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Cancer Research

Los mastocitos en el microambiente del carcinoma hepatocelular confieren un pronóstico favorable: un estudio retrospectivo con el software de análisis de imágenes QuPath

Published: April 12, 2024
doi:
10.3791/66743
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1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine,Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen,Charles University, 5Sikl’s Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen,Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology,German Cancer Research Center

Summary

La presencia de mastocitos en el margen interno y en las áreas peritumorales del carcinoma hepatocelular después de la resección confiere un pronóstico favorable. Este estudio avala el software de análisis de imágenes QuPath como una plataforma prometedora que podría satisfacer la necesidad de reproducibilidad, consistencia y precisión en la patología digital.

Abstract

Los conocimientos proporcionados por la detección in situ de células inmunitarias dentro del carcinoma hepatocelular (CHC) podrían presentar información sobre los resultados de los pacientes. Los estudios que investigan la expresión y localización de las células inmunitarias dentro de los tejidos tumorales se asocian con varios desafíos, incluida la falta de anotación precisa de las regiones tumorales y la selección aleatoria de campos de visión microscópicos. QuPath es un software de código abierto y fácil de usar que podría satisfacer la creciente necesidad de patología digital en el análisis de imágenes de portaobjetos completos (WSI).

Se evaluó inmunohistoquímicamente la infiltración de CHC y tejidos adyacentes por células dendríticas inmaduras (iDC) CD1a+, mastocitos CD117+ y células asesinas naturales (NK) NKp46+ en muestras representativas de 67 pacientes con CHC sometidos a resección curativa. La fracción de área (FA) de las células teñidas positivamente se evaluó automáticamente en las WSI mediante QuPath en el centro tumoral (TC), el margen interno (MI), el margen externo (MO) y el área peritumoral (PT). Se evaluó la importancia pronóstica de las células inmunitarias en cuanto al tiempo hasta la recidiva (TTR), la supervivencia sin enfermedad (SSE) y la supervivencia general (SG).

La FA de los mastocitos fue significativamente mayor que la FA de los NK, y la FA de los iDC fue significativamente menor en comparación con las NK en cada región de interés. Los FA altos de los mastocitos en las áreas IM y PT se asociaron con una SSE más prolongada. Además, la FA alta de los mastocitos en la IM se relacionó con una SG más prolongada.

El análisis asistido por ordenador con este software es una herramienta adecuada para obtener información pronóstica de las células inmunitarias infiltrantes del tumor (iDC, mastocitos y NK) en diferentes regiones del CHC después de la resección. Los mastocitos mostraron la mayor FA en todas las regiones de interés (ROI). Los mastocitos en la región peritumoral y la IM mostraron una significación pronóstica positiva.

Introduction

Se ha demostrado que la organización espacial y la abundancia de células inmunitarias infiltrantes de tumores influyen en la supervivencia en diferentes tipos de cáncer, incluido el carcinoma hepatocelular (CHC) 1,2,3,4. La importancia pronóstica de los linfocitos infiltrantes tumorales en los cánceres se demostró por primera vez en secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) 5,6. Luego, un estudio pionero de Galon et al. utilizando inmunohistoquímica (IHQ) demostró asociaciones de las densidades de células T CD3+ y CD8+ en el tejido de cáncer de colon con el pronóstico4.

La IHQ es un estándar de oro para visualizar, cuantificar y mapear las células inmunitarias dentro del tejido tumoral para una mayor asociación con los resultados clínicos7. La IHQ presenta varias ventajas, como el bajo costo, la amplia disponibilidad y la compatibilidad con el tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE)8. Sin embargo, la evaluación precisa de las células inmunitarias teñidas con IHQ es un gran desafío. La puntuación tradicional en campos de visión microscópicos seleccionados requiere mucho tiempo y ya no es suficiente para garantizar el análisis objetivo, reproducible y de alta calidad esencial para la selección de biomarcadores candidatos y una correlación clínica fiable9. Las exploraciones de portaobjetos completos se pueden evaluar como una imagen completa o después de un submuestreo10.

La evaluación cuantitativa computarizada de la abundancia de células inmunitarias en muestras de tejido puede garantizar datos prácticos, precisos, confiables y clínicamente relevantes11. QuPath es un software gratuito y de código abierto que permite el análisis digital de imágenes de portaobjetos teñidos con IHC y maximiza la cantidad de información obtenida de muestras individuales12.

Dado que las células dendríticas inmaduras (iDC), las células asesinas naturales (NK) y los mastocitos están implicados en las respuestas inmunitarias antitumorales y se ha demostrado que se correlacionan con los resultados de los pacientes 13,14,15, aquí presentamos un protocolo paso a paso para evaluar su distribución espacial en el tejido FFPE HCC y explorar su impacto pronóstico. CD1a se expresa principalmente en la membrana de células dendríticas inmaduras, cuya densidad se ha asociado con resultados clínicos en una variedad de tumores humanos16,17. Los mastocitos pueden desempeñar un papel protumoral o antitumoral dentro del microambiente tumoral (TME)18. Pueden apoyar la angiogénesis y facilitar la metástasis19. Por el contrario, se ha informado que los mastocitos pueden mediar la apoptosis de las células tumorales a través de la producción de IL-420. La tinción anti-CD117 se usa comúnmente para visualizar y cuantificar los mastocitos dentro del tejido tumoral21. Se cree que las células NK contribuyen a la vigilancia y el control del HCC22 al matar las células cancerosas23. La expresión de NKp46 por NK es un parámetro crucial para su actividad antitumoral24. Sin embargo, las células NKp46+ NK se correlacionaron positivamente con el diámetro del tumor en pacientes con CHC25. A pesar de esto, se sabe poco sobre su correlación con la supervivencia de los pacientes.

