Farede Naif CD4⁺ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

Güneydoğu Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Kurumsal İnceleme Komitesi, bu çalışmada ayrıntılı olarak açıklanan ve hem yerel hem de kurumsal ofis standartlarına uygun olarak yürütülen tüm hayvan çalışmalarını onayladı. Dalak örnekleri C57BL6/J farelerden alındı. Yaşları 5 ila 8 hafta arasında değişen hem dişi hem de erkek fareler bu çalışmaya dahil edildi. Kültür ortamı ve tampon 4 ° C’de 1 aya kadar saklandı. Cerrahi aletler kullanılmadan önce otoklavlandı. Cildin, gözlerin ve giysilerin reaktiflerle kirlenmesini önlemek için lateks eldiven ve maske kullanın; Cilt ve gözler için bol su veya tuzlu su kullanın. 1. 24 oyuklu doku kültürü plakasının anti-CD3 ile önceden kaplanması Anti-CD3’ü steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya RPMI 1640 ortamında 1 μg / mL’lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasını 1 mL anti-CD3 çözeltisi (1 μg / mL) ile iyice doldurun; Daha sonra kuyuyu parafilm ile örtün. Anti-CD3 kaplı plakayı buzdolabında (2 °C-8 °C) 16 saat bekletin veya 37 °C’de bir hücre inkübatöründe 2-3 saat tutun. 2. Fare dalak izolasyonu ve dalak tek hücreli süspansiyonun hazırlanması % 3 izofluran ile C57BL / 6J’de tam anestezi indükleyin ve% 100 karbondioksiti 2 dakika soluyarak ötenazi yapın. Farelerin ölümünden hemen sonra, kontaminasyonu önlemek için dezenfeksiyon için% 75 etanole batırın. Fareyi temiz bir bankın üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin, karnın orta hattı boyunca kesin ve karın yapılarını katman katman ayırın. Büyük omentumu ve mideyi cımbızla nazikçe açın, dalağı gastroplenik ligament ile nazikçe dışarı çekin ve sağlam bir dalak elde etmek için dalağı çevre dokulardan ve bağlardan kör bir şekilde ayırın (dalağın ezilmesini veya yırtılmasını önlemek için dikkatli olun).NOT: Steril bir durumu korumak için, steril süper temiz bir tezgahta aşağıdaki işlem gerçekleştirilir. 70 μm’lik bir hücre filtresini 100 mm’lik steril bir kültür kabına yerleştirin, dalağı hücre süzgecine ekleyin ve bir şırınga pistonu ile ezin. Aynı zamanda, tüm hücreleri filtreden kültür kabına itmek için 5-8 mL homojenat yıkama sıvısı ekleyin.NOT: Lenfosit ayırma sıvısı kitinin bileşimi Malzeme Tablosunda görülebilir. Süzüntüyü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini, lenfosit ayırma kiti veya PBS veya RPMI 1640 ortamı ile sağlanan numune seyreltici ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonunu 2 × 108-1 × 109 hücre / mL’ye ayarlayın.NOT: Tipik olarak, bir dalak için 4-6 mL numune seyreltici gereklidir. Bir santrifüj tüpünde, doku tek hücreli süspansiyonu ile aynı miktarda lenfosit ayırma çözeltisi alın. Tek hücreli süspansiyonu lenfosit ayırma solüsyonunun yüzeyine dikkatlice pipetleyin ve 800 × g, 25 ° C’de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjün Hızlanma ve Yavaşlamasını uygun bir aralığa ayarlayın (örneğin, normal 3 ila 1 vites varsa 9’e ayarlayın).NOT: Lenfosit ayırma çözeltisi 3 mL’den az olmamalıdır. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpündeki dört katmanı yukarıdan aşağıya doğru gözlemleyin. İlk katman, numune seyrelticisine karşılık gelir, ardından halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakası gelir. Üçüncü katman ayırma sıvısıdır ve dördüncü katman kırmızı kan hücrelerinden oluşur. Halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakasının ikinci tabakasını başka bir santrifüj tüpüne dikkatlice çekmek için bir pipet kullanın ve hücreleri karıştırmak için santrifüj tüpüne 10 mL temizleme solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre sayımı için hücre peletini yeniden süspanse etmek için 10 mL RPMI 1640 ortamı kullanın. 3. Manyetik boncukların negatif seçimine dayalı olarak saf CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması NOT: El değmemiş ve yüksek oranda saflaştırılmış naif CD4 + T hücrelerini (CD4 + CD44lowCD62Lhigh) immünmanyetik negatif seçim ile fare splenositlerinden izole edin. Numuneyi 0.1-2 mL hacim aralığında 1 × 108 hücre/mL olacak şekilde hazırlayın. 50 μL / mL sıçan serumu ekleyin ve numuneyi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.NOT: Naif CD4 T hücre sıralama kitinin bileşimi Malzeme Tablosunda görülebilir. Numuneye 50 μL/mL İzolasyon Kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 7,5 dakika inkübe edin. Numuneye 50 μL/mL Tükenme Kokteyli ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin. Eşit dağılmayı sağlamak için manyetik boncukları girdaplayın. Numuneye 75 μL/mL manyetik boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin.NOT: Parçacıklar eşit olarak dağılmış görünmelidir; Vorteksleme süresi 30 saniyeden az olmamalıdır. Numuneyi RPMI 1640 orta ile 2,5 mL’lik bir nihai hacme kadar doldurun. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek birkaç kez karıştırın. Tüpü (kapaksız) mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin. Mıknatısı kaldırarak, mıknatısı ve tüpü tek bir sürekli hareketle ters çevirin vezenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dökün.NOT: Tüpü ve mıknatısı dik konuma getirmeden önce 2-3 saniye ters çevirin. Tüpün ağzında kalabilecek hiçbir damlayı rahatsız etmeyin. Bir hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin. İzolasyondan önce ve sonra naif CD4 + T hücreleri için akış sitometrik analizi yapın (Şekil 1). Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 200-500 μL RPMI 1640 ortamında (% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş) yeniden süspanse edin. Her 1 mL hücre kültürü için (ör., ~ 106 hücre / mL), 2 μL lökosit aktivasyon kokteyli ekleyin ve karıştırın. Hücreleri bir CO2 inkübatöründe 37 ° C’de ve 4-6 saat boyunca doymuş nemde kültürleyin.NOT: Hücreler her 1-2 saatte bir girdaplandı. Hücreleri 400 × g’da, 4 °C’de 5 dakika santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri 200 μL PBS’de yeniden süspanse edin. Hücrelere 1 μL Fc bloker ekleyin (ör., ~ 106 hücre / mL). Hücreleri 4 ° C’de 10 dakika inkübe edin. Hücreleri bir kez 1 mL PBS ile 4 ° C’de 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL PBS’de yeniden süspanse edin. Antikor kokteyli ekleyin (Sabitlenebilir Canlı Boya, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) ve hücreleri karanlıkta 4 ° C’de 15-20 dakika inkübe edin. Hücreleri 2 x 1 mL PBS ile yıkayın ve ardından 4 ° C’de 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri 250 μL sabit tamponda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C’de 40-60 dakika inkübe edin.NOT: Düzeltme tamponu, geçirgenleştirme seyrelticisi ile seyreltilmesi gereken 3x stok çözeltisi olan Foxp4/transkripsiyon faktörü boyama tamponu