תאי פיטום במיקרו-סביבה של קרצינומה הפטוצלולרית מעניקים פרוגנוזה חיובית: מחקר רטרוספקטיבי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה QuPath

באמצעות ניטור ארגון החיסון באתרו ב- TME, תחום האימונו-אונקולוגיה יכול להוסיף סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים לסרטן. המאמר שלנו שפורסם בעבר על תפקידם של תאי מערכת החיסון הנרכשת ב- TME של HCC הראה קשרים פרוגנוסטיים חיוביים של תאי T CD3+ ו- CD8+ וכן תאי CD20+ B ב- ROI נבחרים עד לזמן להישנות². כאן, תוכנת ניתוח התמונה QuPath שימשה להערכת השפע של CD1a+ iDCs, תאי פיטום CD117+ ותאי NK NKp46+ במספר אזורים שונים של HCC והעריכה את המשמעות הפרוגנוסטית שלהם. בשל הצורות הלא סדירות של חלק מתאי מערכת החיסון המולדת, הכימות שלהם יכול להיות לא מדויק. זו הסיבה שהערכת חלק השטח של תאים חיוביים למערכת החיסון הייתה האפשרות האופטימלית. מבין שלושת סוגי התאים, רק תאי פיטום CD117+ הדגימו השפעה פרוגנוסטית משמעותית: מיקוד אוטומטי גבוה יותר של תאי פיטום באזור ה-IM ואזור ה-PT היה קשור להישרדות ארוכה יותר.

תאי פיטום היו הנפוצים ביותר בכל ה-ROIs, והקשר של המיקוד האוטומטי שלהם באזור הפריטומור והשוליים הפנימיים עם הישרדות טובה יותר משקף את התפקיד האנטי-סרטני של תאי פיטום. תאי פיטום יכולים להימשך לתוך TME על ידי כימותרפיה משוחררת תאי גידול, כגון SCF או CCL15¹⁸. תאי פיטום יכולים להשפיע על תגובה אנטי-סרטנית על ידי ציטוטוקסיות ישירה לתאי הגידול²⁷ או על ידי הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים שיכולים לעכב את צמיחת הגידול¹⁸. צפיפות תאי פיטום מוגברת הגנה מפני הישנות סרטן הערמונית²⁸, סרטן קיבה²⁷ ו- HCC לאחר השתלת כבד²⁹. מחקר מקיף שכלל עוקבה גדולה יותר של 245 חולי HCC מצא מתאם חיובי בין חדירת תאי פיטום משמעותית יותר בדגימות גידול לבין הישרדות ממושכת יותר לאחר כריתת גידול³⁰. Rohr-Udilova et al. דיווחו על תוצאות דומות של צפיפות גדולה יותר של תאי פיטום ברקמת HCC שמסביב; עם זאת, רק צפיפות תאי פיטום תוך סרטניים הייתה קשורה לשיעור הישנות נמוך יותר²⁹.

במחקר זה, תאי פיטום הפעילו השפעה אנטי-סרטנית בכבד IM ו-PT בלבד. ה-TME של גידולים שונים הוא הטרוגני לגבי ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון³¹. המשמעות הפרוגנוסטית של תאי מערכת החיסון ב-TME קשורה באופן קריטי גם להתפלגותם המרחבית ^32,33. הוצעו גישות שונות לביאור השוליים החודרניים של הגידול, כולל שוליים שלמים ברוחב שונה ^4,34,35, שוליים פנימיים וחיצוניים, שוב ברוחב שונה^36,37, עם או בלי PT ^2,7. עקבנו אחר המתודולוגיה המתוקננת והניתנת לשחזור של קבוצת העבודה הבינלאומית לאימונואונקולוגיה כדי להגדיר את השוליים הפולשניים כאזור של 1 מ”מ שבמרכזו הגבול המפריד בין קיני התאים הממאירים לבין הרקמה המארחת ומייצג את הגידול המרכזי כאזור הגידול הנותר³⁸. מאז המחקר הקודם הדגיש הבדלים משמעותיים בתוצאות של שוליים פולשניים פנימיים וחיצוניים², אזורים אלה (כל 500 מיקרומטר רוחב) נותחו בנפרד. לפרופיל החיסוני המרחבי של אזור הפריטומור יש חשיבות ניבוי מובהקת^39,40, ולכן נכלל גם אזור ה-PT.

