Ce protocole décrit la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Th17 pathogènes in vitro. Plus précisément, lorsqu’il est combiné à une approche basée sur la cytométrie en flux multiparamétrique, une pureté de 90 % de cellules Th17 pathogènes peut être obtenue à partir de cellules T CD4+ naïves en utilisant cette méthode de différenciation.
In vitro Les techniques de différenciation des lymphocytes T sont essentielles pour l’étude fonctionnelle et mécaniste des lymphocytes T CD4+ . Les cellules Th17 pathogènes ont été associées à un large éventail de maladies ces derniers temps, notamment la sclérose en plaques (SEP), la polyarthrite rhumatoïde, le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la septicémie et d’autres troubles auto-immuns. Cependant, les protocoles de différenciation in vitro actuellement connus ont du mal à atteindre une grande pureté des cellules Th17 pathogènes, avec une efficacité d’induction souvent inférieure à 50%, ce qui est un défi clé dans les expériences in vitro . Dans ce protocole, nous proposons un protocole amélioré de culture et de différenciation in vitro pour les cellules Th17 pathogènes, qui est utilisé pour différencier directement les cellules T CD4+ naïves isolées de la rate de souris en cellules Th17 pathogènes. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur l’isolement des splénocytes, la purification des lymphocytes T CD4+ naïfs et la différenciation des lymphocytes Th17 pathogènes. Grâce à ce protocole, nous pouvons atteindre une pureté de différenciation d’environ 90% pour les cellules Th17 pathogènes, ce qui répond aux besoins fondamentaux de nombreuses expériences cellulaires.
Après avoir quitté le thymus, les lymphocytes T CD4+ naïfs traversent les organes lymphoïdes secondaires. Les cellules présentatrices d’antigènes qui transmettent des antigènes homologues aux lymphocytes T CD4+ naïfs les activent, déclenchant une série de programmes de différenciation qui aboutissent finalement à la production de lignées de cellules T auxiliaires (Th) hautement spécialisées1. La production d’interleukine 17 (IL-17) caractérise les cellules Th17, une sous-populationde cellules Th 2 pro-inflammatoires. Les cellules Th17 jouent un rôle dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes extracellulaires et dans la pathogenèse de nombreuses maladies auto-immunes, telles que l’uvéite auto-immune et la sclérose en plaques. Les signaux des récepteurs et des cytokines des lymphocytes T IL-6 et du facteur de croissance transformant β (TGF-β) induisent la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes Th17 par la phosphorylation du transducteur de signal et activateur de transcription (STAT)33. STAT3 est encore amplifié dans une boucle de rétroaction positive par la signalisation médiée par l’IL-23 et l’IL-21 4,5. La phosphorylation de STAT3 peut induire l’expression des facteurs de transcription RORγt et RORα, qui agissent comme des interrupteurs maîtres régulant le profil cytokinique de l’IL-17A, de l’IL-17F, de l’IL-21 et de l’IL-22 dans les cellules Th176. Cependant, il a été rapporté que les cellules Th17 induites par l’IL-6 et le TGF-β sont insuffisantes pour déclencher des maladies auto-immunes, qui nécessitent une co-stimulation par l’IL-23 ou une co-stimulation distincte de l’IL-6, de l’IL-1β et de l’IL-23 en l’absence de TGF-β 7,8.
Les sous-ensembles Th17 qui ne peuvent pas induire efficacement une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) sont parfois appelés Th17 non pathogènes, tandis que les sous-ensembles Th17 qui peuvent induire l’EAE sont connus sous le nom de Th179 pathogènes. Des études récentes ont montré que, bien que le Th17 pathogène et le Th17 non pathogène co-expriment le facteur de transcription de base RORγt, il existe de grandes différences dans la capacité à produire de l’IL-17A et des propriétés pro-inflammatoires et anti-inflammatoires10. En plus de l’expression élevée de RORγt, CCR6, STAT4 et RUNX4, qui sont des facteurs de transcription caractéristiques communs de Th17, les cellules pathogènes Th17 présentent également des caractéristiques d’expression de signal génique supplémentaires liées à la maladie, telles que TBX21, IFN-γ et CXCR3, qui ont les caractéristiques des sous-ensembles de cellules Th1. Les cellules Th17 pathogènes peuvent sécréter des niveaux élevés de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), d’IFN-γ, de TNF-α et d’autres cytokines11,12. Le phénotype des cellules Th17 non pathogènes est instable, et ce n’est que sous la stimulation de CD3 et de la cytokine IL-2 que certaines de ces cellules peuvent se différencier en cellules Th17 pathogènes. Par conséquent, dans les modèles cliniques courants tels que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le syndrome de détresse respiratoire aiguë, les cellules Th17 pathogènes exercent principalement des effets pathogènes.
