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Immunology and Infection

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

Published: October 25, 2024
doi:
10.3791/66718
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1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine,Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine,Southeast University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in vitro. Konkret kann in Kombination mit einem auf Multiparameter-Durchflusszytometrie basierenden Ansatz mit dieser Differenzierungsmethode eine Reinheit von 90 % pathogener Th17-Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen gewonnen werden.

Abstract

In vitro T-Zell-Differenzierungstechniken sind sowohl für die funktionelle als auch für die mechanistische Untersuchung von CD4+ T-Zellen unerlässlich. Pathogene Th17-Zellen wurden in jüngster Zeit mit einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Multiple Sklerose (MS), rheumatoide Arthritis, akutes Atemnotsyndrom (ARDS), Sepsis und andere Autoimmunerkrankungen. Die derzeit bekannten in vitro Differenzierungsprotokolle haben jedoch Schwierigkeiten, eine hohe Reinheit von pathogenen Th17-Zellen zu erreichen, wobei die Induktionseffizienz oft unter 50% liegt, was eine zentrale Herausforderung in in vitro Experimenten darstellt. In diesem Protokoll schlagen wir ein verbessertes in vitro Kultur- und Differenzierungsprotokoll für pathogene Th17-Zellen vor, das verwendet wird, um naive CD4+ T-Zellen, die aus der Milz der Maus isoliert wurden, direkt in pathogene Th17-Zellen zu differenzieren. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Isolierung von Splenozyten, zur Reinigung naiver CD4+ T-Zellen und zur Differenzierung pathogener Th17-Zellen. Durch dieses Protokoll können wir eine Differenzierungsreinheit von ca. 90% für pathogene Th17-Zellen erreichen, was den Grundbedürfnissen vieler zellulärer Experimente entspricht.

Introduction

Nach dem Verlassen des Thymus passieren naive CD4+ T-Lymphozyten sekundäre lymphatische Organe. Antigen-präsentierende Zellen, die homologe Antigene an naive CD4+ T-Zellen weitergeben, aktivieren diese und starten eine Reihe von Differenzierungsprogrammen, die schließlich zur Produktion hochspezialisierter T-Helfer (Th)-Zelllinien führen1. Die Produktion von Interleukin 17 (IL-17) charakterisiert Th17-Zellen, eine Subpopulation von proinflammatorischen Th-Zellen2. Th17-Zellen spielen eine Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen extrazelluläre Krankheitserreger und bei der Pathogenese vieler Autoimmunerkrankungen wie Autoimmun-Uveitis und Multipler Sklerose. Signale von T-Zell-Rezeptoren und Zytokinen IL-6 und transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β) induzieren die Differenzierung von naiven T-Zellen in Th17-Zellen durch die Phosphorylierung des Signaltransducers und des Aktivators der Transkription (STAT)33. STAT3 wird in einer positiven Rückkopplungsschleife durch Signalübertragung, die durch IL-23 und IL-21 vermittelt wird, weiter verstärkt 4,5. Die Phosphorylierung von STAT3 kann die Expression der Transkriptionsfaktoren RORγt und RORα induzieren, die als Hauptschalter das Zytokinprofil von IL-17A, IL-17F, IL-21 und IL-22 in Th17-Zellen regulieren6. Es wurde jedoch berichtet, dass IL-6- und TGF-β-induzierte Th17-Zellen nicht ausreichen, um Autoimmunerkrankungen auszulösen, die eine Kostimulation durch IL-23 oder eine separate Kostimulation von IL-6, IL-1β und IL-23 in Abwesenheit von TGF-βerfordern 7,8.

Th17-Untergruppen, die eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) nicht effektiv induzieren können, werden manchmal als nicht-pathogenes Th17 bezeichnet, während Th17-Untergruppen, die EAE induzieren können, als pathogenes Th179 bezeichnet werden. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass pathogenes Th17 und nicht-pathogenes Th17 zwar den Kerntranskriptionsfaktor RORγt koexprimieren, es jedoch große Unterschiede in der Fähigkeit zur Produktion von IL-17A und proinflammatorischen und entzündungshemmenden Eigenschaften gibt10. Zusätzlich zu der hohen Expression von RORγt, CCR6, STAT4 und RUNX4, die gemeinsame charakteristische Transkriptionsfaktoren von Th17 sind, zeigen pathogene Th17-Zellen auch zusätzliche Gensignalexpressionsmerkmale im Zusammenhang mit der Krankheit, wie z. B. TBX21, IFN-γ und CXCR3, die die Eigenschaften von Th1-Zelluntergruppen aufweisen. Pathogene Th17-Zellen können hohe Mengen an Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α und anderen Zytokinen sezernieren11,12. Der Phänotyp der nicht-pathogenen Th17-Zellen ist instabil, und nur unter der Stimulation durch CD3 und das Zytokin IL-2 können sich einige dieser Zellen zu pathogenen Th17-Zellen differenzieren. In gängigen klinischen Krankheitsmodellen wie rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose und akutem Atemnotsyndrom üben pathogene Th17-Zellen daher primär pathogene Wirkungen aus.

