Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4⁺ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

El Comité de Revisión Institucional para Estudios Animales de la Universidad del Sureste aprobó todos los estudios con animales que se detallan en este estudio, los cuales se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares de las oficinas locales e institucionales. Se tomaron muestras de bazo de ratones C57BL6/J. En este estudio se incluyeron ratones hembra y macho, con edades comprendidas entre las 5 y las 8 semanas. El medio de cultivo y el tampón se almacenaron a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave antes de su uso. Use guantes y mascarillas de látex para evitar la contaminación de la piel, los ojos y la ropa con reactivos; Use mucha agua o enjuague salino para la piel y los ojos. 1. Prerrecubrimiento de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con anti-CD3 Diluir el anti-CD3 hasta una concentración final de 1 μg/mL en un medio estéril de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x o RPMI 1640. Llene un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 1 mL de solución anti-CD3 (1 μg/mL); Luego, cubre el pozo con parafilm. Coloque la placa recubierta anti-CD3 en el refrigerador (2 °C-8 °C) durante 16 h o manténgala a 37 °C en una incubadora de celdas durante 2-3 h. 2. Aislamiento del bazo de ratón y preparación de la suspensión unicelular del bazo Inducir la anestesia completa en C57BL/6J con isoflurano al 3% y eutanasiar inhalando dióxido de carbono al 100% durante 2 min. Inmediatamente después de la muerte de los ratones, sumérjalos en etanol al 75% para desinfectarlos y evitar la contaminación. Coloque el ratón en posición supina en el banco limpio, córtelo a lo largo de la línea media del abdomen y separe las estructuras abdominales capa por capa. Abra suavemente el epiplón mayor y el estómago con pinzas, extraiga suavemente el bazo con el ligamento gastrosplénico y separe sin rodeos el bazo de los tejidos y ligamentos circundantes para obtener un bazo intacto (tenga cuidado de evitar que el bazo se aplaste o se rompa).NOTA: Para mantener un estado estéril, se realiza la siguiente operación en un banco súper limpio estéril. Coloque un filtro celular de 70 μm en una placa de cultivo estéril de 100 mm, agregue el bazo al filtro celular y tritúrelo con un émbolo de jeringa. Al mismo tiempo, agregue 5-8 mL de líquido de lavado homogeneizado para empujar todas las células a través del filtro hacia la placa de cultivo.NOTA: La composición del kit de líquido de separación de linfocitos se puede ver en la Tabla de Materiales. Centrifugar el filtrado a 450 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular con el diluyente de muestra suministrado con el kit de separación de linfocitos o con medio PBS o RPMI 1640. Ajuste la concentración celular de la suspensión celular a 2 × 108-1 × 109 células /mL.NOTA: Por lo general, se requieren 4-6 mL de diluyente de muestra para un bazo. En un tubo de centrífuga, tome la misma cantidad de solución de separación de linfocitos que la suspensión unicelular de tejido. Pipetear con cuidado la suspensión unicelular sobre la superficie de la solución de separación de linfocitos y centrifugar a 800 × g, 25 °C durante 30 min. Ajuste la aceleración y desaceleración de la centrífuga a un rango apropiado (por ejemplo, establezca en 3 si hay las marchas habituales de 1 a 9).NOTA: La solución de separación de linfocitos no debe ser inferior a 3 mL. Después de la centrifugación, observe las cuatro capas en el tubo de centrífuga de arriba hacia abajo. La primera capa corresponde al diluyente de la muestra, seguida de la capa anular de linfocitos de color blanco lechoso. La tercera capa es el líquido de separación y la cuarta capa consta de glóbulos rojos. Utilice una pipeta para extraer cuidadosamente la segunda capa de linfocitos anulares de color blanco lechoso en otro tubo de centrífuga y añada 10 ml de solución de limpieza al tubo de centrífuga para mezclar las células. Centrifugar a 250 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Utilice 10 ml de medio RPMI 1640 para resuspender el pellet de celdas para el recuento de células. 