Nuestro objetivo fue evaluar cuantitativamente la abundancia de CD1a+ iDC, mastocitos CD117+ y NKp46+ NK en diferentes regiones de CHC y destacar su importancia pronóstica. En el estudio retrospectivo actual se incluyeron un total de 70 pacientes consecutivos con CHC en estadio I-IV confirmado patológicamente, que eran elegibles para la resección según las pautas del BCLC y se sometieron a una resección hepática con intención curativa en el Hospital Universitario de Pilsen entre 1997 y 2019. Se revisaron los informes patológicos de los pacientes. Ninguno de los pacientes incluidos en este estudio presentaba metástasis a distancia ni había recibido tratamiento neoadyuvante como quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Se excluyeron un total de 3 pacientes con muestras histológicas de mala calidad y se incluyeron en el estudio los 67 pacientes restantes (Tabla 1).

Protocol

Este protocolo fue parte de un estudio realizado de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki (versión 2013); fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina y el Hospital Universitario de Pilsen (118/2021, 11 de marzo de 2021). En la Figura 1 se muestra un resumen de los métodos empleados. 1. Selección de bloques de tejido FFPE Recupere identificadores de bloques FFPE de los archivos de los pacientes con la ayuda de médicos o patólogos tratantes. Solicite los bloques FFPE del archivo de patología local. Para cada paciente, seleccione 2-3 bloques de FFPE que contengan tejido tumoral viable, preferiblemente con el área peritumoral circundante y el hígado no tumoral.NOTA: Se recomienda obtener la opinión de un patólogo experto para esta selección. La evaluación histológica del hígado no tumoral, junto con datos anamnésicos, clínicos y de laboratorio, se utilizó para definir la etiología subyacente del CHC. 2. Desparafinación y rehidratación de tejidos FFPE Corte una o dos secciones de tejido de 4 μm de espesor de cada uno de los bloques de tejido FFPE en un micrótomo.NOTA: El espesor de las secciones puede estar entre 3 μm y 5 μm sin que se note el impacto de las manchas; sin embargo, un grosor de 4 μm es el estándar. Coloque las secciones en un baño de agua (42 ° C) para eliminar las arrugas. Monte los portaobjetos levantándolos y colocándolos en un portaobjetos microscópico de vidrio cargado positivamente. A continuación, aplique los portaobjetos para secar a temperatura ambiente (AT) durante 24 h. Coloque los portaobjetos en un termostato (56 °C) durante 1 h. Utilice un tinte automático para desparafinar las secciones en la solución de desparafinado-1 (30 s a 72 °C), la solución de desparafinado-2 (10 s a 72 °C), la solución de desparafinado-3 (10 s a AT), etanol 96%-1 (10 s), etanol 96%-2 (10 s) y etanol 96%-3 (10 s). Utilice un tinte automático para rehidratar las secciones en la solución de lavado-1 (10 s, AT), la solución de lavado-2 (10 s, AT) y la solución de lavado-3 (5 min, AT). 3. Realización de IHQ en un tinte totalmente automatizado NOTA: La IHQ se realiza de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los pasos se explican brevemente a continuación. Método de recuperación de antígenosRecuperar el antígeno utilizando el procedimiento de recuperación de epítopos (ER) inducido por calor en una solución ER con un pH alto (p. ej., Tris-EDTA): solución ER-1 (10 s, AT), solución ER-2 (10 s, AT), solución ER-3 (20 min a 100 °C), solución ER-4 (12 min, AT). Enjuague el portaobjetos en una solución de lavado durante 3 veces (30 s cada uno) y 1 vez (3 min). Bloquee la peroxidasa endógena con la solución de bloque de peróxido durante 5 min en AT. Enjuague con una solución de lavado durante 3 veces (30 s cada una). Bloquee la unión inespecífica de anticuerpos con un bloque de proteínas para NKp46 solo durante 30 min. en AT. Unión con anticuerpos primarios: Incubar con anticuerpos primarios durante 15 min en AT, luego enjuagar con una solución de lavado durante 3 veces (30 s cada una). Para la unión secundaria de anticuerpos, siga los pasos que se describen a continuación.Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 8 min en AT. Enjuague con una solución de lavado durante 2 veces (2 minutos cada una) y 1 vez con agua desionizada. Visualice la reacción enjuagando los portaobjetos con una solución de diaminobenzidina (DAB) y luego incubándolos con la solución de DAB durante 10 min en AT. Enjuague 3 veces (30 s) con agua desionizada. Contratiñe las secciones con hematoxilina de Mayer. Enjuague con agua desionizada durante 1 vez (30 s), solución de lavado durante 1 vez (30 s) y agua desionizada durante 1 vez (30 s). Utilice un tintor de portaobjetos totalmente automatizado para deshidratar las secciones en etanol 70% (2 min), etanol 80% (2 min), etanol 96%-1 (3 min), etanol 96%-2 (3 min), etanol 100% (3 min), xileno-1 (4 min), xileno-2 (4 min) y xileno-3 (4 min). Utilice un cubreobjetos de vidrio totalmente automatizado para montar las secciones de los portaobjetos en un medio de montaje.NOTA: Se utilizaron muestras de control de tejido negativas y positivas (amígdalas) en todo momento. 4. Obtención de escaneos de portaobjetos completos Escanee los portaobjetos manchados con el objetivo de 20x y una densidad de enfoque moderada-alta en un escáner de portaobjetos completos. 