Pathogene und nicht-pathogene Th17-Zellen können sich in vitro unter dem Einfluss verschiedener Zytokine differenzieren. In den letzten Jahren wurden in mehreren Studien Methoden vorgeschlagen, um die Differenzierung von Th17-Zellen unter Verwendung verschiedener Arten und Konzentrationen von Zytokinen zu induzieren. Th17-Zellen werden durch eine Kombination aus IL-6, IL-1β und IL-23 stimuliert 13,14,15,16. Es wurde gezeigt, dass IL-6 und TGF-β, zwei Zytokine, die für die Differenzierung von Th17-Zellen notwendig sind, die Expression von RORγt und Th17-Zelldifferenzierung synergistisch regulieren, indem sie mit zwei verschiedenen konservierten nicht-kodierenden DNA-Sequenzen am Rorc-Genlocus 17 interagieren. Die stabile Phase pathogener Th17-Zellen wird hauptsächlich durch IL-23aufrechterhalten 18,19. IL-23 bindet an seinen Rezeptor und aktiviert den JAK-STAT-Signalweg20, wodurch die Phosphorylierung von Jak2 und Tyk2 bewirkt und die Phosphorylierung von STAT1, STAT3, STAT4 und STAT5 gefördert wird. IL-4 und IFN-γ sind negative Regulatoren dieses Signalwegs. Studien haben jedoch gezeigt, dass IL-1β die Transkription von Rorα und Rorγt über den mTOR-Signalweg positiv regulieren kann, um die Stabilität des Th17-Zellphänotyps21 aufrechtzuerhalten.

Aufgrund der Heterogenität zahlreicher Studien haben wir als Kontrollen die Induktionsprotokolle für pathogene und nicht-pathogene Th17-Zellen aus dem neuesten Stand der Forschung gewählt22. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass, wenn man davon ausgeht, dass alles nach diesem Protokoll durchgeführt wird, nach 5 Tagen Kultur unter der Bedingung der Erzeugung von pathogenem Th17 mehr als 90% der überlebenden Zellen pathogene Th17-Zellen sein können.