ניתוח של TC, שולי הגידול וכבד PT בוצע ב- WSIs בניגוד לאפשרות להעריך שדות ראייה נבחרים באזורים המתאימים. הדמיית שקופית שלמה היא מקור פוטנציאלי עשיר של נתונים⁴¹. מכיוון שלא ביצענו תת-דגימה, “הערך האמיתי הצפוי” התקבל באופן יעיל בזמן¹⁰. בנוסף, מערכת זו הייתה סבירה מכיוון שנותחו רק 1 או 2 שקופיות לכל בלוק, מה שאפשר לנו להימנע מההטיה של בחירת טלאים⁴². זרימת העבודה האיטית אתגרה אותנו במחקר הקודם כאשר יושמה הסטרולוגיה לכימות תאי מערכת החיסון².

IHC מאפשר לוקליזציה ישירה של ביטוי תאי פיטום CD1a+ iDCs, NKp46+NK ו-CD117+ ברקמת הכבד, כימות ההתפלגויות שלהם, ולכן תת-סיווג של הקוהורט. ניתוח IHC מעניק למחקר זה יתרונות חשובים על פני בדיקות ביוכימיות ברקמה מסיסה, אשר עלולות להוביל לתוצאות שליליות כוזבות כאשר רק תאים חיוביים ביולוגיים מעטים נמצאים⁴³ ואינם משקפים את התגובה האזורית של תאי מערכת החיסון למאפיינים היסטופתולוגיים⁴⁴. IHC עדיף גם על ניתוח בסעיפים מוכתמים ב-H&E. מחקרים על סרטן המעי הגס וסרטן הריאה של תאים קטנים הראו כי הערכה של חלקים מוכתמים ב- H&E יכולה לספק סמנים ביולוגיים חזקים וכמותיים של גידולים חיסוניים 45,46,47; עם זאת, עדיין קיימות מגבלות שישקפו את נוכחותם בפועל של תת-סוגים ספציפיים.

איכות גבוהה של קטעי רקמות וצביעת IHC היא תנאי מוקדם להערכה מדויקת. רקע גבוה, ממצאים בקצה וצביעה ספציפית אך לא רצויה (למשל, צביעה של תאי אנדותל של חללים סינוסואידים בכבד עם נוגדנים נגד CD4) עלולים להשחית את כל התוצאות. נוגדן CD56 היה הבחירה הראשונה במחקר הנוכחי לזיהוי תאי הרג טבעיים, אך הוחלף בנוגדן NKp46 עקב ביטוי CD56 בצינורות מרה לא בוגרים. בחירת הסמן המתאים ביותר מבחינת ספציפיות, דפוס צביעה חזק ויציבות בגושי FFPE מייצגת נושא נוסף שיש לקחת בחשבון. לדוגמה, CD117 נבחר במקום טריפטאז מכיוון שביטוי טריפטאז עשוי להיות מווסת מאוד, חוץ מזה, תאים שאינם מבטאים CD117 אינם תאי פיטום⁴⁸.

QuPath נותן את האפשרות להחליק את גבולות החזר ההשקעה מבחוץ ולהסיר כל חפץ, כלי דם גדולים, רקמה נמקית, צביעה לא ספציפית, רקע וצבירה של אריתרוציטים שלא אמורים להיות חלק מההחזר על ההשקעה. המפעיל צריך לבחור את החזר ההשקעה וללחוץ על מקש “Alt” תוך ביאור ממצאים אלה. צביעה לא ספציפית בוטלה במחקר זה כממצאים לפני הכימות כך שלא השפיעה על התוצאות. במקרה של צביעה ספציפית נמוכה באופן שיטתי או רקע גבוה, יש לבדוק את הפרוטוקול כדי למנוע הטיה אפשרית. הסף הותאם לכל מקרה עם כתם חיובי ספציפי חלש. לפני כל שימוש שגרתי, יש לייעל את הפרוטוקול. כל הניתוחים צריכים להיעשות בצורה עיוורת ובאופן אידיאלי, דיוק הסף ראוי להצלבה.