5. Análisis de IHQ con el software Cree un proyecto para las imágenes IHC en el software.Descargue y abra QuPath-0.4.3 (o superior).exe Cree una nueva carpeta con un nombre adecuado. Haga clic en el botón Crear proyecto en la esquina superior izquierda del software y seleccione la carpeta recién creada. Arrastre las imágenes escaneadas a la ventana del software. Cuando aparezca automáticamente una nueva ventana, seleccione Establecer tipo de imagen > H-DAB y haga clic en Importar (Figura 2). Observe la lista de imágenes en la ventana izquierda del menú; Haga doble clic para abrir la imagen. Seleccione en el menú principal en la parte superior Archivo para guardar las imágenes como un proyecto.NOTA: El software puede manejar una amplia gama de formatos de imagen, incluidos muchos formatos de diapositivas completas. Sin embargo, se prefiere el formato tiff para evitar la pérdida de datos sin procesar y metadatos asociados. Anotar regiones de interésSeleccione la herramienta Pincel o la herramienta Varita en el menú principal en la parte superior para anotar el área del tumor. Para las regiones discontinuas del tumor, siga los pasos 5.2.1.1-5.2.1.3.Anótelos por separado. Mantenga presionada la tecla Ctrl mientras selecciona todas las regiones tumorales Haga clic con el botón derecho y seleccione Editar varias > Combinar seleccionados. Asegúrese de que la anotación del tumor esté seleccionada (los bordes tienen un color amarillo). Haga clic en Automatizar en el menú principal y seleccione Mostrar editor de scripts. Copie el script disponible en el Archivo complementario 1 o en https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls y péguelo en el Editor de scripts, luego haga clic en Ejecutar. Los ROI: centro tumoral (CT), margen interno (MI), margen externo (OM) y área peritumoral (PT) se crearán y etiquetarán automáticamente. Para obtener una forma alternativa de crear regiones de interés, siga los pasos 5.2.5.1-5.2.5.5.Seleccione la herramienta Polilínea en el menú principal de la parte superior para dibujar un borde que separe los nidos de células malignas y el tejido no tumoral adyacente. Seleccione el borde resultante. Seleccione en el menú principal de la parte superior Objetos > Anotación > Expandir anotaciones > 500 μm para Radio de expansión > Plano para Límite de línea. Active Eliminar interior y active Restringir a padre. Haga clic con el botón derecho en la anotación resultante, Editar división de > única. Dos anotaciones separadas se extenderán automáticamente como regiones de 500 μm de ancho a cada lado del borde. Asigne un nombre adecuado a las regiones anotadas para IM y OM haciendo clic con el botón secundario en la anotación de la lista de la izquierda, seleccionando Establecer propiedades y escribiendo el nombre. El TC representa el área tumoral restante. Extienda el área PT de 500 μm de ancho adyacente al MO utilizando el mismo procedimiento.NOTA: Las láminas anotadas y las detecciones de QuPath AF fueron revisadas por un histopatólogo experto. Optimización de la clasificación de píxelesSeleccione la herramienta Rectángulo en el menú principal. A continuación, anote una región que contenga todos los tipos de píxeles que se van a distinguir (por ejemplo, hematoxilina, DAB y fondo). En el menú principal, seleccione Analizar > preprocesamiento > estimar vector de mancha. Cuando aparezca automáticamente la ventana Editor visual de manchas , seleccione Auto > OK y establezca H-DAB estimado como el nombre del vector de manchas. Para un método alternativo, siga los pasos 5.3.4.1-5.3.4.3.Seleccione la herramienta Rectángulo en el menú principal y anote una pequeña región de un núcleo típico teñido con hematoxilina. Seleccione Imagen en el menú de la izquierda y haga doble clic en Mancha 1 > Sí. Seleccione la herramienta Rectángulo en el menú principal y anote una pequeña región de tinción positiva con DAB. Seleccione Imagen en el menú de la izquierda y haga doble clic en Mancha 2 > Sí. Evaluación de la fracción de área de las células inmunitarias positivas mediante la opción Clasificación de píxeles .En el menú principal, haga clic en Clasificar > Clasificación de píxeles > Crear umbral. Seleccione Alta para la resolución > Canal: DAB > Prefiltro: Gaussiano > Sigma: 0,5 > (Figura 3) Umbral: (0,2-0,3) > por encima del umbral: positivo > por debajo del umbral: negativo. Para la región, seleccione Cualquier anotación, escriba un nombre para el Clasificador > Guardar > medida > Aceptar. Las células DAB-positivas cambiarán a color rojo (Figura 4). Copie los resultados del menú del lado izquierdo a una hoja de cálculo. O bien, abra Medir en el menú principal superior, seleccione Mostrar medidas de anotación > copiar al portapapeles y pegue los resultados en una hoja de cálculo. Para cerrar la imagen, haga clic con el botón derecho del ratón en > Vista múltiple > Cerrar visor.NOTA: Antes de la cuantificación, se eliminaron todos los artefactos. El umbral se ajustó para cada caso con una tinción positiva específica débil. La exactitud de las anotaciones y la clasificación de píxeles se verificaron primero y luego fueron revisadas por un histopatólogo senior. Todos los análisis se realizaron a ciegas. Puede encontrar más información sobre el análisis de IHQ utilizando el software en https://forum.image.sc/tag/QP. 6. Métodos estadísticos y análisis de datos Los criterios de valoración del estudio fueron el tiempo hasta la recidiva (TTR), la supervivencia sin enfermedad (SSE) y la supervivencia general (SG). Los pacientes sin recaída ni muerte fueron censurados en su último seguimiento.NOTA: Los datos continuos distribuidos no normalmente se expresan como mediana (mín.-máx.). Las proporciones se expresan como datos brutos (porcentajes). Las fracciones de área de las células inmunitarias en diferentes regiones de interés (ROI) se compararon mediante ANOVA de Friedman, seguido de la prueba de pares emparejados de Wilcoxon con corrección de Bonferroni. Debido a la distribución no paramétrica de la mayoría de las variables, se utilizó la correlación de Spearman para evaluar las asociaciones entre pares de variables ordinales o cuantitativas. Para determinar el valor pronóstico de los predictores individuales de los criterios de valoración, se realizó un análisis de regresión de Cox univariable seguido de multivariable. Se calcularon los hazard ratios (HR). El HR mostró el riesgo relativo para el grupo combinado intermedio alto en comparación con 1 para el grupo bajo. Todas las estimaciones de supervivencia se calcularon por el método de Kaplan-Meier y se compararon entre los grupos mediante la prueba de rangos logarítmicos. Para los análisis estadísticos se utilizó GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). Un valor p de 2 lados < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Representative Results