Protocol

Das Institutional Review Committee for Animal Studies an der Southeast University genehmigte alle Tierversuche, die in dieser Studie detailliert beschrieben sind und die in Übereinstimmung mit den lokalen und institutionellen Bürostandards durchgeführt wurden. Milzproben wurden von C57BL6/J-Mäusen entnommen. In diese Studie wurden sowohl weibliche als auch männliche Mäuse im Alter zwischen 5 und 8 Wochen eingeschlossen. Das Kulturmedium und der Puffer wurden bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert. Chirurgische Instrumente wurden vor dem Gebrauch autoklaviert. Tragen Sie Latexhandschuhe und -masken, um eine Kontamination von Haut, Augen und Kleidung mit Reagenzien zu vermeiden. Verwenden Sie viel Wasser oder Kochsalzlösung für Haut und Augen. 1. Vorbeschichtung der 24-Well-Gewebekulturplatte mit Anti-CD3 Anti-CD3 auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder RPMI 1640 Medium verdünnen. Füllen Sie eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml Anti-CD3-Lösung (1 μg/ml); Decken Sie dann die Vertiefung mit Parafilm ab. Stellen Sie die Anti-CD3-beschichtete Platte für 16 h in den Kühlschrank (2 °C-8 °C) oder bewahren Sie sie 2-3 h bei 37 °C in einem Zelleninkubator auf. 2. Milzisolierung von Mäusen und Herstellung einer einzelligen Milzsuspension Induzieren Sie eine vollständige Anästhesie in C57BL/6J mit 3% Isofluran und euthanasieren Sie durch Einatmen von 100% Kohlendioxid für 2 min. Weichen Sie die Mäuse unmittelbar nach dem Tod zur Desinfektion in 75%igem Ethanol ein, um eine Kontamination zu vermeiden. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf die saubere Bank, schneiden Sie sie entlang der Mittellinie des Bauches auf und trennen Sie die Bauchstrukturen Schicht für Schicht. Öffnen Sie vorsichtig das Omentum major und den Magen mit einer Pinzette, ziehen Sie die Milz vorsichtig mit dem Magenband heraus und trennen Sie die Milz stumpf vom umgebenden Gewebe und den Bändern, um eine intakte Milz zu erhalten (achten Sie darauf, dass die Milz nicht zerquetscht oder gerissen wird).HINWEIS: Um einen sterilen Zustand aufrechtzuerhalten, wird der folgende Vorgang auf einer sterilen Super-Clean-Bank durchgeführt. Legen Sie einen 70-μm-Zellfilter in eine sterile 100-mm-Kulturschale, geben Sie die Milz in das Zellsieb und zerkleinern Sie sie mit einem Spritzenkolben. Fügen Sie gleichzeitig 5-8 ml Homogenatspülflüssigkeit hinzu, um alle Zellen durch den Filter in die Kulturschale zu drücken.HINWEIS: Die Zusammensetzung des Lymphozytentrennungsflüssigkeits-Kits ist in der Materialtabelle ersichtlich. Das Filtrat wird bei 450 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit dem Probenverdünnungsmittel, das mit dem Lymphozytentrennungskit oder mit PBS oder RPMI 1640 Medium geliefert wurde. Passen Sie die Zellkonzentration der Zellsuspension auf 2 × 108-1 × 109 Zellen/ml an.HINWEIS: In der Regel sind 4-6 ml Probenverdünnungsmittel für eine Milz erforderlich. Nehmen Sie in einem Zentrifugenröhrchen die gleiche Menge Lymphozytentrennungslösung wie die Einzelzellsuspension des Gewebes. Die einzellige Suspension vorsichtig auf die Oberfläche der Lymphozytentrennlösung pipettieren und 30 Minuten lang bei 800 × g, 25 °C zentrifugieren. Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf einen geeigneten Bereich ein (z. B. auf 3 einstellen, wenn die üblichen 1 bis 9 Gänge vorhanden sind).HINWEIS: Die Lymphozytentrennungslösung sollte nicht weniger als 3 ml betragen. Beobachten Sie nach dem Zentrifugieren die vier Schichten im Zentrifugenröhrchen von oben nach unten. Die erste Schicht entspricht dem Probenverdünnungsmittel, gefolgt von der ringförmigen milchig-weißen Lymphozytenschicht. Die dritte Schicht ist die Trennflüssigkeit, die vierte Schicht besteht aus roten Blutkörperchen. Ziehen Sie mit einer Pipette vorsichtig die zweite Schicht der ringförmigen, milchig-weißen Lymphozytenschicht in ein anderes Zentrifugenröhrchen und geben Sie 10 ml Reinigungslösung in das Zentrifugenröhrchen, um die Zellen zu mischen. Bei 250 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Verwenden Sie 10 ml RPMI 1640 Medium, um das Zellpellet für die Zellzählung zu resuspendieren. 3. Aufreinigung naiver CD4+ T-Zellen auf der Grundlage negativer Selektion magnetischer Kügelchen HINWEIS: Unberührte und hochgereinigte naive CD4+ T-Zellen (CD4+CD44lowCD62Lhigh) aus Maus-Splenozyten durch immunomagnetische negative Selektion isolieren. Bereiten Sie die Probe so vor, dass sie 1 × 108 Zellen/ml innerhalb des Volumenbereichs von 0,1 bis 2 ml enthält. Geben Sie 50 μl/ml Rattenserum hinzu und überführen Sie die Probe in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.HINWEIS: Die Zusammensetzung des naiven CD4-T-Zell-Sortierkits ist in der Materialtabelle ersichtlich. Geben Sie 50 μl/ml Isolationscocktail in die Probe, mischen Sie gut und inkubieren Sie sie 7,5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie 50 μl/ml Depletion Cocktail in die Probe, mischen Sie gut und inkubieren Sie 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen auf, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Geben Sie 75 μl/ml der magnetischen Kügelchen in die Probe, mischen Sie sie gut und inkubieren Sie sie 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur.HINWEIS: Die Partikel sollten gleichmäßig verteilt erscheinen; Die Vortexing-Zeit sollte nicht weniger als 30 s betragen. Füllen Sie die Probe mit RPMI 1640 Medium auf ein Endvolumen von 2,5 ml auf. Mischen Sie mehrmals, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Setzen Sie das Röhrchen (ohne Deckel) in den Magneten ein und inkubieren Sie es 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Magneten auf, drehen Sie den Magneten und das Rohr in einer kontinuierlichen Bewegung um und gießen Sie die angereicherte Zellsuspension in ein neues Rohr.HINWEIS: Halten Sie das Rohr und den Magneten 2-3 s lang invertiert, bevor Sie sie aufrecht drehen. Stören Sie keine Tropfen, die an der Mündung der Tube verbleiben können. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse auf naive CD4+ T-Zellen vor und nach der Isolierung (Abbildung 1). Die Zellen werden in ein neues Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 400 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Resuspendieren Sie die Zellen in 200-500 μl RPMI 1640 Medium (ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum). Für jeden 1 ml Zellkultur (z. B. ~106 Zellen/ml) fügen Sie 2 μl Leukozytenaktivierungscocktail hinzu und mischen Sie es. Kultivieren Sie die Zellen in einem CO2-Inkubator bei 37 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit für 4-6 h.HINWEIS: Die Zellen wurden alle 1-2 h einmal vortexiert. Die Zellen bei 400 × g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS. Geben Sie 1 μl Fc-Blocker in die Zellen (z. B. ~106 Zellen/ml). Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL PBS, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 400 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS. Geben Sie einen Antikörper-Cocktail (Fixable Viability Dye, 1:1.000; Anti-CD4, 1:200; Anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) und inkubieren Sie die Zellen für 15-20 min im Dunkeln bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen mit 2 x 1 mL PBS und zentrifugieren Sie sie dann bei 400 × g für 5 min bei 4 °C. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 250 μl fixiertem Puffer resuspendiert und 40-60 Minuten im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.HINWEIS: Der Fix-Puffer wird mit dem Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer geliefert, bei dem es sich um eine 4-fache Stammlösung handelt, die mit Permeabilisierungsverdünnungsmittel verdünnt werden muss. Fügen Sie 1 ml 1x Permeabilisierungspuffer hinzu, um die Zellen 2x zu waschen, indem Sie die Zellen bei 300 × g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Permeabilisierungspuffer und fügen Sie den Zellen den Antikörper (Foxp3 [nukleär], 1:200) hinzu. Nach Fixierung und Membranruptur die Zell-Antikörper-Gemische 40-60 min im Dunkeln inkubieren, gelegentlich für kurze Zeit bei 4 °C schütteln.HINWEIS: Die Permeabilisierungs-/Waschlösung ist eine 10-fache Stammlösung, die vor der Verwendung mit PBS verdünnt werden muss. 4. Induktion pathogener Th17-Zellen in vitro Entfernen Sie steriles PBS vor der Verwendung von den vorbeschichteten 24-Well-Platten. Verwenden Sie für die Kultur Th17-Zellkulturmedium (Tabelle 1) und Kontrastmittel, einschließlich Th0-Zellkulturmedium (Tabelle 1), klassisches nicht-pathogenes Th17-Kulturmedium (Tabelle 1) und klassisches pathogenes Th17-Kulturmedium (Tabelle 1). Resuspendieren Sie die angereicherten naiven CD4 + T-Zellen und dispensieren Sie sie in verschiedene Vertiefungen in derselben 24-Well-Platte (vorbeschichtet mit Anti-CD3), wobei Sie die Konzentration auf 4 × 105 Zellen/ml mit 1 ml Medium in jeder Vertiefung einstellen. 1 μl/ml Anti-CD28-Lösung (Endkonzentration: mit Medium auf 2 μg/ml verdünnt) in jede Vertiefung geben. Kultivieren Sie die Zellen in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C für 5 Tage. Ersetzen Sie das Überstandsmedium der Zellkultur durch Kulturmedium (Th0, nicht-pathogenes Th17, klassisches pathogenes Th17 und objektives Th17), indem Sie vorsichtig pipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, die Hälfte des Mediums, das die Zellen enthält, verwerfen und dann neues Medium hinzufügen, das dem Verwerfungsvolumen am Tag 2 entspricht. Wiederholen Sie dies an Tag 4. Beobachten Sie die Zellen an Tag 5 unter einem optischen Mikroskop (Abbildung 2). Sammeln Sie die Zellüberstände aus jeder Gruppe und konservieren Sie sie bei -80 °C. 5. Durchflusszytometrische Analyse zur pathogenen Th17- und Th0-Zelldifferenzierung Ernten Sie alle Zellen (pro Vertiefung) nach 5 Tagen nach Beginn der Kultur. Führen Sie die Schritte 3.12-3.15 aus. Fügen Sie einen Antikörper-Cocktail (Fixable Viability Dye, 1:1.000; Anti-CD4, 1:200) hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 15-20 min im Dunkeln bei 4 °C. Führen Sie die Schritte 3.17-3.19 aus. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Permeabilisierungspuffer und fügen Sie den Antikörpercocktail hinzu (IL-17A [intrazellulär], 1:200; RORγT [nukleär], 1:200) an die Zellen weiter. Nach Fixierung und Membranruptur die Zell-Antikörper-Gemische 40-60 min im Dunkeln inkubieren, gelegentlich für kurze Zeit bei 4 °C schütteln. Fügen Sie 1 ml 1x Permeabilisierungs-/Waschlösung hinzu, um die Zellen 2x zu waschen, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 × g für 5 min bei 4 °C; Entsorgen Sie dann den Überstand. Untersuchen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer und analysieren Sie die Daten mit der Software (Abbildung 3).Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und aktivieren Sie den selbststartenden Reinigungs- und Kalibrierungsprozess. Wählen Sie den in diesem Experiment verwendeten Laserkanal aus, und richten Sie ein leeres Röhrchen, einfach gefärbte Röhrchen und Probenröhrchen ein. Klicken Sie auf die Option “Leerrohr ” und testen Sie auf der Maschine. Stellen Sie die Spannung so ein, dass sich das Zellenereignis so weit wie möglich in der Mitte der Sammelbox befindet. Sammeln Sie einfach gefärbte Röhrchenzellen und führen Sie eine spektrale Detektion der entsprechenden Kanäle durch, um zu bestätigen, dass der fluoreszierende Antikörper korrekt hinzugefügt wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche “Unmix” und lassen Sie die Maschine die spektrale Kompensation automatisch anpassen. Bei anderen Durchflusszytometrie-Instrumenten stellen Sie die Fluoreszenzkompensation normal ein. Erfassen Sie jede Probenröhrchenzelle, speichern Sie das Datenformat als FCS-Dateien und exportieren Sie es. Analysieren und plotten Sie in der entsprechenden Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie.Umkreisen Sie die Hauptzellpopulation und entfernen Sie mögliche Zelladhäsionen durch die diagonalen Kreisgatter von FSC-H und FSC-A. Lebende Zellen entsprechend der negativen Kreisfläche FVS einkreisen; Kreisen Sie als Nächstes die CD4+-Zellpopulation ein. Konstruktion des Kreuztors mit der horizontalen Achse als IL-17 A und der vertikalen Achse als RORγT; die doppelt positive Selektion im Q2-Bereich ist die Th17-Zellpopulation. 6. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis der durch verschiedene Medien induzierten IL-17A-Sekretion Die in Abschnitt 4.5 gesammelten gefrorenen Zellüberstände auftauen. Geben Sie 100 μl des verdünnten Standards, Blind, und geben Sie die Probe in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Die Platte mit dem Versiegelungsmittel abdecken und 90 min bei 37 °C inkubieren.HINWEIS: Geben Sie die Lösungen auf den Boden der Mikro-ELISA-Platte, ohne die Innenwand zu berühren oder Schaumbildung zu verursachen. Dekantieren Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung und fügen Sie sofort 100 μl biotinylierte Nachweis-Antikörper-Arbeitslösung hinzu. Die Platte mit einem neuen Versiegelungsmittel abdecken und 1 h bei 37 °C inkubieren. Dekantieren Sie die Lösung und geben Sie 350 μl Waschpuffer in jede Vertiefung. Nach 1 Minute die Lösung aus jeder Vertiefung aspirieren oder dekantieren und auf sauberem, saugfähigem Papier trocken tupfen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x. Geben Sie 100 μl der Meerrettichperoxidase-Konjugat-Arbeitslösung in jede Vertiefung. Die Platte mit einem neuen Versiegelungsmittel abdecken und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Dekantieren Sie die Lösung aus jeder Vertiefung und wiederholen Sie den Waschvorgang 5x wie in Schritt 6.4 beschrieben. Geben Sie 90 μl des Substratreagenzes in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte etwa 15 Minuten lang bei 37 °C mit einem neuen Versiegelungsmittel, um die Platte vor Licht zu schützen.HINWEIS: Die Reaktionszeit kann basierend auf der tatsächlichen Farbänderung geändert werden, sollte jedoch 30 Minuten nicht überschreiten. Lassen Sie den Mikroplatten-Reader ~15 Minuten lang aufwärmen, bevor Sie die OD-Messung durchführen. Geben Sie 50 μl/Vertiefung Stopplösung in der gleichen Reihenfolge wie die Substratlösung hinzu. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD-Wert) jeder Vertiefung auf einmal mit einem Mikroplatten-Reader, der auf 450 nm eingestellt ist. Ermitteln Sie die OD-Werte für die Standardproben und replizieren Sie die Wells der Proben, und subtrahieren Sie die OD-Werte der Blind-Wells, um die korrigierten Werte zu erhalten. Führen Sie dann eine lineare Anpassung mit Konzentration als Abszisse und OD-Wert als Ordinate durch. Berechnen Sie auf der Grundlage der angepassten Gleichung die IL-17A-Konzentrationswerte für die Probenvertiefungen.HINWEIS: Nach 4 Tagen der Differenzierung ist der Gehalt an IL-17A im Überstand jeder Gruppe in Abbildung 4 dargestellt. Die Anpassungsmethode kann sich auf die Orgin21-Software beziehen. Die aus diesem Experiment erhaltene Standardkurve hat einenR2-Wert von 0,9946. 7. T-Zell-Differenzierung durch Signaturgenexpressionsassays mittels quantitativer PCR (qPCR) HINWEIS: Um die Möglichkeit einer Instabilität der Durchflusszytometrie aufgrund der Auswirkungen von Farbstoffen und Fixierung/Ruptur auszuschließen, haben wir die Expression charakteristischer Gene mittels qPCR nachgewiesen, um den Differenzierungseffekt von pathogenem Th17 auf transkriptioneller Ebene aufzuklären. Messen Sie die Anzahl der Zellen am Ende der T-Zellkultur. Sammeln Sie die Zellen in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 × g . Entsorgen Sie vorsichtig alle Überstände. RNA-ExtraktionHINWEIS: Der Extraktionsprozess muss in einem Abzug oder einer ultrareinen Bank durchgeführt werden, um eine Kontamination mit RNA-Enzymen zu vermeiden.Geben Sie 500 μl Lysepuffer (z. B. auf 1-2 × 106 Zellen) in das Probenröhrchen (Schritt 7.1), schütteln und mischen Sie sofort, bis keine Zellmasse mehr vorhanden ist, und lassen Sie es 1 Minute stehen. Geben Sie das Gemisch in die Adsorptionssäule, die in ein Sammelröhrchen gegeben wird, zentrifugieren Sie es 30 s lang bei 13.400 × g und verwerfen Sie das Filtrat. Geben Sie die angegebene Menge an absolutem Ethanol in die Waschpufferflasche, bevor Sie sie zum ersten Mal verwenden. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule, zentrifugieren Sie 30 s lang bei 13.400 × g und verwerfen Sie das Filtrat. Wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 7.2.3. Legen Sie die Adsorptionssäule RA in das leere Auffangröhrchen und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 13.400 × g , um die Spüllösung zu entfernen.HINWEIS: Die Spüllösung muss entfernt werden, um zu verhindern, dass das restliche Ethanol in der Spüllösung die nachgeschaltete Reaktion hemmt. Entfernen Sie die Adsorptionssäule RA und legen Sie sie in ein sauberes, RNasefreies Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 50 μL RNase-freies H2O in die Mitte der Adsorptionsmembran, lassen Sie es 1 min bei Raumtemperatur stehen und zentrifugieren Sie es bei 9.600 × g für 1 min. Messen Sie die Reinheit und Konzentration von RNA. Synthetisieren Sie den ersten cDNA-Strang, indem Sie den Anweisungen des Kit-Herstellers folgen.Entfernen Sie genomische DNA. 500 ng der extrahierten Matrizen-RNA werden in ein RNase-freies Zentrifugenröhrchen gegeben; RNase-freies ddH2O und 4x gDNA-Mix zugeben, um eine Mischung zu bilden. Mit einer Pipette vorsichtig pürieren und 2 min in ein 42 °C warmes Wasserbad legen.HINWEIS: Die Menge des Reaktionsgemisches und die zugegebene Menge hängen von der RNA-Konzentration ab. Beachten Sie die Anweisungen im Detail. In diesem Experiment wurde das 20 μL Reaktionssystem verwendet. Fügen Sie ein 5x reverses Transkriptionsreaktionssystem direkt in das Reaktionsröhrchen des vorherigen Schritts ein. 4 μl des reversen Transkriptionsreaktionssystems und 16 μl der Mischung aus dem vorherigen Schritt entnehmen und vorsichtig mit einer Pipette mischen.HINWEIS: Das reverse Transkriptionssystem enthält die gesamte erforderliche reverse Transkriptase, bei der es sich um ein direkt konfiguriertes reverses Transkriptionssystem handelt. Stellen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion ein: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s und schließlich auf 4 °C abkühlen. Richten Sie die PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.Geben Sie 10 μl 2x PCR-Reaktionsenzymgemisch in das qPCR-Röhrchen, 0,4 μl Primer 1, 0,4 μl Primer 2, 0,4 μl 50x ROX Referenzfarbstoff 1, 2 μl Template-cDNA und 6,8 μl ddH2O, um eine 20 μl-Mischung herzustellen. Führen Sie die PCR im quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Gerät mit den folgenden Einstellungen durch: Stufe 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; Stufe 2, zuerst 95 °C, 10 s, dann 60 °C, 30 s, Rep x 40; Stufe 3, erste 95 °C, 15 s, nächste 60 °C, 60 s, schließlich 95 °C, 15 s, Rep x 1.HINWEIS: Nach 4-tägiger Differenzierung sind die relativen Expressionsniveaus von Il17a, Il17f, Rora und Il23r in naiven CD4+ T-Zellen in Abbildung 5 dargestellt.