Les cellules Th17 pathogènes et non pathogènes peuvent se différencier in vitro sous l’influence de différentes cytokines. Ces dernières années, plusieurs études ont proposé des méthodes pour induire la différenciation des cellules Th17 à l’aide de différents types et concentrations de cytokines. Les cellules Th17 sont stimulées par une combinaison d’IL-6, d’IL-1β et d’IL-23 13,14,15,16. Il a été prouvé que l’IL-6 et le TGF-β, deux cytokines nécessaires à la différenciation des cellules Th17, régulent de manière synergique l’expression des cellules RORγt et Th17 en interagissant avec deux séquences d’ADN non codantes conservées différentes au locus17 du gène Rorc. La phase stable des cellules pathogènes Th17 est principalement maintenue par l’IL-23 18,19. L’IL-23 se lie à son récepteur et active la voie de signalisation JAK-STAT20, provoquant ainsi la phosphorylation de Jak2 et Tyk2 et favorisant la phosphorylation de STAT1, STAT3, STAT4 et STAT5. L’IL-4 et l’IFN-γ sont des régulateurs négatifs de cette voie. Cependant, des études ont montré que l’IL-1β peut réguler positivement la transcription de Rorα et Rorγt par la voie mTOR pour maintenir la stabilité du phénotype21 de la cellule Th17.
En raison de l’hétérogénéité de nombreuses études, nous avons choisi les protocoles d’induction pour les cellules Th17 pathogènes et non pathogènes des dernières recherches comme témoins22. Les résultats indiquent que, en supposant que tout se déroule selon ce protocole, après 5 jours de culture dans les conditions de génération de Th17 pathogène, plus de 90% des cellules survivantes peuvent être des cellules Th17 pathogènes.
Cette procédure a offert un moyen productif d’augmenter le nombre de lymphocytes T CD4+ naïfs spléniques de souris pour la production in vitro de cellules Th17 pathogènes. Bien que nous utilisions plus de cytokines que les autres milieux de culture de cellules Th17 signalés, nous nous engageons à optimiser les conditions de croissance des cellules Th17 pathogènes. Nous envisageons d’optimiser davantage notre protocole de différenciation induite.
Ici, nous avons simplement utilisé la cytométrie en flux et la qPCR pour examiner la production de cytokines caractéristiques. Avec quelques modifications mineures, cette approche peut également être utilisée pour d’autres tests de fonction, tels que la prolifération cellulaire.
Nous avons utilisé un kit d’isolement de lymphocytes produit en Chine pour isoler les lymphocytes de la rate de souris, car il est efficace et permet de gagner du temps. Les solutions de séparation des lymphocytes basées sur d’autres marques peuvent également atteindre l’objectif de séparer les lymphocytes de la rate de souris à travers différentes étapes. Une autre méthode consiste à lyser directement les globules rouges de la suspension de cellules de rate obtenue ; Cependant, nous avons constaté que les globules rouges de la rate ne peuvent souvent pas être lysés en une seule fois.
Certains problèmes peuvent survenir lors de l’exécution de ce protocole. Premièrement, le nombre de lymphocytes T CD4+ naïfs obtenus par tri par billes magnétiques peut être très faible (étape 3 du protocole). Cela pourrait être attribué au fait que le processus d’écrasement des organes est insuffisant. Il est important de s’assurer que l’organe est correctement homogénéisé. L’augmentation de la fréquence des rinçages pendant le processus d’homogénéisation améliorera le taux de récupération. Pour obtenir un plus grand nombre de lymphocytes T CD4+ naïfs spléniques, nous suggérons d’utiliser des souris plus jeunes (âgées de 6 à 10 semaines). Il existe différentes méthodes pour séparer les lymphocytes de la rate, et le rendement peut varier en fonction du liquide de séparation utilisé. Il est recommandé d’utiliser un liquide de séparation universellement certifié et d’essayer d’extraire la couche lymphocytaire autant que possible.