Los datos demográficos y las características clínicas de los pacientes se presentan en la Tabla 1. La mediana de edad de los pacientes fue de 69 años, y la mayoría eran hombres (77,6%). En cuanto a la etiología del CHC, la hepatitis crónica no viral fue la enfermedad de base más frecuente, con predominio de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) (23,9%). Solo 15 pacientes (22,4%) tenían cirrosis como enfermedad de base. La mayoría de los pacientes (68,7%) tenían TNM en estadio I. Los hallazgos clínicos y patológicos más detallados se describieron en nuestro trabajo publicado previamente 2,26. ResultadosEn el último seguimiento, se observó recidiva tumoral en 29 (41,8%) pacientes, de los cuales 89,7% presentaron recidiva local y 38 (56,7%) pacientes fallecieron. A los 5 años después de la cirugía, la proporción de SSE fue de 33,2 %, la proporción de SG fue de 49,4 % y la proporción sin recidiva (RFP) fue de 48,7 % (Cuadro 2). Distribución de las células inmunitarias en diferentes regiones de interésLa proteína CD117 se encontró predominantemente en la membrana citoplasmática de las células redondeadas (Figura 5A). En el TC y el IM, se localizaron mayoritariamente en el estroma y en el espacio perivascular. En las áreas de OM y PT se observaron las células CD117+ en la cápsula tumoral y en el espacio perivascular. La proteína NKp46 se encontró principalmente en la membrana citoplasmática de las células redondeadas, que estaban presentes dentro de espacios sinusoidales en el TC y el IM, además de estar asociada con el estroma (Figura 5B). En el área de OM y PT, se observaron células NKp46+ en cápsulas alrededor de los nidos tumorales y en el estroma de los tractos portales. La proteína CD1a se encontró en el TC y en el IM, principalmente en la membrana citoplasmática de las células redondeadas (dispersas o en agregados) en el estroma, dentro y a lo largo de los límites de los espacios sinusoidales (Figura 5C). En el área de TP, se observó CD1a+ DC dentro y a lo largo de los límites de los sinusoides y dentro del epitelio biliar en las vías portas. La FA de los mastocitos fue significativamente mayor que la de las células NKp46+ (p < 0,001) (Figura 6). Los iDC CD1a+ en cada ROI mostraron la FA más baja en comparación con los mastocitos y las células NK (p < 0,001) (Figura 6). La FA de las células CD117+ y NKp46+ en TC o IM fue significativamente menor que las del área de PT y OM (p < 0,001) (Figura 6). En el caso de las células CD1a+, la FA no difirió significativamente entre regiones. En la Tabla 3 se muestran asociaciones significativas para las células inmunitarias individuales entre todos los ROI. La Figura 7 muestra el mapa de calor para asociaciones significativas entre diferentes células inmunitarias dentro de diferentes regiones. La FA de los mastocitos CD117+ en el TC se correlacionó significativamente con la FA de CD1a en el TC y el IM. Valor pronóstico de las variables clínicas y anatomopatológicasEntre las variables clínicas y patológicas, solo la menor edad se asoció con un mayor riesgo de recurrencia (HR = 0,96, IC: 0,93-0,99, p = 0,007), mientras que ninguna variable se asoció con SSE y SG (Tabla 4). Valores pronósticos de las células inmunitarias infiltrantesUna FA alta de mastocitos CD117+ en IM se asoció con una SSE más prolongada (HR = 0,48, IC: 0,241 – 0,935, p = 0,031) y SG (HR = 0,34, IC: 0,167 – 0,703, p = 0,004) (Figura 8, Tabla 5). Además, una FA elevada de mastocitos CD117+ en el área de TP se asoció con una SSE más prolongada (HR = 0,48, IC: 0,247 – 0,945, p = 0,034) (Figura 8, Tabla 5). Por el contrario, las FA de las células iDC y NK no se asociaron con ninguno de los resultados. Los mastocitos CD117+ en el margen interno mantuvieron asociaciones significativas con la SSE (HR = 0,46, IC: 0,23-0,91, p = 0,027) y la SG (HR = 0,33, IC: 0,16-0,68, p = 0,003) después del ajuste por estadio TNM (Tabla 6). En cuanto a los mastocitos en la región de TP, la asociación con la SSE también siguió siendo significativa (HR = 0,47, IC: 0,24-0,93, p = 0,029) (Tabla 6). Figura 1: Esquema representativo de los métodos. Diagrama esquemático del flujo de trabajo para la identificación de la función pronóstica de los mastocitos, las células dendríticas y las células asesinas naturales en el CHC. Abreviaturas: FFPE, fijado en formol y embebido en parafina; H&E, hematoxilina y eosina; Retorno de la inversión, regiones de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Captura de pantalla de la ventana del software. Una captura de pantalla descriptiva que muestra el paso de importar imágenes a un proyecto en el software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Captura de pantalla de la opción de fracción de área. Una captura de pantalla del software que muestra los parámetros seleccionados para cuantificar la fracción de área de tinción positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Captura de pantalla de la opción de clasificación de píxeles. Captura de pantalla del software que muestra las celdas DAB positivas antes y después de la clasificación de píxeles. La tinción DAB pardusca se ha convertido en color rojo después de la clasificación de píxeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Inmunotinción representativa de células inmunitarias innatas en pacientes con CHC. Inmunotinción representativa de células (A) CD117+, (B) NKp46+ y (C) CD1a+ en TC (400x) y TIM (200x) de CHC. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; TC: centro de tumores; TIM: margen invasivo tumoral, con margen interno (MI) y margen externo (MO). La línea punteada representa un borde entre el tumor y el tejido no tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Estadísticas que describen la fracción de área de las células inmunitarias innatas en pacientes con CHC. Estadísticas de la fracción de área de las células dendríticas CD1a+, los mastocitos CD117+ y las células NKp46+ NK) en las áreas TC, IM, OM y PT del CHC. Las líneas negras son medianas. Para las comparaciones se utilizó la prueba de pares emparejados de Wilcoxon con corrección de Bonferroni. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; TC: centro de tumores; IM: margen interior; OM: margen exterior; PT: área peritumoral. : p <0.001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Mapa de calor de correlaciones significativas entre fracciones de área de mastocitos, DC y NKs en diferentes regiones de interés. Mapa de calor de correlaciones significativas entre fracciones de área de mastocitos CD117+, CD1a+ DC y NKp46+NKs en TC, IM, OM y PT (Spearman ρ, p < 0,05). Abreviaturas: TC, centro tumoral; IM: margen interior; OM: margen exterior; PT: área peritumoral; DC: células dendríticas; NK: células asesinas naturales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Curvas de SSD y SG de Kaplan-Meier para mastocitos infiltrantes tumorales en pacientes con CHC. Análisis de Kaplan-Meier de la SSE y la SG según la FA baja vs. alta de los mastocitos infiltrantes tumorales en el margen interno (A, C) y PT (B) del CHC. Abreviaturas: CHC, carcinoma hepatocelular; SSE: supervivencia libre de enfermedad; IM: invasivo interno; PT: área peritumoral. La figura ha sido adaptada con permiso de Ali et al.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Antecedentes clínicos de los pacientes con carcinoma hepatocelular inscritos. Antecedentes clínicos de los casos de carcinoma hepatocelular inscritos. Abreviaturas: NAFLD, enfermedad del hígado graso no alcohólico. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Probabilidad estimada de resultados en el análisis de Kaplan-Meier. La probabilidad estimada de RFP, DFS y SG en el análisis de Kaplan-Meier. Abreviaturas: RFP, proporción libre de recurrencia; SSE: supervivencia libre de enfermedad; SG: supervivencia general. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 3: Correlación entre la fracción de área de mastocitos infiltrantes de tumores, células dendríticas y células asesinas naturales en diferentes ROI. Correlación de Spearman (ρ) entre la fracción de área de mastocitos infiltrantes de tumores, células dendríticas y células asesinas naturales en diferentes ROI, p < 0,038. Abreviaturas: TC, centro tumoral; IM: margen interior; OM: margen exterior; PT: área peritumoral; Retorno de la inversión, regiones de interés. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 4: Análisis univariado de las variables clínicas y patológicas asociadas con el tiempo hasta la recurrencia (TTR), la supervivencia libre de enfermedad (SSE) y la supervivencia general (SG). No”, el género femenino o “A” fueron las categorías de referencia para las variables dicotómicas. Los valores en negrita indican significación estadística en el nivel de p < 0,05. Abreviaturas: HR, hazard ratio; IC: intervalo de confianza; TTR: tiempo hasta la recurrencia; SSE: supervivencia libre de enfermedad. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 5: Análisis univariable de la asociación de la fracción de área de mastocitos CD117+, CD1a+denderíticos y NKp46+citocitos naturales con TTR, DFS y SG por región individual de interés utilizando la regresión de Cox (67 pacientes con CHC). La fracción de área de las células inmunitarias por sección de área (mm2) se convirtió en percentiles y luego se clasificó en baja (0-25 percentil) vs alta (25-100 percentil). Los cocientes de riesgo muestran el riesgo relativo en comparación con 1 para la FA baja. Los valores en negrita indican significación estadística en el nivel de p < 0,05. Abreviaturas: AF, fracción de área; SSE: supervivencia libre de enfermedad; SG: supervivencia general; HR, cociente de riesgo. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 6: Fracción de área de mastocitos CD117+ por ROI individual asociada con la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global (análisis multivariante). Análisis multivariado de la asociación de la fracción de área de los mastocitos CD117+ con SSE y SG en el área IM y PT mediante regresión de Cox (67 pacientes con CHC). La fracción de área de las células inmunitarias por sección de área (mm2) se convirtió en percentiles y luego se clasificó en baja (0-24 percentil) vs alta (25-100 percentil). Los cocientes de riesgo muestran el riesgo relativo en comparación con 1 para la FA baja. Los valores en negrita indican significación estadística en el nivel de p > 0,05. Abreviaturas: AF, fracción de área; SSE: supervivencia libre de enfermedad; SG: supervivencia general; HR, cociente de riesgo. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Fichero complementario 1: Script para la creación de ROI. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Mediante la monitorización de la organización inmune in situ en TME, el campo de la inmunooncología puede aportar nuevos biomarcadores pronósticos y predictivos del cáncer. Nuestro artículo publicado anteriormente sobre el papel de las células inmunitarias adaptativas en la EMT del CHC mostró asociaciones pronósticas positivas de las células T CD3+ y CD8+, así como de las células B CD20+ en ROI seleccionadas hasta el tiempo hasta la recurrencia2. En este caso, se utilizó el software de análisis de imágenes QuPath para evaluar la abundancia de CD1a+ iDCs, mastocitos CD117+ y NKp46+ NK en varias regiones distintas de CHC y se evaluó su importancia pronóstica. Debido a las formas irregulares de algunas células inmunitarias innatas, su cuantificación puede ser inexacta. Esta es la razón por la que evaluar la fracción de área de las células inmunopositivas fue la opción óptima. Entre los tres tipos de células, solo los mastocitos CD117+ mostraron un impacto pronóstico significativo: una FA más alta de los mastocitos en el área IM y PT se asoció con una supervivencia más prolongada.

