In vitro differentiatie van naïeve CD4⁺ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

De Institutional Review Committee for Animal Studies aan de Southeast University keurde alle dierstudies goed die in deze studie worden beschreven, die werden uitgevoerd in overeenstemming met zowel lokale als institutionele kantoornormen. Miltmonsters werden genomen van C57BL6/J-muizen. Zowel vrouwelijke als mannelijke muizen, in de leeftijd tussen 5 en 8 weken, werden in deze studie opgenomen. Het kweekmedium en de buffer werden maximaal 1 maand bij 4 °C bewaard. Chirurgische instrumenten werden voor gebruik geautoclaveerd. Draag latex handschoenen en maskers om besmetting van huid, ogen en kleding met reagentia te voorkomen; Gebruik veel water of spoeling met zoutoplossing voor de huid en ogen. 1. De 24-well weefselkweekplaat voorcoaten met anti-CD3 Verdun anti-CD3 tot een eindconcentratie van 1 μg/ml in steriel 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of RPMI 1640-medium. Vul een weefselkweekplaat met 24 putjes met 1 ml anti-CD3-oplossing (1 μg/ml); Bedek vervolgens de put met parafilm. Plaats de anti-CD3 gecoate plaat 16 uur in de koelkast (2 °C-8 °C) of houd deze 2-3 uur op 37 °C in een celincubator. 2. Isolatie van de milt van muizen en bereiding van de eencellige suspensie van de milt Induceer volledige anesthesie in C57BL/6J met 3% isofluraan en euthanaseer door 100% kooldioxide gedurende 2 minuten in te ademen. Week ze onmiddellijk na de dood van de muizen in 75% ethanol voor desinfectie om besmetting te voorkomen. Plaats de muis in rugligging op de schone bank, snijd deze open langs de middellijn van de buik en scheid de buikstructuren laag voor laag. Open het grotere omentum en de maag voorzichtig met een pincet, trek de milt voorzichtig uit met het gastrosplenische ligament en scheid de milt botweg van de omliggende weefsels en ligamenten om een intacte milt te verkrijgen (zorg ervoor dat de milt niet wordt verpletterd of gescheurd).NOTITIE: Om een steriele toestand te behouden, wordt de volgende handeling uitgevoerd in een steriele superschone bank. Plaats een celfilter van 70 μm in een steriel kweekschaaltje van 100 mm, voeg de milt toe aan de celzeef en plet deze met een spuitzuiger. Voeg tegelijkertijd 5-8 ml homogenaat spoelvloeistof toe om alle cellen door het filter in de kweekschaal te duwen.OPMERKING: De samenstelling van de vloeistofkit voor het scheiden van lymfocyten is te zien in de Materiaaltabel. Centrifugeer het filtraat bij 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celpellet met het monsterverdunningsmiddel dat bij de lymfocytscheidingskit is geleverd of met PBS- of RPMI 1640-medium. Stel de celconcentratie van de celsuspensie in op 2 × 108-1 × 109 cellen/ml.OPMERKING: Doorgaans is 4-6 ml monsterverdunningsmiddel nodig voor één milt. Neem in een centrifugebuisje dezelfde hoeveelheid oplossing voor het scheiden van lymfocyten als de eencellige suspensie in het weefsel. Pipetteer de eencellige suspensie voorzichtig op het oppervlak van de lymfocytscheidingsoplossing en centrifugeer bij 800 × g, 25 °C gedurende 30 minuten. Stel de versnelling en vertraging van de centrifuge in op een geschikt bereik (bijv. ingesteld op 3 als er de gebruikelijke versnellingen van 1 tot 9 zijn).OPMERKING: De oplossing voor het scheiden van lymfocyten mag niet minder zijn dan 3 ml. Bekijk na het centrifugeren de vier lagen in de centrifugebuis van boven naar beneden. De eerste laag komt overeen met het verdunningsmiddel van het monster, gevolgd door de ringvormige melkwitte lymfocytenlaag. De derde laag is de scheidingsvloeistof en de vierde laag bestaat uit rode bloedcellen. Gebruik een pipet om de tweede laag ringvormige melkwitte lymfocytenlaag voorzichtig in een andere centrifugebuis te trekken en voeg 10 ml reinigingsoplossing toe aan de centrifugebuis om de cellen te mengen. Centrifugeer bij 250 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Gebruik 10 ml RPMI 1640 medium om de celpellet te resuspenderen voor het tellen van cellen. 