3. Purificación de células T CD4+ ingenuas basada en la selección negativa de perlas magnéticas NOTA: Aísle linfocitos T CD4+ vírgenes intactos y altamente purificados (CD4+CD44lowCD62Lhigh) de esplenocitos de ratón mediante selección inmunomagnética negativa. Prepare la muestra para que tenga 1 × 108 células/mL dentro del rango de volumen de 0,1-2 mL. Añadir 50 μL/mL de suero de rata y transferir la muestra a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.NOTA: La composición del kit de clasificación de células T CD4 ingenuas se puede ver en la Tabla de Materiales. Añadir 50 μL/mL de cóctel de aislamiento a la muestra, mezclar bien e incubar durante 7,5 min a temperatura ambiente. Añadir 50 μL/mL de Cóctel de Agotamiento a la muestra, mezclar bien e incubar durante 2,5 min a temperatura ambiente. Agite las perlas magnéticas para garantizar una dispersión uniforme. Añada 75 μL/mL de las perlas magnéticas a la muestra, mezcle bien e incube durante 2,5 min a temperatura ambiente.NOTA: Las partículas deben aparecer dispersas uniformemente; El tiempo de vórtice no debe ser inferior a 30 s. Rellene la muestra con medio RPMI 1640 hasta un volumen final de 2,5 mL. Mezcle varias veces pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Coloque el tubo (sin la tapa) en el imán e incube durante 2,5 minutos a temperatura ambiente. Levantando el imán, invierta el imán y el tubo en un movimiento continuo y vierta la suspensión de celda enriquecida en un tubo nuevo.NOTA: Mantenga el tubo y el imán invertidos durante 2-3 segundos antes de girarlos en posición vertical. No moleste las gotas que puedan quedar en la boca del tubo. Determine el número de células con un hemocitómetro. Realice un análisis de citometría de flujo para células T CD4+ vírgenes antes y después del aislamiento (Figura 1). Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga, centrifugue a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 200-500 μL de medio RPMI 1640 (suplementado con un 10% de suero fetal bovino). Por cada 1 mL de cultivo celular (por ejemplo, ~106 células/mL), agregue 2 μL de cóctel de activación de leucocitos y mezcle. Cultivar las células en una incubadora de CO2 a 37 °C y humedad saturada durante 4-6 h.NOTA: Las células se agitaron en vórtice una vez cada 1-2 h. Centrifugar las células a 400 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS. Agregue 1 μL de bloqueador Fc a las células (por ejemplo, ~106 células/mL). Incubar las células durante 10 min a 4 °C. Lavar las células una vez con 1 mL de PBS centrifugando a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 μL de PBS. Añadir cóctel de anticuerpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) e incubar las células durante 15-20 min en la oscuridad a 4 °C. Lavar las celdas con 2 x 1 mL de PBS y luego centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón fijo e incube durante 40-60 min en la oscuridad a 4 °C.NOTA: El tampón fijo se proporciona con el tampón de tinción Foxp3/factor de transcripción, que es una solución madre 4x que debe diluirse con diluyente de permeabilización. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x para lavar las células 2x centrifugando las células a 300 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de permeabilización y agregue el anticuerpo (Foxp3 [nuclear], 1:200) a las células. Después de la fijación y la ruptura de la membrana, incubar las mezclas de células y anticuerpos en la oscuridad durante 40-60 minutos con agitación ocasional durante períodos cortos a 4 °C.NOTA: La solución de permeabilización/lavado es una solución madre 10x que debe diluirse antes de usarse con PBS. 4. Inducción de células patógenas Th17 in vitro Retire el PBS estéril de las placas de 24 pocillos prerrevestidas antes de usarlo. Utilice el medio de cultivo celular Th17 (Tabla 1) y el medio de contraste para el cultivo, incluido el medio de cultivo celular Th0 (Tabla 1), el medio de cultivo Th17 no patógeno clásico (Tabla 1) y el medio de cultivo Th17 patógeno clásico (Tabla 1). Vuelva a suspender las células T CD4+ naïve enriquecidas y dispense en diferentes pocillos en la misma placa de 24 pocillos (prerrecubierta con anti-CD3), ajustando la concentración a 4 × 105 células/mL, con 1 mL de medio en cada pocillo. Añadir 1 μL/mL de solución anti-CD28 (concentración final: diluida con medio a 2 μg/mL) a cada pocillo. Cultivar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 5 días. Reemplace el medio sobrenadante de cultivo celular con medio de cultivo (Th0, Th17 no patógeno, Th17 patógeno clásico y Th17 objetivo) pipeteando cuidadosamente para distribuir las células de manera uniforme, deseche la mitad del medio que contiene las células y luego agregue un medio nuevo igual al volumen de descarte el día 2. Repita el día 4. Observe las células bajo un microscopio óptico el día 5 (Figura 2). Recoger los sobrenadantes celulares de cada grupo y criopreservarlos a -80 °C. 5. Análisis de citometría de flujo para la diferenciación de células patógenas Th17 y Th0 Coseche todas las células (por pocillo) después de 5 días del inicio del cultivo. Realice los pasos 3.12 a 3.15. Añadir un cóctel de anticuerpos (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) e incubar las células durante 15-20 min en la oscuridad a 4 °C. Realice los pasos 3.17 a 3.19. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de permeabilización y agregue el cóctel de anticuerpos (IL-17A [intracelular], 1:200; RORγT [nuclear], 1:200) a las células. Después de la fijación y la ruptura de la membrana, incubar las mezclas de células y anticuerpos en la oscuridad durante 40-60 minutos con agitación ocasional durante períodos cortos a 4 °C. Añadir 1 mL de solución de permeabilización/lavado 1x para lavar las células 2x, centrifugando las células a 400 × g durante 5 min a 4 °C; Luego, desecha el sobrenadante. Examine las células en un citómetro de flujo y analice los datos utilizando el software (Figura 3).Encienda el citómetro de flujo y active el proceso de limpieza y calibración de inicio automático. Seleccione el canal láser utilizado en este experimento y configure un tubo en blanco, tubos de una sola tinción y tubos de muestra. Haga clic en la opción de tubo en blanco y pruebe en la máquina; Ajuste el voltaje para que el evento de celda esté, en la medida de lo posible, en el centro de la caja de recolección. Recoja células de tubo de un solo tinte y realice la detección espectral de los canales correspondientes para confirmar que el anticuerpo fluorescente se ha añadido correctamente. Haga clic en el botón desmezclar y deje que la máquina ajuste automáticamente la compensación espectral. Con otros instrumentos de citometría de flujo, ajuste la compensación de fluorescencia normalmente. Recoja cada celda de tubo de muestra, guarde el formato de datos como archivos FCS y exporte. Analice y trace en el software de análisis de datos de citometría de flujo correspondiente.Encierre en un círculo la población celular principal y elimine las posibles adherencias celulares a través de las puertas circulares diagonales de FSC-H y FSC-A. Circule las celdas vivas de acuerdo con el área del círculo negativo FVS; a continuación, encierre en un círculo la población de células CD4+. Construya la puerta transversal con el eje horizontal como IL-17 A y el eje vertical como RORγT; la doble selección positiva en el área Q2 es la población de células Th17. 6. Ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para la detección de la secreción de IL-17A inducida por diferentes medios Descongele los sobrenadantes celulares congelados recogidos en la sección 4.5. Agregue 100 μL del patrón diluido, blanco y muestra en los pocillos designados. Utilice el sellador para cubrir la placa e incubar durante 90 min a 37 °C.NOTA: Agregue las soluciones al fondo del pozo de la placa de micro-ELISA sin tocar la pared interior ni causar espuma. Decantar el líquido de cada pocillo y añadir inmediatamente 100 μL de solución de trabajo de anticuerpos de detección biotinilados. Utilice un sellador nuevo para cubrir la placa e incubar durante 1 h a 37 °C. Decantar la solución y añadir 350 μL de tampón de lavado a cada pocillo. Después de 1 minuto, aspire o decante la solución de cada pocillo y séquela con palmaditas contra papel absorbente limpio. Repite este paso de lavado 3 veces. Agregue 100 μL de la solución de trabajo conjugada de peroxidasa de rábano picante a cada pocillo. Utilice un sellador nuevo para cubrir la placa e incube durante 30 minutos a 37 °C. Decantar la solución de cada pocillo y repetir el proceso de lavado 5 veces como se describe en el paso 6.4. Añadir 90 μL del reactivo de sustrato a cada pocillo e incubar durante unos 15 minutos a 37 °C con un nuevo sellador, protegiendo la placa de la luz.NOTA: El tiempo de reacción puede modificarse en función del cambio de color real, pero no debe exceder los 30 minutos. Deje que el lector de microplacas se caliente durante ~ 15 minutos antes de la medición de OD. Agregue 50 μL/pocillo de solución de parada en el mismo orden que la solución de sustrato. Determine la densidad óptica (valor OD) de cada pozo a la vez con un lector de microplacas configurado a 450 nm. Obtenga los valores de DE para las muestras estándar y los pocillos replicados de las muestras, y reste los valores de DE de los pocillos en blanco para obtener los valores corregidos. A continuación, realice un ajuste lineal con la concentración como abscisa y el valor OD como ordenada. Con base en la ecuación ajustada, calcule los valores de concentración de IL-17A para los pocillos de muestra.NOTA: Después de 4 días de diferenciación, el contenido de IL-17A en el sobrenadante de cada grupo se muestra en la Figura 4. El método de ajuste puede referirse al software Orgin21. La curva estándar obtenida de este experimento tiene un valor R2 de 0,9946. 