Los mastocitos fueron los más abundantes en todas las ROI, y la asociación de su FA en el área peritumoral y el margen interno con una mejor supervivencia refleja el papel antitumoral de los mastocitos. Los mastocitos pueden ser atraídos hacia el TME por quimioatrayentes liberados por las células tumorales, como SCF o CCL1518. Los mastocitos pueden afectar la respuesta antitumoral mediante citotoxicidad directa a las células tumorales27 o mediante la secreción de citocinas proinflamatorias que pueden inhibir el crecimientotumoral 18. El aumento de la densidad de mastocitos protegió contra la recurrencia del cáncer de próstata28, el cáncer gástrico27 y el CHC después del trasplante hepático29. En una investigación exhaustiva que incluyó una cohorte más grande de 245 pacientes con CHC, se encontró una correlación positiva entre una infiltración más significativa de mastocitos en muestras tumorales y una supervivencia más prolongada después de la reseccióntumoral 30. Rohr-Udilova et al. informaron resultados similares de mayores densidades de mastocitos en el tejido CHC circundante; sin embargo, solo la densidad de mastocitos intratumorales se asoció con una menor tasa de recurrencia29.

En este estudio, los mastocitos ejercieron un efecto antitumoral solo en el hígado IM y PT. La EMT de los diferentes tumores es heterogénea en cuanto a la distribución espacial de las células inmunitarias31. La importancia pronóstica de las células inmunitarias en la EMT también se relaciona críticamente con su distribución espacial32,33. Se han propuesto diferentes enfoques para anotar el margen invasivo del tumor, incluyendo un margen completo de diferentes anchos 4,34,35, márgenes internos y externos, nuevamente con diferentes anchos36,37, con o sin PT 2,7. Seguimos la metodología estandarizada y reproducible del Grupo de Trabajo Internacional de Biomarcadores de Inmunooncología para definir el margen invasivo como una región de 1 mm centrada en el borde que separa los nidos de células malignas del tejido huésped y que representa el tumor central como el área tumoral restante38. Dado que el estudio anterior puso de manifiesto diferencias significativas en los resultados del margeninvasivo interno y externo 2, esas regiones (cada una de 500 μm de ancho) se han analizado por separado. El perfil inmune espacial del área peritumoral tiene una clara importancia predictiva39,40 y, por lo tanto, también se incluyó el área de TP.

El análisis de la CT, el margen tumoral y el hígado del TP se realizó en las WSI, en lugar de la opción de evaluar los campos de visión seleccionados en las regiones respectivas. Las imágenes de portaobjetos completos son una fuente potencialmente rica de datos41. Al no realizar submuestreo, se obtuvo el “verdadero valor esperado” de manera eficiente en el tiempo10. Además, este sistema era razonable porque solo se analizaban 1 o 2 láminas por bloque, lo que nos permitió evitar el sesgo de selección de parches42. La lentitud del flujo de trabajo nos supuso un reto en el estudio anterior cuando se aplicó la estereología para la cuantificación de las células inmunitarias2.

La IHQ permite la localización directa de la expresión de mastocitos CD1a+iDCs, NKp46+NK y CD117+ en el tejido hepático, la cuantificación de sus distribuciones y, por lo tanto, la subclasificación de la cohorte. El análisis de IHQ otorga a este estudio importantes ventajas sobre los ensayos bioquímicos en tejido solubilizado, que pueden conducir a resultados falsos negativos cuando solo están presentes unas pocas células positivas para biomarcadores43 y no reflejan la reacción regional de las células inmunes a las características histopatológicas44. La IHQ también es preferible al análisis en secciones teñidas con H&E. Los estudios sobre el cáncer colorrectal y el cáncer de pulmón de células pequeñas mostraron que la evaluación de las secciones teñidas con H&E podría proporcionar biomarcadores inmunitarios tumorales cuantitativos robustos 45,46,47; Sin embargo, todavía existen limitaciones para reflejar la presencia real de subtipos específicos.

