התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4⁺ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

ועדת הביקורת המוסדית למחקרים בבעלי חיים באוניברסיטת דרום-מזרח אישרה את כל המחקרים בבעלי חיים המפורטים במחקר זה, שבוצעו בהתאם לתקנים מקומיים ומוסדיים כאחד. דגימות טחול נלקחו מעכברי C57BL6/J. הן עכברים נקבות והן זכרים, בגילאי 5 עד 8 שבועות, נכללו במחקר זה. מדיום התרבית והחיץ אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. כלי ניתוח היו autoclaved לפני השימוש. ללבוש כפפות לטקס ומסכות כדי למנוע זיהום של העור, העיניים, בגדים עם ריאגנטים; יש להשתמש בהרבה מים או במי מלח לעור ולעיניים. 1. ציפוי מקדים של צלחת תרבית רקמות 24 בארות עם אנטי CD3 לדלל אנטי-CD3 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ”ל במי מלח סטריליים חוצצי פוספט 1x (PBS) או RPMI 1640 בינוני. מלא צלחת תרבית רקמות 24 באר היטב עם 1 מ”ל של פתרון נגד CD3 (1 מיקרוגרם / מ”ל); לאחר מכן, לכסות את הבאר עם parafilm. הניחו את הצלחת המצופה נגד CD3 במקרר (2°C-8°C) למשך 16 שעות או שמרו אותה בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תאים למשך 2-3 שעות. 2. בידוד טחול עכבר והכנת תרחיף טחול חד תאי יש להשרות הרדמה מלאה ב-C57BL/6J עם 3% איזופלורן ולהרדים על ידי שאיפת 100% פחמן דו-חמצני למשך 2 דקות. מיד לאחר מות העכברים, השרו אותם באתנול 75% לחיטוי למניעת זיהום. הניחו את העכבר במצב שכיבה על הספסל הנקי, חתכו אותו לאורך קו האמצע של הבטן והפרידו את מבני הבטן שכבה אחר שכבה. פתח בעדינות את האומנטום והקיבה הגדולים עם פינצטה, משוך בעדינות את הטחול עם הרצועה הגסטרופלנית, והפריד בבוטות את הטחול מהרקמות והרצועות שמסביב כדי לקבל טחול שלם (היזהר כדי למנוע ריסוק טחול או קרע).הערה: כדי לשמור על מצב סטרילי, הפעולה הבאה מתבצעת בספסל סטרילי סופר נקי. מניחים מסנן תאים בגודל 70 מיקרומטר בכלי תרבית סטרילית בקוטר 100 מ”מ, מוסיפים את הטחול למסננת התא ומועכים אותו בעזרת בוכנה מזרק. במקביל, להוסיף 5-8 מ”ל של נוזל שטיפה הומוגני כדי לדחוף את כל התאים דרך המסנן לתוך צלחת התרבית.הערה: ניתן לראות את הרכב ערכת הנוזלים להפרדת לימפוציטים בטבלת החומרים. צנטריפוגה את התסנין ב 450 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא עם מדלל הדגימה שסופק עם ערכת הפרדת הלימפוציטים או עם מדיום PBS או RPMI 1640. התאם את ריכוז התא של תרחיף התא ל 2 × 108-1 × 109 תאים / מ”ל.הערה: בדרך כלל, 4-6 מ”ל של מדלל מדגם נדרש עבור טחול אחד. בצינור צנטריפוגה, קח את אותה כמות של תמיסת הפרדת לימפוציטים כמו תרחיף תא בודד רקמה. בזהירות פיפטה את התרחיף תא יחיד על פני השטח של פתרון הפרדת לימפוציטים צנטריפוגה ב 800 × גרם, 25 ° C במשך 30 דקות. הגדר את התאוצה וההאטה של הצנטריפוגה לטווח מתאים (למשל, הגדר על 3 אם יש את ההילוכים הרגילים 1 עד 9).הערה: פתרון הפרדת הלימפוציטים לא צריך להיות פחות מ 3 מ”ל. לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בארבע השכבות בצינור הצנטריפוגה מלמעלה למטה. השכבה הראשונה מתאימה לדילול המדגם, ואחריו שכבת הלימפוציטים הלבנה החלבית הטבעתית. השכבה השלישית היא נוזל ההפרדה, והשכבה הרביעית מורכבת מתאי דם אדומים. השתמש פיפטה כדי למשוך בזהירות את השכבה השנייה של שכבת לימפוציטים לבנה חלבית טבעתית לתוך צינור צנטריפוגה אחר ולהוסיף 10 מ”ל של תמיסת ניקוי לצינור הצנטריפוגה כדי לערבב את התאים. צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. השתמש 10 מ”ל של RPMI 1640 בינוני כדי להשעות מחדש את גלולת התא לספירת תאים. 3. טיהור תאי CD4+ T נאיביים על בסיס ברירה שלילית של חרוזים מגנטיים הערה: בודד תאי T נאיביים CD4+ מטוהרים מאוד שלא נגעו בהם (CD4+CD44lowCD62Lhigh) מטחול עכבר על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית. הכן את הדגימה כך שיהיו 1 × 108 תאים/מ”ל בטווח הנפח של 0.1-2 מ”ל. הוסף 50 μL / mL של סרום חולדות ולהעביר את הדגימה לצינור פוליסטירן עגול תחתון 5 מ”ל.