3. Zuivering van naïeve CD4+ T-cellen op basis van negatieve selectie van magnetische kralen OPMERKING: Isoleer onaangeroerde en sterk gezuiverde naïeve CD4+ T-cellen (CD4+CD44lowCD62Lhigh) uit muizensplenocyten door immunomagnetische negatieve selectie. Bereid het monster voor om 1 × 108 cellen/ml te hebben binnen het volumebereik van 0,1-2 ml. Voeg 50 μl/ml rattenserum toe en breng het monster over in een buis van 5 ml polystyreen met ronde bodem.OPMERKING: De samenstelling van de naïeve CD4 T-celsorteerset is te zien in de Materiaaltabel. Voeg 50 μL/ml isolatiecocktail toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 7,5 minuut bij kamertemperatuur. Voeg 50 μL/ml Depletion Cocktail toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur. Draai de magnetische kralen om een gelijkmatige verspreiding te garanderen. Voeg 75 μL/ml van de magnetische kralen toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur.OPMERKING: De deeltjes moeten gelijkmatig verspreid lijken; De vortextijd mag niet minder zijn dan 30 s. Vul het monster bij met RPMI 1640 medium tot een eindvolume van 2,5 ml. Meng meerdere keren door zachtjes op en neer te pipetteren. Plaats de tube (zonder deksel) in de magneet en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur. Pak de magneet op, keer de magneet en de buis in één continue beweging om en giet de verrijkte celsuspensie in een nieuwe buis.NOTITIE: Houd de buis en de magneet 2-3 s omgekeerd voordat u ze rechtop zet. Verstoor geen druppels die op de mond van de tube kunnen achterblijven. Bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometer. Voer flowcytometrische analyse uit voor naïeve CD4+ T-cellen voor en na isolatie (Figuur 1). Breng de cellen over in een nieuwe centrifugebuis, centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 200-500 μL RPMI 1640 medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum). Voeg voor elke 1 ml celcultuur (bijv. ~106 cellen/ml) 2 μL leukocytenactiveringscocktail toe en meng deze. Kweek de cellen in een CO2-incubator bij 37 °C en verzadigde vochtigheid gedurende 4-6 uur.OPMERKING: De cellen werden eens in de 1-2 uur gewerveld. Centrifugeer de cellen bij 400 × g, 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatans voorzichtig weg en resuspendeer de cellen in 200 μL PBS. Voeg 1 μL Fc-blokker toe aan de cellen (bijv. ~106 cellen/ml). Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C. Was de cellen eenmaal met 1 ml PBS door te centrifugeren bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 200 μL PBS. Voeg een antilichaamcocktail toe (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) en incubeer de cellen gedurende 15-20 minuten in het donker bij 4 °C. Was de cellen met 2 x 1 ml PBS en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 4 °C bij 400 × g . Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 250 μL vaste buffer en incubeer ze gedurende 40-60 minuten in het donker bij 4 °C.OPMERKING: De fixbuffer wordt geleverd met de Foxp3/transcriptiefactorkleuringsbuffer, een 4x voorraadoplossing die moet worden verdund met permeabilisatieverdunningsmiddel. Voeg 1 ml 1x permeabilisatiebuffer toe om de cellen 2x te wassen door de cellen te centrifugeren bij 300 × g, 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 200 μL permeabilisatiebuffer en voeg het antilichaam (Foxp3 [nucleair], 1:200) toe aan de cellen. Na fixatie en membraanbreuk de cel-antilichaammengsels 40-60 minuten in het donker incuberen, af en toe schudden gedurende korte perioden bij 4 °C.NOTITIE: De Permeabilisatie/Wasoplossing is een 10x bouillonoplossing die voor gebruik met PBS moet worden verdund. 4. Inductie van pathogene Th17-cellen in vitro Verwijder voor gebruik steriel PBS van de voorgecoate 24-wells platen. Gebruik Th17-celkweekmedium (tabel 1) en contrastmiddel voor cultuur, inclusief Th0-celkweekmedium (tabel 1), klassiek niet-pathogeen Th17-kweekmedium (tabel 1) en klassiek pathogeen Th17-kweekmedium (tabel 1). Resuspendeer de verrijkte naïeve CD4 + T-cellen en doseer in verschillende putjes in dezelfde plaat met 24 putjes (voorgecoat met anti-CD3), waarbij de concentratie wordt aangepast naar 4 × 105 cellen/ml, met 1 ml medium in elk putje. Voeg 1 μL/ml anti-CD28-oplossing (eindconcentratie: verdund met medium tot 2 μg/ml) toe aan elk putje. Kweek de cellen in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 5 dagen. Vervang het bovendrijvende medium van de celcultuur door een kweekmedium (Th0, niet-pathogene Th17, klassieke pathogene Th17 en objectieve Th17) door zorgvuldig te pipetteren om de cellen gelijkmatig te verdelen, gooi de helft van het medium met de cellen weg en voeg vervolgens een nieuw medium toe dat gelijk is aan het weggooivolume op dag 2. Herhaal op dag 4. Observeer de cellen onder een optische microscoop op dag 5 (Figuur 2). Verzamel de celsupernatanten van elke groep en cryoconserveer ze bij -80 °C. 5. Flowcytometrische analyse voor pathogene Th17- en Th0-celdifferentiatie Oogst alle cellen (per putje) na 5 dagen na het starten van de kweek. Voer de stappen 3.12-3.15 uit. Voeg een antilichaamcocktail toe (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) en incubeer de cellen gedurende 15-20 minuten in het donker bij 4 °C. Voer de stappen 3.17-3.19 uit. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 200 μL permeabilisatiebuffer en voeg de antilichaamcocktail toe (IL-17A [intracellulair], 1:200; RORγT [nucleair], 1:200) naar de cellen. Na fixatie en membraanbreuk de cel-antilichaammengsels 40-60 minuten in het donker incuberen, af en toe schudden gedurende korte perioden bij 4 °C. Voeg 1 ml 1x Permeabilisatie/Wasoplossing toe om de cellen 2x te wassen en centrifugeer de cellen bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C; Gooi vervolgens de supernatant weg. Onderzoek de cellen op een flowcytometer en analyseer de gegevens met behulp van de software (Figuur 3).Schakel de flowcytometer in en schakel het zelfstartende reinigings- en kalibratieproces in. Selecteer het laserkanaal dat in dit experiment wordt gebruikt en stel een lege buis, enkelvoudig gekleurde buizen en monsterbuizen in. Klik op de optie voor een lege buis en test op de machine; Stel de spanning zo in dat de celgebeurtenis zich zoveel mogelijk in het midden van de verzamelbox bevindt. Verzamel enkelvoudig gekleurde buiscellen en voer spectrale detectie uit van de overeenkomstige kanalen om te bevestigen dat het fluorescerende antilichaam correct is toegevoegd. Klik op de unmix-knop en laat de machine automatisch de spectrale compensatie aanpassen. Pas met andere flowcytometrie-instrumenten de fluorescentiecompensatie normaal aan. Verzamel elke cel van de monsterbuis, sla het gegevensformaat op als FCS-bestanden en exporteer. Analyseer en plot in de relevante software voor gegevensanalyse van flowcytometrie.Omcirkel de hoofdcelpopulatie en verwijder mogelijke celverklevingen door de diagonale cirkelpoorten van FSC-H en FSC-A. Omcirkel levende cellen volgens het FVS-negatieve cirkelgebied; omcirkel vervolgens de CD4+-celpopulatie. Construeer de kruispoort met de horizontale as als IL-17 A en de verticale as als RORγT; de dubbele positieve selectie in het Q2-gebied is de Th17-celpopulatie. 6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor detectie van IL-17A-secretie geïnduceerd door verschillende media Ontdooi de in punt 4.5 verzamelde bevroren celsupernatanten. Voeg 100 μL van de verdunde standaard, blanco en monster toe aan de daarvoor bestemde putjes. Gebruik de sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C.NOTITIE: Voeg de oplossingen goed toe aan de bodem van de micro-ELISA-plaat zonder de binnenwand aan te raken of schuimvorming te veroorzaken. Decanteer de vloeistof uit elk putje en voeg onmiddellijk 100 μL Biotinylated Detection Antibody werkoplossing toe. Gebruik een nieuwe sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Decanteer de oplossing en voeg 350 μL wasbuffer toe aan elk putje. Zuig of decanteer na 1 minuut de oplossing uit elk putje en dep het droog tegen schoon absorberend papier. Herhaal deze wasstap 3x. Voeg 100 μL van de mierikswortelperoxidase Geconjugeerde werkoplossing toe aan elk putje. Gebruik een nieuwe sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Decanteer de oplossing uit elk putje en herhaal het wasproces 5x zoals beschreven in stap 6.4. Voeg 90 μl van het substraatreagens toe aan elk putje en incubeer ongeveer 15 minuten bij 37 °C met een nieuwe sealer, die de plaat tegen licht beschermt.NOTITIE: De reactietijd kan worden gewijzigd op basis van de werkelijke kleurverandering, maar mag niet langer zijn dan 30 minuten. Laat de microplaatlezer ~15 minuten opwarmen voordat u de OD-meting uitvoert. Voeg 50 μL/putje Stop Solution toe in dezelfde volgorde als de substraatoplossing. Bepaal de optische dichtheid (OD-waarde) van elk putje in één keer met een microplaatlezer die is ingesteld op 450 nm. Verkrijg de OD-waarden voor de standaardmonsters en dupliceer putjes van de monsters, en trek de OD-waarden van de lege putjes af om de gecorrigeerde waarden te verkrijgen. Voer vervolgens een lineaire fitting uit met concentratie als de abscis en OD-waarde als de ordinaat. Bereken op basis van de aangepaste vergelijking de IL-17A-concentratiewaarden voor de monsterputjes.OPMERKING: Na 4 dagen differentiatie wordt het gehalte aan IL-17A in het supernatans van elke groep weergegeven in figuur 4. De aanpasmethode kan verwijzen naar de Orgin21-software. De standaardcurve die uit dit experiment is verkregen, heeft een R2-waarde van 0,9946. 