Deuxièmement, la proportion de lymphocytes T CD4+ en cytométrie en flux peut être de <80 % (étape 5 du protocole). L’une des causes possibles de ce problème pourrait être un nombre de splénocytes imprécis, ce qui entraînerait un nombre de cellules supérieur à celui du cocktail d’anticorps supplémentaire et des billes magnétiques. Pour augmenter l’efficacité de la purification des lymphocytes T CD4+ naïfs, la numération cellulaire doit être précise. De plus, 10 % plus de cocktail d’anticorps et de billes magnétiques peuvent être utilisés par rapport à ce que ce protocole recommande. Enfin, la cytométrie en flux peut être effectuée immédiatement après le tri des lymphocytes T CD4+ naïfs.
Troisièmement, il se peut qu’il n’y ait pas beaucoup d’amas de lymphocytes T formés pendant la culture, et que la plupart des cellules soient mortes pendant la différenciation des lymphocytes T (étape 4 du protocole). La raison possible de ce problème pourrait être la détermination inexacte du nombre de cellules T CD4+ naïves avant l’ensemencement, ce qui entraîne une faible densité cellulaire. Il est recommandé d’adopter une méthode de comptage plus précise pour obtenir la densité cellulaire souhaitée d’environ 4 × 105 cellules/mL pour chaque puits dans une plaque de 48 puits. Une autre cause possible pourrait être des problèmes techniques avec l’incubateur de CO2 , tels qu’une température ou une concentration de CO2 incorrecte. Enfin, une force excessive lors du changement de milieu de culture cellulaire pourrait potentiellement provoquer la mort cellulaire.
Quatrièmement, les niveaux d’expression relatifs des gènes de signature des cytokines peuvent être faibles (étape 7 du protocole). Pour garantir l’authenticité de l’ARN extrait, il est recommandé d’utiliser une concentration de détection de nanogouttelettes supérieure à 100 ng/mL. La raison potentielle de la diminution de la concentration peut être la nature malsaine des cellules cultivées, par exemple qu’une grande partie des cellules collectées sont mortes ou en cours de mort. Pour obtenir la véritable concentration d’ARN, il est nécessaire de résoudre la situation qui peut conduire à une mauvaise croissance pendant la culture cellulaire. Une autre raison de cette préoccupation pourrait être le nombre de cellules finales excessivement faible obtenu lors de l’extraction de l’ARN, peut-être en raison d’une perte de cellules par inadvertance lors de l’élimination du surnageant. L’utilisation de techniques d’extraction d’ARN avancées, telles que les kits d’extraction d’ARN en une étape, pourrait s’avérer avantageuse. Le rapport idéal OD260/OD280, tel que mesuré par Nanodrop, doit se situer dans la plage de 1,9 à 2,1. En cas de rapport excessivement faible, la contamination par les protéines devient une possibilité. L’augmentation de la fréquence du lavage des tampons sans RNase peut aider à atténuer ce problème. À l’inverse, un rapport inhabituellement faible implique une dégradation potentielle de l’ARN. Pour contrer ce problème, il est recommandé d’utiliser de l’eau sans RNase et d’utiliser des tubes de 1,5 mL à des fins de décontamination de la RNase.
En conclusion, le protocole actuel décrit l’utilisation d’un nouveau milieu de culture cellulaire pour induire directement les lymphocytes T CD4+ naïfs à se différencier en cellules Th17 pathogènes in vitro. Par rapport à la séparation directe, il ne fait aucun doute que cette méthode est plus directe, peu coûteuse et plus efficace. La configuration du milieu est également très simple, de sorte que les cellules Th17 construites peuvent être utilisées de manière plus intuitive pour les expériences ultérieures, fournissant un très bon modèle cellulaire pour l’étude de nombreuses maladies.
The authors have nothing to disclose.
Les travaux ont été soutenus par le Programme national de R&D clé de la Chine (n° 2022YFC2304604), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81971812), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82272235), la Fondation des sciences de la Commission de la santé de la province du Jiangsu (n° 8272235), la Fondation scientifique de la Commission de la santé de la province du Jiangsu (n°. ZDB2020009), Programme clé de recherche, de développement de la province du Jiangsu (développement social) Projet spécial (n° BE2021734), Programme national clé de R & D du ministère des Sciences et de la Technologie (n° 2020YFC083700), Laboratoire clé de médecine de soins intensifs de la province du Jiangsu (BM2020004), Projet clé de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81930058), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82171717), Fonds de recherche fondamentale des universités centrales (2242022K4007), et le projet général de la Fondation provinciale des sciences naturelles du Jiangsu (BK20211170).