La alta calidad de las secciones de tejido y la tinción IHQ es un requisito previo para una evaluación precisa. Un fondo alto, artefactos de borde y tinción específica pero no deseada (por ejemplo, tinción de células endoteliales de espacios sinusoidales hepáticos con anticuerpos anti-CD4) pueden corromper todos los resultados. Un anticuerpo CD56 fue la primera opción en el estudio actual para detectar células asesinas naturales, pero fue reemplazado por el anticuerpo NKp46 debido a la expresión de CD56 en conductos biliares inmaduros. La selección del marcador más apropiado en términos de especificidad, patrón de tinción robusto y estabilidad en bloques FFPE representa otro tema a considerar. Por ejemplo, se eligió CD117 en lugar de triptasa porque la expresión de triptasa puede estar fuertemente regulada a la baja, además, las células que no expresan CD117 no son mastocitos48.

QuPath ofrece la opción de suavizar los bordes del ROI desde el exterior y eliminar cualquier artefacto, vasos grandes, tejido necrótico, tinción inespecífica, fondo y agregación de eritrocitos que no deberían formar parte del ROI. El operador debe seleccionar el ROI y presionar la tecla “Alt” mientras anota esos artefactos. En este estudio se eliminaron las tinciones inespecíficas como artefactos antes de la cuantificación, por lo que no afectaron los resultados. En caso de tinción específica sistemáticamente baja o antecedentes altos, se debe revisar el protocolo para evitar posibles sesgos. El umbral se ajustó para cada caso con una tinción positiva específica débil. Antes de cualquier uso rutinario, el protocolo debe optimizarse. Todos los análisis deben realizarse de manera ciega e, idealmente, la precisión de los umbrales merece una verificación cruzada.

QuPath es una solución fácil de usar, intuitiva, extensible y de código abierto para patología digital y análisis de imágenes de portaobjetos completos9, probada previamente para el análisis de imágenes en HCC49 y diferentes cánceres50,51. Las principales ventajas son la facilidad de manejo del software para las WSI y las opciones de anotación de regiones de interés (por ejemplo, áreas tumorales o peritumorales).

La aplicación de scripts existentes, modificados o creados de novo puede acelerar sustancialmente el análisis. Se aplicó el script para crear anotaciones para los ROI, lo que permitió una segmentación regional rápida y precisa en lugar de una delineación manual. El script no es fijo y se puede personalizar fácilmente a márgenes inferiores a 500 μm para regiones con límites de tejido insuficientes. El ancho del área IM, OM o PT se puede personalizar a través del editor de scripts Automate > Show > adaptando la línea 30 Doble Margen de Expansión Microcras = 500 μm al ancho disponible > Ejecutar. Los ROI también se pueden agregar o eliminar. En general, los flujos de trabajo en el software no son fijos y el operador es libre de desarrollarlos y modificarlos.

Una gran cantidad de herramientas de software disponibles para el análisis de imágenes patológicas, incluidas CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser y otras, están disponibles ahora. Sin embargo, QuPath se distingue por un conjunto de ventajas, como la arquitectura de código abierto, la interfaz fácil de usar, las capacidades de personalización de algoritmos y la integración de herramientas avanzadas de aprendizaje automático. Esas características posicionan colectivamente a este software de análisis de imágenes como una opción sólida para el análisis matizado de tejidos cancerosos en el ámbito de la patología digital.

QuPath mostró la menor variabilidad en comparación con el software comercial HALO (IndicaLab) y QuantCenter (3DHistech) para la detección de la expresión de Ki67 en el cáncer de mama52. El software también posee el potencial de ser instruido para ejecutar un script para todas las imágenes del proyecto de una manera reproducible de procesamiento por lotes.

QuPath nos permitió crear datos cuantitativos continuos en lugar de ordinales (semicuantitativos). Los datos ordinales obtenidos por puntuación visual están plagados de problemas debido a la subjetividad en la interpretación, la variabilidad interobservador y la escasa reproducibilidad53. La rapidez del análisis actual mejoró por el hecho de que las personas sin amplia formación en histopatología y experiencia en programación pueden realizar análisis automáticos, siempre que la precisión de las anotaciones haya sido verificada por un patólogo. Un estudio sobre tumores de cabeza y cuello demostró la idoneidad de QuPath para la evaluación rápida y reproducible del valor pronóstico de los linfocitos infiltrantes de tumores CD57+50. El estudio también mostró una concordancia sustancial entre los observadores humanos y QuPath. También se presentó una alta concordancia entre la observación manual y la evaluación mediante QuPath en el cáncer oral54 y el cáncer de mama55. El trabajo mencionado anteriormente comparó la cuantificación IHQ de 5 biomarcadores clínicos de cáncer de mama utilizando QuPath y 2 productos de software comercial (Definiens, Tissue Studio e inForm) con una puntuación manual realizada por un patólogo. A lo largo de este estudio, QuPath mostró consistentemente el mejor rendimiento, así como el menor tiempo para configurarse y aplicarse, demostrando así ser una excelente alternativa futura al monitoreo visual y al software comercial. Incluso en comparación con ImageJ, el software de código abierto más conocido para el análisis de imágenes biomédicas, QuPath sobresale en el manejo de WSI de gran tamaño56.

Existe un foro abierto en línea para QuPath donde los usuarios publican sus preguntas sobre los métodos de patología digital y presentan una comunidad activa y comprometida para apoyar el desarrollo de herramientas para el análisis de imágenes (https://forum.image.sc/tag/qupath).