7. T-celdifferentiatie door middel van signatuur genexpressietesten via kwantitatieve PCR (qPCR) OPMERKING: Om de mogelijkheid van instabiliteit van flowcytometrie als gevolg van de effecten van kleurstoffen en fixatie/ruptuur uit te sluiten, hebben we de expressie van karakteristieke genen gedetecteerd door qPCR om het differentiatie-effect van pathogene Th17 op transcriptioneel niveau op te helderen. Meet het aantal cellen aan het einde van de T-celcultuur. Verzamel de cellen in centrifugebuisjes van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g . Gooi alle supernatanten voorzichtig weg. RNA-extractieOPMERKING: Het extractieproces moet worden uitgevoerd in een zuurkast of een ultraschone bank om besmetting met RNA-enzymen te voorkomen.Voeg 500 μL lysisbuffer (bijv. aan 1-2 × 106 cellen) toe aan het monsterbuisje (stap 7.1), schud en meng onmiddellijk tot er geen celmassa meer is en laat het 1 minuut staan. Voeg het mengsel toe aan de adsorptiekolom die in een opvangbuis is geplaatst, centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s en gooi het filtraat weg. Voeg de aangegeven hoeveelheid absolute ethanol toe aan de wasbufferfles voordat u deze voor de eerste keer gebruikt. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom, centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s en gooi het filtraat weg. Herhaal het wassen in stap 7.2.3. Plaats de adsorptiekolom RA in de lege opvangbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 × g om de spoeloplossing te verwijderen.OPMERKING: De spoeloplossing moet worden verwijderd om te voorkomen dat de resterende ethanol in de spoeloplossing de stroomafwaartse reactie remt. Verwijder de adsorptiekolom RA en plaats deze in een schone RNasevrije centrifugebuis. Voeg 50 μL RNase-vrij H2O toe aan het midden van het adsorptiemembraan, laat het 1 minuut staan bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 9.600 × g . Meet de zuiverheid en concentratie van RNA. Synthetiseer de eerste streng cDNA door de instructies van de fabrikant van de kit te volgen.Genoom-DNA verwijderen. Neem 500 ng van het geëxtraheerde sjabloon-RNA in een RNase-vrije centrifugebuis; voeg RNase-vrije ddH2O en 4x gDNA-mix toe om een mengsel te vormen. Meng voorzichtig met een pipet en plaats in een waterbad van 42 °C gedurende 2 min.OPMERKING: De hoeveelheid van het reactiemengsel en de toegevoegde hoeveelheid zijn gerelateerd aan de RNA-concentratie; Raadpleeg de instructies in detail. In dit experiment werd het reactiesysteem van 20 μL gebruikt. Voeg direct een 5x reverse transcriptie reactiesysteem toe aan de reactiebuis van de vorige stap. Neem 4 μl van het omgekeerde transcriptiereactiesysteem en 16 μl van het mengsel van de vorige stap en meng voorzichtig met een pipet.OPMERKING: Het reverse transcriptiesysteem bevat alle vereiste reverse transcriptase, wat een direct geconfigureerd reverse transcriptiesysteem is. Stel de omgekeerde transcriptiereactie in: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s en koel tenslotte af tot 4 °C. Stel de PCR-reactie in volgens de instructies van de fabrikant.Voeg 10 μL 2x PCR-reactie-enzymmengsel toe aan de qPCR-buis, 0,4 μL primer 1, 0,4 μL primer 2, 0,4 μL 50x ROX Reference Dye 1, 2 μL sjabloon cDNA en 6,8 μL ddH2O om een mengsel van 20 μL te bereiden. Voer PCR uit in het real-time kwantitatieve PCR-instrument voor fluorescentie met behulp van de volgende instellingen: fase 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; fase 2, eerst 95 °C, 10 s, dan 60 °C, 30 s, Rep x 40; fase 3, eerst 95 °C, 15 s, vervolgens 60 °C, 60 s, tenslotte 95 °C, 15 s, Rep x 1.OPMERKING: Na 4 dagen differentiatie worden de relatieve expressieniveaus van Il17a, Il17f, Rara en Il23r in naïeve CD4+ T-cellen weergegeven in figuur 5.