Antibodies | |||
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilution | BD | Cat# 564108; RRID: AB_2738597 | |
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilution | BioLegend | Cat#100509; RRID: AB_312712 | |
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilution | BioLegend | Cat#506903; RRID: AB_ 315463 | |
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilution | BioLegend | Cat#103012; RRID: AB_312963 | |
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilution | Invitrogen | Cat#17-6981-80; RRID: AB_2573253 | |
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilution | Invitrogen | Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purified | biogems | Cat#05112-25 | |
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purified | biogems | Cat#10312-25 | |
Anti-Mouse IFN gamma | biogems | Cat#80822-25 | |
Anti-Mouse IL-4 | biogems | Cat#81112-25 | |
Ethanol | Xilong scientific | Cat#64-17-5 | |
Fetal bovine serum | Gibco | Cat#10437-028 | |
FcR Blocking reagent | Miltenyi Biotec | Cat#130-092-575 | |
GlutaMAX supplement | gibco | Cat#35050079 | |
Mouse rIL-1 beta | Sino Biological | Cat#50101-MNAE | |
Mouse rIL-6 | Sino Biological | Cat#50136-MNAE | |
Mouse rIL-23 | Sino Biological | Cat#CT028-M08H | |
Mouse TGF beta 1 | Sino Biological | Cat#50698-M08H | |
PBS | Procell | Cat#PB180327 | |
Recombinant Murine IL-2 | peprotech | Cat#212-12 | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco | Cat#11875-119 | |
Penicillin-streptomycin solution | Gibco | Cat#15070063 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | Cat#M6250-100ML | |
Critical commercial assays | |||
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution Kit | Tbdscience | Cat#TBD0018SOP | Contains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD) |
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed) | Vazyme | Cat#Q341-02 | https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html. |
Fixation/permeabilization Concentrate | invitrogen | Cat#00-5123-43 | |
Fixation / Permeabilization Diluent | invitrogen | Cat#00-5223-56 | |
Fixable Viability Dye EF506 | invitrogen | Cat#65-0866 | |
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | Cat#R223-01 | https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html. |
Leukocyte Activation Cocktail | BD | Cat#550583 | |
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA Kit | Elabscience® | Cat#E-EL-M0047 | |
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouse | STEMCELL | Cat#19765 | EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C. |
Permeabilization Buffer | invitrogen | Cat#00-8333-56 | |
SPARKeasy Cell RNA Kit | Sparkjade | Cat#AC0205-B | https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85 |
Experimental models: Organisms/strains | |||
Mouse: C57BL/6 | Gempharmatech | Cat#000013 | |
Oligonucleotides | |||
Mouse Il17a TaqMan primers with probe | ribobio | NA | |
Mouse Il17f TaqMan primers with probe | ribobio | NA | |
Mouse Il23r TaqMan primers with probe | ribobio | NA | |
Mouse Rora TaqMan primers with probe | ribobio | NA | |
β-actin TaqMan primers with probe | ribobio | NA | |
Software and algorithms | |||
Cytek Aurora | Cytek | https://spectrum.cytekbio.com/ | |
FlowJo v10.8.1 | Tree Star | https://www.flowjo.com | |
GraphPad prism 9 | GraphPad Software | https://www.graphpad-prism.cn | |
Other | |||
1 mL syringe | Kindly | NA | |
1.5 mL Centrifuge tubes | Eppendorf | Cat#MCT-150-C | |
5 mL Round-bottom tubes | Corning | Cat#352235 | |
15 mL Centrifuge tubes | NEST | Cat#601052 | |
48-Well tissue culture plate (flatten bottom) | Corning | Cat#3548 | |
50 mL Centrifuge tubes | NEST | Cat#602052 | |
70 µm Cell strainer | Biosharp | Cat#BS-70-XBS | |
96-well Unskirted qPCR Plates | VIOX scientific | Cat#V4801-M | |
100 mm Petri dish | Corning | Cat#430167 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
Cell culture CO2 incubator | Thermo Fisher | HEPA Class100 | |
Cytek Aurora | Cytek | NA | |
dissecting scissors | RWD | S12003-09 | |
Hemocytometer | AlphaCell | Cat#J633201 | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | |
Real-time PCR System | Roche | LightCycler96 | |
Surgical tweezers | RWD | F12005-10 | |
Thermal cycler | Bio-Rad | C1000 Touch |