Representative Results

Unser Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Forschungen über die Differenzierung pathogener Th17-Zellen entwickelt. Der erste Schritt des Experiments besteht darin, die Reinheit von naiven CD4+ T-Zellen, die aus der Milz isoliert wurden, durch magnetische Kügelchensortierung zu detektieren, was die Grundlage für den Erfolg unserer anschließenden pathogenen Th17-Zelldifferenzierung ist. Die Reinheit naiver CD4+ T-Zellen wurde mit Hilfe der Oberflächenmarker CD62L23 und CD4424 nachgewiesen, während FOXP325 als Marker für Treg-Zellen verwendet wurde. Wir fanden heraus, dass der Gehalt an Treg-Zellen nach der Sortierung signifikant reduziert war und die Reinheit naiver CD4+ T-Zellen mindestens 95% erreichen konnte (Abbildung 1). Um die Differenzierung pathogener Th17-Zellen zu vergleichen, wurden naive CD4+ T-Zellen mit Th0-Medium (Tabelle 1) und Th17-Differenzierungsmedium (Tabelle 1) für insgesamt 5 Tage kultiviert. Es zeigte sich, dass T-Zellen sowohl in Th0- als auch in Th17-Medien Clusterwachstum zeigten (Abbildung 2). Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern gegen mehrere Zytokine in differenzierten CD4+ T-Zellen auf Basis der Durchflusszytometrie markiert. Wir untersuchten IL17A26 und RORγT27 als charakteristische Zytokine der Th17-Zelldifferenzierung und fanden heraus, dass 90% der naiven CD4+ T-Zellen unter der Stimulation mit neuem Th17-Zellkulturmedium erfolgreich zu pathogenen Th17-Zellen differenzierten (Abbildung 3). Abbildung 5 zeigt die Signaturgene von Th17-Zellen, die mittels PCR nachgewiesen wurden, was beweist, dass die pathogenen Th17-Zellen, die wir durch Differenzierung erhalten haben, stabil exprimieren. Abbildung 1: Gating-Strategie zur Analyse von Signaturzytokinen in C57BL/6J-Mäusen vor und nach naiver CD4+ T-Zellisolierung. Abkürzungen: FSC-H = forward scatter-peak height; SSC-H = seitliche Streu-Peah-Höhe; FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Repräsentative Bilder von naiven CD4+ T-Zellen der Maus, die 5 Tage lang unter pathogenen Th17- und Th0-Bedingungen kultiviert wurden. (A) Th0-Zellen; (B) pathogene Th17-Zellen. Maßstabsleisten = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analyse nach Differenzierung, die durch Th0-Zellkulturmedium und Th17-Zellkulturmedium induziert wurde. Abkürzungen: FSC-H = forward scatter-peak height; SSC-H = seitliche Streu-Peah-Höhe; FSC-A = Vorwärts-Scatter-Peak-Fläche; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Der Gehalt an IL-17A im Überstand von Th0-Zellkulturmedium und Th17-Zellkulturmedium nach Induktion der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der Expressionsniveaus von Signaturzytokinen in differenzierten CD4+ T-Zellen von C57BL/6J-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Zielpathogenes Th17-Zellkulturmedium Th0-Zellkulturmedium Klassisches nicht-pathogenes Th17-Zellkulturmedium Klassisch pathogenes Th17-Zellkulturmedium. Reagenz Endkonzentration Menge Endkonzentration Menge Endkonzentration Menge Endkonzentration Menge Penicillin-Streptomycin (100x) 1x 500 μL 1x 500 μL 1x 500 μL 1x 500 μL Fötales Rinderserum 10% 5 mL 10% 5 mL 10% 5 mL 10% 5 mL β-Mercaptoethanol 50 μM 50 μL 50 μM 50 μL 50 μM 50 μL 50 μM 50 μL GlutaMAXTM Nahrungsergänzungsmittel (100x) 1x 500 μL 1x 500 μL 1x 500 μL 1x 500 μL Natriumpyruvat-Lösung (100x) 1 mM 500 μL 1 mM 500 μL 1 mM 500 μL 1 mM 500 μL Anti-Maus-IFN-Gamma (1 mg/ml) 5 μg/ml 250 μL 10 μg/ml 500 μL 10 μg/ml 500 μL Anti-Maus IL-4 (2 mg/ml) 5 μg/ml 125 μL 5 μg/ml 250 μL 10 μg/ml 250 μL Maus rIL-1 beta (20 μg) 20 ng/ml NA Maus rIL-6 (20 μg) 20 ng/ml NA 50 ng/ml NA 50 ng/ml NA Maus rIL-23 (50 μg) 50 ng/ml NA 10 ng/ml NA Maus TGF beta (100 μg) 3 ng/ml NA 1 ng/ml NA 1 ng/ml NA Maus IL-2 (5 μg) 20 ng/ml NA RPMI 1640 NA Bis 50 mL NA Bis 50 mL NA Bis 50 mL Gesamt NA 50 mL NA 50 mL NA 50 mL Tabelle 1: Zielpathogene Th17-Zellkultur, Th0-Zellkultur, klassische nicht-pathogene und pathogene Th17-Zellkulturmedien.

Discussion

Dieses Verfahren bot eine produktive Möglichkeit, die Anzahl der Milz-naiven CD4+ T-Zellen von Mäusen für die in vitro Produktion von pathogenen Th17-Zellen zu erhöhen. Obwohl wir mehr Zytokine verwenden als andere berichtete Th17-Zellkulturmedien, sind wir bestrebt, die Wachstumsbedingungen von pathogenen Th17-Zellen zu optimieren. Wir erwägen eine weitere Optimierung unseres induzierten Differenzierungsprotokolls.