La cohorte utilizada en este estudio fue única y no representativa de la población general con CHC porque abarcó solo a los pacientes que eran aptos para la resección hepática. En general, una minoría de pacientes con CHC (20-30%) son elegibles para la resección hepática57. Esto también podría ser una razón por la que menos pacientes tenían cirrosis confirmada, ya que los pacientes con esta etiología de CHC probablemente tenían puntuaciones de Child-Pugh más altas y no se consideraban resecables. La cohorte también era bastante pequeña, y la mayoría de los pacientes tenían una etapa temprana de TNM de la enfermedad. Por lo tanto, la extrapolación de los resultados a otras poblaciones debe hacerse con precaución.

En el estudio actual, la abundancia de células inmunitarias innatas en el microambiente del CHC se ha estimado mediante la evaluación de su FA, ya que el recuento preciso de células inmunitarias de forma irregular, como las células dendríticas, puede resultar difícil. Por otro lado, la fracción de área de las células inmunitarias suele correlacionarse fuertemente con sus densidades58. El marcaje de inmunoperoxidasa proporciona datos para la localización del antígeno, la fracción de área o la densidad de las células que lo expresan, pero la intensidad de la tinción no está relacionada linealmente con la cantidad de antígeno. Por lo tanto, la IHQ no debe utilizarse para evaluar cuantitativamente el nivel de expresión de una proteína en particular. La precisión del método también depende de la uniformidad del grosor de la sección, la calidad de la imagen y la resolución seleccionada para la clasificación de píxeles. Los resultados del análisis de imágenes deben validarse y tratarse con precaución. Dado que un solo marcador no puede capturar completamente la complejidad de las células inmunitarias, se necesitan más marcadores IHQ y tinción multiplex para obtener una imagen fiable de la ETM inmunitaria del CHC. El uso de un solo marcador IHQ para el fenotipado de células inmunitarias representa una aproximación, y los resultados deben interpretarse con precaución.

El uso del software de análisis de imágenes QuPath para evaluar portaobjetos teñidos con IHQ nos permitió evaluar la distribución y la fracción de área de iDC locales, mastocitos y NK en pacientes tumorales y peritumorales de CHC y, a continuación, analizar su relación con el pronóstico. La abundancia de mastocitos en el margen interno y el hígado peritumoral del CHC se relaciona con una SSE y una SG más prolongadas, lo que pone de relieve los efectos antitumorales de esas células inmunitarias innatas. El flujo de trabajo analítico de QuPath es fácil de usar, rápido y fácil de usar, con configuraciones predeterminadas útiles y una fácil exportación de datos. Este software ha sido avalado como una plataforma prometedora para el análisis de imágenes digitales, que podría satisfacer la necesidad de reproducibilidad, consistencia y precisión en la patología digital.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos las contribuciones de Mons. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Facultad de Ciencias, Universidad Carolina) para el escaneo de portaobjetos completos y el proyecto “e-Infrastruktura CZ” (e-INFRA LM2018140), que nos proporcionó los recursos computacionales para este estudio. Los técnicos Jana Dosoudilova y Jan Javurek son reconocidos por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue financiada por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, subvención N°856620, y el Ministerio de Salud de la República Checa, subvención AZV NU21-03-00506, y por el Programa Cooperatio (Disciplinas quirúrgicas). La instalación central de microscopía de Vinicna está cofinanciada por el gran proyecto de RI Czech-BioImaging LM2023050.

Materials

Anti-CD1a Leica Biosystems PA0235 Identifier- immature dendritic cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
Anti-CD117 Leica Biosystems  PA0007 Identifier- mast cells; RTU, Protocol F, ER2/20 min
BOND Plus Microscope Slides Leica Biosystems, Germany S21.2113.A
BOND RXm Leica Biosystems 49.1501 Fully Automated IHC Stainer  
Bond Aspirating Probe Cleaning Kit Leica Biosystems CS9100
Bond Dewax Solution Leica Biosystems AR9222
Bond Polymer Refine Detection Kit Leica Biosystems DS9800
BondTM Epitope Retrieval 2 Leica Biosystems AR9640
BondTM Primary Antibody Diluent Leica Biosystems AR9352
BondTM Wash Solution 10X Concentrate Leica Biosystems AR9590
Computer Specifications: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz Installed RAM: 128 G Intel A 64-bit operating system that has Windows 7. Any computer with Java-based operating system and Excel available
Coverslips Leica Biosystems, Germany 14071135636
CV Mount Leica Biosystems, Germany 14046430011
CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper Leica Biosystems 149CVTS5025
Drying Oven UN30 Memmert GmbH  UN30
GraphPad Prism 9.0 GraphPad Software LLC  Version 12
Human NKp46/NCR1 Antibody, Monoclonal Mouse IgG2B Clone # 195314 R&D Systems, Inc., United States MAB1850 Identifier- natural killer cells; Dilution 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min
Leica HI1210 – Water Bath Leica Biosystems 14041521466
Protein Block Agilent Dako, United States X0909
QuPath 0.3.2 or higher versions  version (QuPath v.0.3.2) 
RM2235 Rotary Microtome Leica Biosystems 149AUTO00C1
ST5020 Multistainer Slide Stainer Leica Biosystems DEV-ST5010-CV5030
Statistica StatSoft Inc. version 7
Zeiss Axio Scan.Z1 ScienceServices GmbH, Germany 430038-9000-000  Slide scanner 
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Ali, E., Červenková, L., Pálek, R., Ambrozkiewicz, F., Pavlov, S., Ye, W., Hošek, P., Daum, O., Liška, V., Hemminki, K., Trailin, A. Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software. J. Vis. Exp. (206), e66743, doi:10.3791/66743 (2024).
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