ile sağlanır. Hücreleri 300 × g, 4 ° C’de 5 dakika santrifüjleyerek hücreleri 2x yıkamak için 1 mL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin. Süpernatanı atın, hücreleri 200 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikoru (Foxp3 [nükleer], 1:200) hücrelere ekleyin. Fiksasyon ve membran yırtılmasından sonra, hücre-antikor karışımlarını karanlıkta 40-60 dakika inkübe edin ve ara sıra 4 ° C’de kısa süreler boyunca çalkalayın.NOT: Geçirgenleştirme/Yıkama solüsyonu, PBS ile kullanılmadan önce seyreltilmesi gereken 10x stok solüsyonudur. 4. Patojenik Th17 hücrelerinin in vitro indüksiyonu Kullanmadan önce steril PBS’yi önceden kaplanmış 24 oyuklu plakalardan çıkarın. Th17 hücre kültürü ortamı (Tablo 1) ve Th0 hücre kültürü ortamı (Tablo 1), klasik patojenik olmayan Th17 kültür ortamı (Tablo 1) ve klasik patojenik Th17 kültür ortamı (Tablo 1) dahil olmak üzere kültür için kontrast ortamı kullanın. Zenginleştirilmiş saf CD4 + T hücrelerini yeniden süspanse edin ve aynı 24 oyuklu plakada (anti-CD3 ile önceden kaplanmış) farklı oyuklara dağıtın, konsantrasyonu 4 × 105 hücre / mL’ye ayarlayın, her kuyucukta 1 mL ortam ile. Her oyuğa 1 μL / mL anti-CD28 çözeltisi (son konsantrasyon: orta ila 2 μg / mL ile seyreltilmiş) ekleyin. Hücreleri 5 gün boyunca 37 ° C’de% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için dikkatlice pipetleyerek hücre kültürü süpernatan ortamını kültür ortamıyla (Th0, patojenik olmayan Th17, klasik patojenik Th17 ve objektif Th17) değiştirin, hücreleri içeren ortamın yarısını atın ve ardından 2. günde atılan hacmine eşit yeni ortam ekleyin. 4. günde tekrarlayın. Hücreleri 5. günde optik mikroskop altında gözlemleyin (Şekil 2). Her gruptan hücre süpernatantlarını toplayın ve -80 °C’de dondurarak saklayın. 5. Patojenik Th17 ve Th0 hücre farklılaşması için akış sitometrik analizi Kültürün başlamasından 5 gün sonra tüm hücreleri (kuyu başına) hasat edin. 3.12-3.15 adımlarını gerçekleştirin. Bir antikor kokteyli ekleyin (Sabitlenebilir Canlılık Boyası, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) ve hücreleri karanlıkta 4 ° C’de 15-20 dakika inkübe edin. 3.17-3.19 adımlarını gerçekleştirin. Süpernatanı atın, hücreleri 200 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikor kokteylini ekleyin (IL-17A [hücre içi], 1:200; RORγT [nükleer], 1:200) hücrelere. Fiksasyon ve membran yırtılmasından sonra, hücre-antikor karışımlarını karanlıkta 40-60 dakika inkübe edin ve ara sıra 4 ° C’de kısa süreler boyunca çalkalayın. Hücreleri 2x yıkamak için 1 mL 1x Geçirgenleştirme / Yıkama solüsyonu ekleyin, hücreleri 4 ° C’de 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyin; Ardından, süpernatanı atın. Hücreleri bir akış sitometresinde inceleyin ve yazılımı kullanarak verileri analiz edin (Şekil 3).Akış sitometresini açın ve kendi kendine başlayan temizleme ve kalibrasyon işlemini açın. Bu deneyde kullanılan lazer kanalını seçin ve boş bir tüp, tek lekeli tüpler ve numune tüpleri ayarlayın. Boş tüp seçeneğine tıklayın ve makinede test edin; Voltajı, hücre olayı mümkün olduğunca toplama kutusunun merkezinde olacak şekilde ayarlayın. Tek lekeli tüp hücrelerini toplayın ve floresan antikorun doğru şekilde eklendiğini doğrulamak için ilgili kanalların spektral tespitini gerçekleştirin. Karışımı kaldır düğmesine tıklayın ve makinenin