7. Diferenciación de células T mediante ensayos de expresión génica de firma mediante PCR cuantitativa (qPCR) NOTA: Para descartar la posibilidad de inestabilidad de la citometría de flujo debido a los efectos de los colorantes y la fijación/ruptura, detectamos la expresión de genes característicos por qPCR para dilucidar el efecto de diferenciación del Th17 patógeno a nivel transcripcional. Mida el número de células al final del cultivo de células T. Recoja las células en tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 400 × g durante 5 minutos. Deseche con cuidado todos los sobrenadantes. Extracción de ARNNOTA: El proceso de extracción debe llevarse a cabo en una campana extractora o en un banco ultralimpio para evitar la contaminación de la enzima ARN.Añadir 500 μL de tampón de lisis (por ejemplo, a 1-2 × 106 células) al tubo de muestra (paso 7.1), agitar y mezclar inmediatamente hasta que no quede masa celular, y dejar reposar durante 1 min. Añadir la mezcla a la columna de adsorción colocada en un tubo de recogida, centrifugar a 13.400 × g durante 30 s y desechar el filtrado. Agregue la cantidad especificada de etanol absoluto a la botella de tampón de lavado antes de usarla por primera vez. Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción, centrifugar a 13.400 × g durante 30 s y desechar el filtrado. Repita el lavado en el paso 7.2.3. Coloque la columna de adsorción RA en el tubo de recogida vacío y centrifuga a 13.400 × g durante 2 minutos para eliminar la solución de enjuague.NOTA: La solución de enjuague debe retirarse para evitar que el etanol residual en la solución de enjuague inhiba la reacción posterior. Retire la columna de adsorción RA y colóquela en un tubo centrífugo limpio y libre de RNasa. Añadir 50 μL de H2O libre de RNasa en el centro de la membrana de adsorción, dejar reposar durante 1 min a temperatura ambiente y centrifugar a 9.600 × g durante 1 min. Mida la pureza y la concentración de ARN. Sintetice la primera hebra de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante del kit.Eliminar el ADN genómico. Tome 500 ng del ARN molde extraído en un tubo centrífugo libre de ARNasa; agregue ddH2O sin RNasa y una mezcla de ADNg 4x para formar una mezcla. Triturar suavemente con una pipeta y colocar en un baño de agua a 42 °C durante 2 min.NOTA: La cantidad de la mezcla de reacción y la cantidad agregada están relacionadas con la concentración de ARN; Consulte las instrucciones en detalle. En este experimento se utilizó el sistema de reacción de 20 μL. Agregue directamente un sistema de reacción de transcripción inversa 5x en el tubo de reacción del paso anterior. Tome 4 μL del sistema de reacción de transcripción inversa y 16 μL de la mezcla del paso anterior y mezcle suavemente con una pipeta.NOTA: El sistema de transcripción inversa incluye toda la transcriptasa inversa requerida, que es un sistema de transcripción inversa configurado directamente. Ajuste la reacción de transcripción inversa: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s y finalmente enfríe a 4 °C. Configure la reacción de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.Agregue 10 μL de mezcla de enzimas de reacción de PCR 2x en el tubo de qPCR, 0,4 μL de cebador 1, 0,4 μL de cebador 2, 0,4 μL de 50x de ROX Reference Dye 1, 2 μL de ADNc molde y 6,8 μL de ddH2O para preparar una mezcla de 20 μL. Realice la PCR en el instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real utilizando los siguientes ajustes: etapa 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; etapa 2, primero 95 °C, 10 s, luego 60 °C, 30 s, Rep x 40; etapa 3, primero 95 °C, 15 s, siguiente 60 °C, 60 s, finalmente 95 °C, 15 s, Rep x 1.NOTA: Después de 4 días de diferenciación, los niveles de expresión relativa de Il17a, Il17f, Rera e Il23r en células T CD4+ vírgenes se muestran en la Figura 5.