Hier haben wir einfach Durchflusszytometrie und qPCR verwendet, um die Produktion von charakteristischen Zytokinen zu untersuchen. Mit ein paar kleinen Modifikationen kann dieser Ansatz auch für andere Funktionstests, wie z.B. die Zellproliferation, verwendet werden.

Wir haben ein in China hergestelltes Lymphozyten-Isolationskit verwendet, um Milz-Lymphozyten von Mäusen zu isolieren, da es effektiv und zeitsparend ist. Auch Lösungen zur Lymphozytentrennung auf Basis anderer Marken können den Zweck der Trennung von Milz-Lymphozyten von Mäusen in verschiedenen Schritten erfüllen. Eine andere Methode besteht darin, die roten Blutkörperchen der erhaltenen Milzzellsuspension direkt zu lysieren; Wir fanden jedoch heraus, dass die roten Blutkörperchen der Milz oft nicht auf einmal lysiert werden können.

Bei der Ausführung dieses Protokolls können einige Probleme auftreten. Erstens kann die Anzahl naiver CD4+ T-Zellen, die durch magnetische Bead-Sortierung gewonnen werden, sehr gering sein (Protokollschritt 3). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass der Prozess des Zerkleinerns von Organen unzureichend ist. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Organ richtig homogenisiert ist. Durch die Erhöhung der Spülhäufigkeit während des Homogenisierungsprozesses wird die Rückgewinnungsrate verbessert. Um eine höhere Anzahl von Milz-naiven CD4+ T-Zellen zu erhalten, empfehlen wir, jüngere Mäuse (6-10 Wochen alt) zu verwenden. Für die Trennung von Milz-Lymphozyten stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, wobei die Ausbeute je nach verwendeter Trennflüssigkeit variieren kann. Es wird empfohlen, eine universell zertifizierte Trennflüssigkeit zu verwenden und zu versuchen, die Lymphozytenschicht so weit wie möglich zu extrahieren.

Zweitens kann der Anteil von CD4+ T-Zellen in der Durchflusszytometrie <80% betragen (Protokollschritt 5). Eine mögliche Ursache für dieses Problem könnte eine ungenaue Splenozytenzahl sein, die zu einer Zellzahl führt, die größer ist als die des zusätzlichen Antikörpercocktails und der magnetischen Kügelchen. Um die Wirksamkeit der naiven CD4+ T-Zellreinigung zu erhöhen, muss die Zellzählung präzise sein. Darüber hinaus können 10 % mehr Antikörper-Cocktails und magnetische Beads verwendet werden, als in diesem Protokoll empfohlen. Schließlich kann die Durchflusszytometrie unmittelbar nach dem Sortieren naiver CD4+ T-Zellen durchgeführt werden.

Drittens kann es sein, dass sich während der Kultur nicht viele T-Zell-Cluster gebildet haben und die meisten Zellen während der Differenzierung von T-Zellen abgestorben sind (Protokollschritt 4). Der mögliche Grund für dieses Problem könnte die ungenaue Bestimmung der Zellzahlen für naive CD4+ T-Zellen vor der Aussaat sein, was zu einer geringen Zelldichte führt. Es wird empfohlen, eine genauere Zählmethode anzuwenden, um die gewünschte Zelldichte von ca. 4 × 105 Zellen/ml für jede Vertiefung in einer 48-Well-Platte zu erreichen. Eine weitere mögliche Ursache können technische Probleme mit dem CO2 -Inkubator sein, wie z. B. falsche Temperatur oder CO2 -Konzentration. Schließlich kann eine übermäßige Krafteinwirkung beim Wechseln des Zellkulturmediums möglicherweise zum Zelltod führen.

Viertens können die relativen Expressionsniveaus der charakteristischen Zytokingene niedrig sein (Protokollschritt 7). Um die Authentizität der extrahierten RNA zu gewährleisten, wird empfohlen, eine Nanotröpfchen-Nachweiskonzentration von mehr als 100 ng/ml zu verwenden. Der mögliche Grund für die Abnahme der Konzentration kann die ungesunde Natur der kultivierten Zellen sein, wie z. B. ein großer Teil der gesammelten Zellen tot oder im Prozess des Todes. Um die wahre RNA-Konzentration zu erhalten, ist es notwendig, die Situation zu lösen, die zu einem schlechten Wachstum während der Zellkultur führen kann. Ein alternativer Grund für diese Besorgnis könnte die zu niedrige endgültige Zellzahl sein, die während der RNA-Extraktion erreicht wurde, möglicherweise aufgrund eines versehentlichen Zellverlusts während der Entsorgung des Überstands. Der Einsatz fortschrittlicher RNA-Extraktionstechniken wie einstufiger RNA-Extraktionskits könnte sich als vorteilhaft erweisen. Das ideale OD260/OD280-Verhältnis, gemessen mit Nanodrop, sollte im Bereich von 1,9 bis 2,1 liegen. Bei einem zu niedrigen Verhältnis kann es zu einer Proteinkontamination kommen. Eine Erhöhung der Häufigkeit des Waschens von RNase-freien Puffern kann dazu beitragen, dieses Problem zu entschärfen. Umgekehrt impliziert ein ungewöhnlich niedriges Verhältnis einen potenziellen RNA-Abbaus. Um diesem Problem entgegenzuwirken, wird empfohlen, RNase-freies Wasser zu verwenden und 1,5-ml-Röhrchen für die RNase-Dekontamination zu verwenden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Protokoll die Verwendung eines neuen Zellkulturmediums beschreibt, um naive CD4+ T-Zellen in vitro direkt zur Differenzierung in pathogene Th17-Zellen zu induzieren. Verglichen mit der direkten Trennung besteht kein Zweifel daran, dass diese Methode direkter, kostengünstiger und effizienter ist. Die Konfiguration des Mediums ist ebenfalls sehr einfach, so dass die konstruierten Th17-Zellen intuitiver für nachfolgende Experimente verwendet werden können, was ein sehr gutes Zellmodell für die Untersuchung vieler Krankheiten darstellt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (Nr. 2022YFC2304604), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 81971812), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 82272235), die Science Foundation der Gesundheitskommission der Provinz Jiangsu (Nr. ZDB2020009), Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Jiangsu (Soziale Entwicklung) Sonderprojekt (Nr. BE2021734), Nationales Schlüssel-Forschungs- und Entwicklungsprogramm des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (Nr. 2020YFC083700), Schlüssellabor für Intensivmedizin der Provinz Jiangsu (BM2020004), Schlüsselprojekt der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (81930058), Nationale Naturwissenschaftsstiftung Chinas (82171717), Mittel für die Grundlagenforschung der Zentraluniversitäten (2242022K4007), und das Jiangsu Provincial Natural Science Foundation General Project (BK20211170).