QuPath הוא פתרון קוד פתוח ידידותי למשתמש, אינטואיטיבי, ניתן להרחבה, עבור פתולוגיה דיגיטלית וניתוח תמונות שקופיות שלמות⁹, נבדק בעבר עבור ניתוח תמונה ב- HCC⁴⁹ וסוגי סרטן שונים^50,51. התפעול הקל של התוכנה עבור WSIs והאפשרויות לביאור אזורי עניין (למשל, אזורים גידוליים או פריטומורליים) הם היתרונות העיקריים.

יישום של סקריפטים קיימים, ששונו או שנוצרו דה נובו עשוי להאיץ באופן משמעותי את הניתוח. הוחל סקריפט ליצירת ביאורים עבור ROIs, מה שאפשר פילוח אזורי מהיר ומדויק במקום תיחום ידני. הסקריפט אינו קבוע, וניתן להתאים אותו בקלות לשוליים של פחות מ- 500 מיקרומטר עבור אזורים עם גבולות רקמה לא מספיקים. ניתן להתאים אישית את רוחב האזור IM, OM או PT באמצעות עורך הסקריפט Automate > Show > התאמת השורה 30 מיקרון מרווח הרחבה כפול = 500 מיקרון לרוחב הזמין > הפעלה. ניתן גם להוסיף או להסיר החזר השקעה. באופן כללי, זרימות העבודה בתוכנה אינן קבועות, והמפעיל חופשי לפתח ולשנות אותן.

שפע של כלי תוכנה זמינים לניתוח תמונות פתולוגיות, כולל CellProfiler, ImageJ, פיג’י, Microscopy Image Browser, ואחרים, זמינים כעת. עם זאת, QuPath מבדילה את עצמה באמצעות שורה של יתרונות כגון ארכיטקטורת קוד פתוח, ממשק ידידותי למשתמש, יכולות התאמה אישית של אלגוריתמים ושילוב של כלי למידת מכונה מתקדמים. תכונות אלה יחד מציבות תוכנת ניתוח תמונה זו כבחירה חזקה לניתוח ניואנסים של רקמות סרטניות בתחום הפתולוגיה הדיגיטלית.

QuPath הראתה את השונות הנמוכה ביותר בהשוואה לתוכנות מסחריות HALO (IndicaLab) ו-QuantCenter (3DHistech) לזיהוי ביטוי Ki67 בסרטן השד⁵². התוכנה גם בעלת פוטנציאל לקבל הוראה להריץ סקריפט עבור כל תמונות הפרויקט באופן עיבוד אצווה הניתן לשחזור.

QuPath אפשרה לנו ליצור נתונים רציפים כמותיים במקום נתונים סדירים (כמותיים למחצה). נתונים סודרים המתקבלים על ידי ניקוד חזותי טומנים בחובם בעיות הנובעות מסובייקטיביות בפרשנות, שונות בין צופים ויכולת שחזור ירודה⁵³. מהירות הניתוח הנוכחי שופרה על ידי העובדה שאנשים ללא רקע היסטופתולוגי נרחב ומומחיות תכנות יכולים לבצע ניתוח אוטומטי, בתנאי שדיוק הביאורים נבדק על ידי פתולוג. מחקר על גידולי ראש וצוואר הדגים את התאמתו של QuPath להערכה מהירה וניתנת לשחזור של הערך הפרוגנוסטי של לימפוציטים חודרי גידול CD57+⁵⁰. המחקר הראה גם קונקורדנציה משמעותית בין משקיפים אנושיים לבין QuPath. התאמה גבוהה בין תצפית ידנית להערכה באמצעות QuPath הוצגה גם בסרטן הפה⁵⁴ ובסרטן השד⁵⁵. המאמר הנ”ל השווה את כימות IHC של 5 סמנים ביולוגיים קליניים של סרטן השד באמצעות QuPath ו -2 מוצרי תוכנה מסחריים (Definiens Tissue Studio ו- inForm) עם ניקוד ידני על ידי פתולוג. לאורך מחקר זה, QuPath הציגה באופן עקבי את הביצועים הטובים ביותר, כמו גם את הזמן הנמוך ביותר להתקנה ויישום, ובכך הראתה כחלופה עתידית מצוינת לניטור חזותי ותוכנה מסחרית. אפילו בהשוואה ל-ImageJ, תוכנת הקוד הפתוח הידועה ביותר לניתוח תמונות ביו-רפואיות, QuPath מצטיינת בהתמודדות עם WSIs⁵⁶ גדולים.