spektral telafisini otomatik olarak ayarlamasına izin verin. Diğer akış sitometrisi cihazlarında, floresan telafisini normal şekilde ayarlayın. Her örnek tüp hücresini toplayın, veri formatını FCS dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın. İlgili akış sitometrisi veri analizi yazılımında analiz edin ve çizin.Ana hücre popülasyonunu daire içine alın ve FSC-H ve FSC-A’nın çapraz daire kapılarından olası hücre adezyonlarını ortadan kaldırın. Canlı hücreleri FVS negatif daire alanına göre daire içine alın; daha sonra, CD4 + hücre popülasyonunu daire içine alın. Yatay ekseni IL-17 A ve dikey ekseni RORγT olarak çapraz geçit oluşturun; Q2 alanındaki çift pozitif seçilim Th17 hücre popülasyonudur. 6. Farklı ortamlar tarafından indüklenen IL-17A sekresyonunun tespiti için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) Bölüm 4.5’te toplanan donmuş hücre süpernatantlarını çözün. 100 μL seyreltilmiş standart, boş ve numune ekleyin. Plakayı örtmek için kapatıcıyı kullanın ve 37 °C’de 90 dakika inkübe edin.NOT: Solüsyonları mikro ELISA plakasının dibine iç duvara dokunmadan veya herhangi bir köpürmeye neden olmadan iyice ekleyin. Sıvıyı her bir kuyucuktan boşaltın ve hemen 100 μL Biyotinillenmiş Tespit Antikoru çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı kaplamak için yeni bir sızdırmazlık maddesi kullanın ve 37 °C’de 1 saat inkübe edin. Çözeltiyi boşaltın ve her oyuğa 350 μL yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika sonra, çözeltiyi her bir oyuktan aspire edin veya boşaltın ve temiz emici kağıda vurarak kurulayın. Bu yıkama adımını 3 kez tekrarlayın. Her kuyucuğa 100 μL yaban turpu peroksidaz Konjugat çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı kaplamak için yeni bir sızdırmazlık maddesi kullanın ve 37 °C’de 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi her bir oyuktan boşaltın ve yıkama işlemini adım 6.4’te açıklandığı gibi 5 kez tekrarlayın. Her bir oyuka 90 μL Substrat Reaktifi ekleyin ve plakayı ışıktan koruyarak yeni bir sızdırmazlık maddesi ile 37 °C’de yaklaşık 15 dakika inkübe edin.NOT: Reaksiyon süresi, gerçek renk değişimine göre değiştirilebilir ancak 30 dakikayı geçmemelidir. OD ölçümünden önce mikroplaka okuyucunun ~ 15 dakika ısınmasına izin verin. Substrat çözeltisi ile aynı sırayla 50 μL / kuyu Durdurma Çözeltisi ekleyin. 450 nm’ye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu ile her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu (OD değeri) bir kerede belirleyin. Standart numuneler için OD değerlerini elde edin ve numunelerin kuyucuklarını çoğaltın ve düzeltilmiş değerleri elde etmek için boş kuyuların OD değerlerini çıkarın. Ardından, apsis olarak konsantrasyon ve ordinat olarak OD değeri ile doğrusal montaj gerçekleştirin. Takılan denkleme dayanarak, numune kuyucukları için IL-17A konsantrasyon değerlerini hesaplayın.NOT: 4 günlük farklılaşmadan sonra, her grubun süpernatantındaki IL-17A içeriği Şekil 4’te gösterilmiştir. Montaj yöntemi, Orgin21 yazılımına atıfta bulunabilir. Bu deneyden elde edilen standart eğrininR2 değeri 0.9946’dır. 7. Kantitatif PCR (qPCR) yoluyla imza gen ekspresyon testleri ile T hücresi farklılaşması NOT: Boyaların ve fiksasyon/yırtılma etkilerine bağlı akış sitometrisi instabilitesi olasılığını dışlamak için, patojenik Th17’nin transkripsiyonel