Materials

Antibodies
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 dilution BD Cat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoclonal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 dilution BioLegend Cat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoclonal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 dilution BioLegend Cat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoclonal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 dilution BioLegend Cat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoclonal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 dilution Invitrogen Cat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoclonal FOXP3 antibody, PE, clone FJK-16s, 1:200 dilution Invitrogen Cat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
Anti-Mouse CD3 SAFIRE purified biogems Cat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE purified biogems Cat#10312-25
Anti-Mouse IFN gamma biogems Cat#80822-25
Anti-Mouse IL-4 biogems Cat#81112-25
Ethanol Xilong scientific Cat#64-17-5
Fetal bovine serum Gibco Cat#10437-028
FcR Blocking reagent Miltenyi Biotec Cat#130-092-575
GlutaMAX supplement gibco Cat#35050079
Mouse rIL-1 beta Sino Biological Cat#50101-MNAE
Mouse rIL-6 Sino Biological Cat#50136-MNAE
Mouse rIL-23 Sino Biological Cat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1 Sino Biological Cat#50698-M08H
PBS Procell Cat#PB180327
Recombinant Murine IL-2 peprotech Cat#212-12
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Cat#11875-119
Penicillin-streptomycin solution Gibco Cat#15070063
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Cat#M6250-100ML
Critical commercial assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution Kit Tbdscience Cat#TBD0018SOP Contains animal spleen tissue lymphocyte separation liquid, tissue sample diluent (cat no. 2010C1119), sample cleaning solution (cat no. 2010X1118), sample washing solution (cat no. TBTDM-W), tissue homogenate flushing liquid (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed) Vazyme Cat#Q341-02 https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixation/permeabilization Concentrate invitrogen Cat#00-5123-43
Fixation / Permeabilization Diluent invitrogen Cat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506 invitrogen Cat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) Vazyme Cat#R223-01 https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activation Cocktail BD Cat#550583
Mouse IL-17A (Interleukin 17A) ELISA Kit Elabscience® Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cells isolation kit, mouse STEMCELL Cat#19765 EasySep kit contains mouse CD4+ T cell isolation cocktail [cat no. 19852C.1], mouse memory T cell depletion cocktail [cat no. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [cat no. 50001], normal rat serum [cat no. 13551]); only store rat serum at -20 °C; other components to be stored at 2-8 °C.
Permeabilization Buffer invitrogen Cat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA Kit Sparkjade Cat#AC0205-B https://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimental models: Organisms/strains
Mouse: C57BL/6 Gempharmatech Cat#000013
Oligonucleotides
Mouse Il17a TaqMan primers with probe ribobio NA
Mouse Il17f TaqMan primers with probe ribobio NA
Mouse Il23r TaqMan primers with probe ribobio NA
Mouse Rora TaqMan primers with probe ribobio NA
β-actin TaqMan primers with probe ribobio NA
Software and algorithms
Cytek Aurora Cytek https://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1 Tree Star https://www.flowjo.com
GraphPad prism 9 GraphPad Software https://www.graphpad-prism.cn
Other
1 mL syringe Kindly NA
1.5 mL Centrifuge tubes Eppendorf Cat#MCT-150-C
5 mL Round-bottom tubes Corning Cat#352235
15 mL Centrifuge tubes NEST Cat#601052
48-Well tissue culture plate (flatten bottom) Corning Cat#3548
50 mL Centrifuge tubes NEST Cat#602052
70 µm Cell strainer Biosharp Cat#BS-70-XBS
96-well Unskirted qPCR Plates VIOX scientific Cat#V4801-M
100 mm Petri dish Corning Cat#430167
Centrifuge Eppendorf 5425R
Cell culture CO2 incubator Thermo Fisher HEPA Class100
Cytek Aurora Cytek NA
dissecting scissors RWD S12003-09
Hemocytometer AlphaCell Cat#J633201
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher ND-2000
Real-time PCR System Roche LightCycler96
Surgical tweezers RWD F12005-10
Thermal cycler Bio-Rad C1000 Touch
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Wang, H., Liu, X., Huang, W., Wu, X., Tang, Y., Zheng, M., Qiu, H., Huang, Y. In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse. J. Vis. Exp. (212), e66718, doi:10.3791/66718 (2024).
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