קיים פורום מקוון פתוח עבור QuPath שבו משתמשים מפרסמים את שאלותיהם על שיטות פתולוגיה דיגיטלית ומציגים קהילה פעילה ומעורבת לתמיכה בפיתוח כלים לניתוח תמונות (https://forum.image.sc/tag/qupath).

הקבוצה ששימשה במחקר זה הייתה ייחודית ולא ייצגה את האוכלוסייה הכללית עם HCC מכיוון שהיא הקיפה רק חולים שהיו זכאים לכריתת כבד. באופן כללי, מיעוט מהחולים עם HCC (20%-30%) זכאים לכריתת כבד⁵⁷. זו יכולה להיות גם סיבה לכך שפחות חולים אישרו שחמת הכבד מכיוון שחולים עם אטיולוגיה זו של HCC כנראה היו בעלי ציוני Child-Pugh גבוהים יותר ולא נחשבו לכריתה. הקבוצה הייתה גם קטנה למדי, ולרוב החולים היו שלבים מוקדמים של TNM של המחלה. לכן, אקסטרפולציה של התוצאות לאוכלוסיות אחרות צריכה להיעשות בזהירות.

במחקר הנוכחי, השפע של תאי מערכת החיסון המולדת במיקרו-סביבה HCC הוערך באמצעות הערכה של המיקוד האוטומטי שלהם, שכן ספירה מדויקת של תאי חיסון בעלי צורה לא סדירה כמו תאים דנדריטיים יכולה להיות קשה. מצד שני, חלק השטח של תאי החיסון בדרך כלל מתואם מאוד עם צפיפותם⁵⁸. תיוג אימונופרוקסידאז מספק נתונים עבור לוקליזציה של האנטיגן, חלק השטח או צפיפות התאים המבטאים אותו, אך עוצמת הצביעה אינה קשורה ליניארית לכמות האנטיגן. לכן, אין להשתמש ב-IHC כדי להעריך כמותית את רמת הביטוי של חלבון מסוים. דיוק השיטה תלוי גם באחידות עובי המקטע, איכות התמונה והרזולוציה שנבחרה לסיווג פיקסלים. כל תוצאה של ניתוח תמונה צריכה להיות מאומתת ומטופלת בזהירות. מאחר שסמן יחיד אינו יכול ללכוד באופן מלא את המורכבות של תאי מערכת החיסון, נדרשים סמני IHC נוספים וצביעת מולטיפלקס כדי לקבל תמונה אמינה של TME החיסון של HCC. שימוש בסמן IHC יחיד בלבד לפנוטיפ תאי מערכת החיסון מהווה קירוב, ויש לפרש את התוצאות בזהירות.

השימוש בתוכנת ניתוח התמונות QuPath להערכת שקופיות מוכתמות ב-IHC אפשר לנו להעריך את הפיזור ואת חלק השטח של iDCs מקומיים, תאי פיטום ו-NKs בגידולים ובגידולים היקפיים של חולי HCC ולאחר מכן לנתח את הקשרים שלהם עם פרוגנוזה. השפע של תאי פיטום בשוליים הפנימיים ובכבד ההיקפי של HCC קשור ל-DFS ומערכת הפעלה ארוכים יותר, מה שמדגיש את ההשפעות האנטי-סרטניות של תאי מערכת החיסון המולדת האלה. תהליך העבודה האנליטי של QuPath ידידותי למשתמש, מהיר וקל לשימוש, עם הגדרות ברירת מחדל מועילות וייצוא נתונים קל. תוכנה זו אושרה כפלטפורמה מבטיחה לניתוח תמונות דיגיטליות, שיכולה לענות על הצורך בשחזור, עקביות ודיוק בפתולוגיה דיגיטלית.