevano punteggi di Child-Pugh più alti e non erano considerati resecabili. La coorte era anche piuttosto piccola e la maggior parte dei pazienti aveva uno stadio iniziale della malattia nel TNM. Pertanto, l’estrapolazione dei risultati ad altre popolazioni deve essere effettuata con cautela.

Nel presente studio, l’abbondanza di cellule immunitarie innate nel microambiente HCC è stata stimata attraverso la valutazione della loro FA, poiché il conteggio preciso di cellule immunitarie di forma irregolare come le cellule dendritiche può rivelarsi difficile. D’altra parte, la frazione di area delle cellule immunitarie di solito è fortemente correlata con le loro densità58. La marcatura con immunoperossidasi fornisce dati per la localizzazione dell’antigene, della frazione di area o della densità delle cellule che la esprimono, ma l’intensità della colorazione non è linearmente correlata alla quantità di antigene. Pertanto, l’IHC non deve essere utilizzato per valutare quantitativamente il livello di espressione di una particolare proteina. L’accuratezza del metodo dipende anche dall’uniformità dello spessore della sezione, dalla qualità dell’immagine e dalla risoluzione selezionata per la classificazione dei pixel. Tutti i risultati dell’analisi delle immagini devono essere convalidati e trattati con cautela. Poiché un singolo marcatore non è in grado di catturare completamente la complessità delle cellule immunitarie, sono necessari più marcatori IHC e colorazione multiplex per ottenere un quadro affidabile del TME immunitario dell’HCC. L’uso di un solo marcatore IHC per la fenotipizzazione delle cellule immunitarie rappresenta un’approssimazione e i risultati devono essere interpretati con cautela.

L’utilizzo del software di analisi delle immagini QuPath per valutare i vetrini colorati con IHC ci ha permesso di valutare la distribuzione e la frazione di area di iDC locali, mastociti e NK nel tumore e nel peritumore dei pazienti con HCC e quindi di analizzare le loro relazioni con la prognosi. L’abbondanza di mastociti nel margine interno e nel fegato peritumorale dell’HCC è associata a DFS e OS più lunghe, evidenziando gli effetti antitumorali di quelle cellule immunitarie innate. Il flusso di lavoro analitico di QuPath è intuitivo, veloce e facile da usare, con utili impostazioni predefinite e una facile esportazione dei dati. Questo software è stato approvato come una piattaforma promettente per l’analisi delle immagini digitali, che potrebbe soddisfare le esigenze di riproducibilità, coerenza e accuratezza nella patologia digitale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo i contributi di Mons. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Facoltà di Scienze, Università Carolina) per la scansione di vetrini interi e del progetto “e-Infrastruktura CZ” (e-INFRA LM2018140), che ci ha fornito le risorse computazionali per questo studio. I tecnici Jana Dosoudilova e Jan Javurek sono riconosciuti per la loro eccellente assistenza tecnica. Questa ricerca è stata finanziata dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea, sovvenzione N°856620, e dal Ministero della Salute della Repubblica Ceca, sovvenzione AZV NU21-03-00506, e dal Programma Cooperatio (Discipline chirurgiche). La Vinicna Microscopy Core Facility è cofinanziata dal progetto Czech-BioImaging large RI LM2023050.

Materials

Anti-CD1a Leica Biosystems PA0235 Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
Anti-CD117 Leica Biosystems  PA0007 Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
BOND Plus Microscope Slides Leica Biosystems, Germany S21.2113.A
BOND RXm Leica Biosystems 49.1501 Fully Automated IHC Stainer  
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit Leica Biosystems CS9100
Bond Dewax Solution Leica Biosystems AR9222
Bond Polymer Refine Detection Kit Leica Biosystems DS9800
BondTM Epitope Retrieval 2 Leica Biosystems AR9640
BondTM Primary Antibody Diluent Leica Biosystems AR9352
BondTM Wash Solution 10X Concentrate Leica Biosystems AR9590
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz Installed RAM: 128 G Intel A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available
Coverslips Leica Biosystems, Germany 14071135636
CV Mount Leica Biosystems, Germany 14046430011
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper Leica Biosystems 149CVTS5025
Drying Oven UN30 Memmert GmbH  UN30
GraphPad Prism 9.0 GraphPad Software LLC  Version 12
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 R&D Systems, Inc., United States MAB1850 Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 – Water Bath Leica Biosystems 14041521466
Protein Block Agilent Dako, United States X0909
QuPath 0.3.2 or higher versions  version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 Rotary Microtome Leica Biosystems 149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Slide Stainer Leica Biosystems DEV-ST5010-CV5030
Statistica StatSoft Inc. version 7
Zeiss Axio Scan.Z1 ScienceServices GmbH, Germany 430038-9000-000  Slide scanner 
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Ali, E., Červenková, L., Pálek, R., Ambrozkiewicz, F., Pavlov, S., Ye, W., Hošek, P., Daum, O., Liška, V., Hemminki, K., Trailin, A. Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software. J. Vis. Exp. (206), e66743, doi:10.3791/66743 (2024).
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