düzeyde farklılaşma etkisini aydınlatmak için qPCR ile karakteristik genlerin ekspresyonunu tespit ettik. T hücre kültürünün sonundaki hücre sayısını ölçün. Hücreleri 1.5 mL’lik santrifüj tüplerinde toplayın ve 400 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Tüm süpernatantları dikkatlice atın. RNA ekstraksiyonuNOT: Ekstraksiyon işlemi, RNA enzim kontaminasyonunu önlemek için çeker ocakta veya ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirilmelidir.Numune tüpüne (adım 7.1) 500 μL Lizis Tamponu (örn. 1-2 × 106 hücreye) ekleyin, hemen çalkalayın ve hücre kütlesi kalmayana kadar karıştırın ve 1 dakika bekletin. Karışımı bir toplama tüpüne yerleştirilen adsorpsiyon kolonuna ekleyin, 30 saniye boyunca 13.400 × g’da santrifüjleyin ve süzüntüyü atın. İlk kez kullanmadan önce Yıkama Tamponu şişesine belirtilen miktarda mutlak etanol ekleyin. Adsorpsiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin, 30 saniye boyunca 13.400 × g’da santrifüjleyin ve süzüntüyü atın. Adım 7.2.3’te yıkamayı tekrarlayın. Adsorpsiyon sütunu RA’yı boş toplama tüpüne yerleştirin ve durulama solüsyonunu çıkarmak için 13.400 × g’da 2 dakika santrifüjleyin.NOT: Durulama çözeltisindeki artık etanolün aşağı akış reaksiyonunu engellemesini önlemek için durulama çözeltisi çıkarılmalıdır. Adsorpsiyon kolonunu RA’yı çıkarın ve temiz bir RNaz içermeyen santrifüj tüpüne yerleştirin. Adsorpsiyon membranının ortasına 50 μL RNaz içermeyen H2O ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika bekletin ve 9.600 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. RNA’nın saflığını ve konsantrasyonunu ölçün. Kit üreticisinin talimatlarını izleyerek cDNA’nın ilk zincirini sentezleyin.Genomik DNA’yı çıkarın. Ekstrakte edilen şablon RNA’nın 500 ng’sini RNaz içermeyen bir santrifüj tüpünde alın; bir karışım oluşturmak için RNaz içermeyen ddH2O ve 4x gDNA karışımı ekleyin. Bir pipetle nazikçe karıştırın ve 2 dakika boyunca 42 ° C’lik bir su banyosuna koyun.NOT: Reaksiyon karışımının miktarı ve eklenen miktar RNA konsantrasyonu ile ilgilidir; Talimatlara ayrıntılı olarak bakın. Bu deneyde 20 μL’lik reaksiyon sistemi kullanılmıştır. Önceki adımın reaksiyon tüpüne doğrudan 5x ters transkripsiyon reaksiyon sistemi ekleyin. Önceki adımdan 4 μL ters transkripsiyon reaksiyon sistemi ve 16 μL karışım alın ve bir pipetle hafifçe karıştırın.NOT: Ters transkripsiyon sistemi, doğrudan yapılandırılmış bir ters transkripsiyon sistemi olan gerekli tüm ters transkriptazı içerir. Ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın: 37 °C 15 dakika, 85 °C, 5 sn ve son olarak 4 °C’ye soğutun. Üreticinin talimatlarına göre PCR reaksiyonunu ayarlayın.qPCR tüpüne 10 μL 2x PCR reaksiyon enzimi karışımı, 0.4 μL primer 1, 0.4 μL primer 2, 0.4 μL 50x ROX Referans Boya 1, 2 μL şablon cDNA ve 6.8 μL ddH2Oekleyin 20 μL’lik bir karışım hazırlamak için. Aşağıdaki ayarları kullanarak gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR cihazında PCR gerçekleştirin: aşama 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; aşama 2, önce 95 °C, 10 sn, sonra 60 °C, 30 sn, Tekrar x 40; aşama 3, önce 95 °C, 15 sn, sonraki 60 °C, 60 sn, son olarak 95 °C, 15 sn, Tekrar x 1.NOT: 4 günlük farklılaşmadan sonra, saf CD4 + T hücrelerinde Il17a, Il17f, Rora ve Il23r’nin nispi ekspresyon seviyeleri Şekil 5’te gösterilmiştir.