הערה: ניתן לראות את הרכב ערכת מיון תאי CD4 T התמימה בטבלת החומרים. מוסיפים 50 μL/mL של קוקטייל בידוד לדגימה, מערבבים היטב ודגרים במשך 7.5 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 50 μL/mL של קוקטייל דלדול לדגימה, מערבבים היטב ודגרים במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבלים את החרוזים המגנטיים כדי להבטיח פיזור אחיד. מוסיפים 75 μL/mL של החרוזים המגנטיים לדגימה, מערבבים היטב ודורים במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: החלקיקים צריכים להופיע מפוזרים באופן שווה; זמן מערבולות לא צריך להיות פחות מ 30 שניות. טען את הדגימה עם RPMI 1640 בינוני עד נפח סופי של 2.5 מ”ל. מערבבים מספר פעמים על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. הכניסו את הצינור (ללא המכסה) לתוך המגנט ודגרו במשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. מרימים את המגנט, הופכים את המגנט והצינור בתנועה רציפה אחת ויוצקים את תרחיף התאים המועשר לתוך צינור חדש.הערה: שמור את הצינור והמגנט הפוכים למשך 2-3 שניות לפני שתהפוך אותם לזקופים. אין להפריע לטיפות שעלולות להישאר על פי הצינור. קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר. בצעו אנליזה ציטומטרית של זרימה עבור תאי T נאיביים מסוג CD4+ לפני ואחרי בידוד (איור 1). מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה חדש, צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ומשליכים את הסופרנטנט. להשהות מחדש את התאים ב 200-500 μL של RPMI 1640 בינוני (בתוספת 10% סרום בקר עוברי). עבור כל 1 מ”ל של תרבית תאים (למשל, ~ 106 תאים / מ”ל), להוסיף 2 μL של קוקטייל הפעלת לויקוציטים ולערבב אותו. תרבית את התאים באינקובטור CO2 ב 37 ° C ולחות רוויה במשך 4-6 שעות.הערה: התאים היו מערבלים אחת ל 1-2 שעות. צנטריפוגה את התאים ב 400 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. בזהירות להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 200 μL של PBS. הוסף 1 μL של חוסם Fc לתאים (למשל, ~ 106 תאים/מ”ל). לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 4 ° C. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ”ל של PBS על ידי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של PBS. הוסף קוקטייל נוגדנים (Fixable Viability Dye, 1:1,000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) ודגר על התאים במשך 15-20 דקות בחושך ב 4 ° C. לשטוף את התאים עם 2 x 1 מ”ל של PBS ולאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-250 מיקרוליטר של חיץ קבוע, ודגרו עליהם במשך 40-60 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס.הערה: מאגר התיקון מסופק עם Foxp3/transcription factor staining buffer, שהוא פתרון מלאי 4x שיש לדלל עם מדלל permeabilization. הוסף 1 מ”ל של 1x permeabilization buffer כדי לשטוף את התאים 2x על ידי צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ חדירות, והוסיפו את הנוגדן (Foxp3 [גרעיני], 1:200) לתאים. לאחר קיבוע וקרע הממברנה, לדגור על תערובות נוגדנים התא בחושך במשך 40-60 דקות עם רעד מדי פעם לפרקי זמן קצרים ב 4 ° C.הערה: תמיסת Permeabilization/Wash היא תמיסת מלאי פי 10 שיש לדלל לפני השימוש עם PBS. 4. אינדוקציה של תאי Th17 פתוגניים במבחנה יש להסיר PBS סטרילי מלוחות 24 הקידודים המצופים מראש לפני השימוש. השתמש בתווך תרבית תאים Th17 (טבלה 1) ובמדיום ניגוד לתרבית, כולל מדיום תרבית תאים Th0 (טבלה 1), מדיום תרבית Th17 קלאסי לא פתוגני (טבלה 1) ומדיום תרבית תרבית פתוגנית קלאסית Th17 (טבלה 1). להשהות מחדש את תאי CD4 + T הנאיביים המועשרים ולחלק לבארות שונות באותה צלחת 24 בארות (מצופה מראש עם אנטי CD3), התאמת הריכוז ל 4 × 105 תאים / מ”ל, עם 1 מ”ל של בינוני בכל באר. הוסף 1 μL / מ”ל של תמיסת אנטי CD28 (ריכוז סופי: מדולל עם בינוני עד 2 מיקרוגרם / מ”ל) לכל באר. תרבית את התאים באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 5 ימים. החלף את המדיום העל-טבעי של תרבית התאים בתווך תרבית (Th0, Th17 לא פתוגני, Th17 פתוגני קלאסי ואובייקטיבי Th17) על ידי פיפטציה זהירה כדי לפזר את התאים באופן שווה, להשליך מחצית מהתווך המכיל את התאים, ולאחר מכן להוסיף תווך חדש השווה לנפח ההשלכה ביום השני. חזור על הפעולה ביום הרביעי. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ביום 5 (איור 2). אספו את הסופרנאטנטים של התאים מכל קבוצה ושמרו אותם בהקפאה בטמפרטורה של -80°C. 5. אנליזה ציטומטרית של זרימה להתמיינות תאי Th17 ו-Th0 פתוגניים קצרו את כל התאים (לכל באר) לאחר 5 ימים של תחילת התרבית. בצע את שלבים 3.12-3.15. מוסיפים קוקטייל נוגדנים (Fixable Viability Dye, 1:1,000; anti-CD4, 1:200) ודגרים על התאים למשך 15-20 דקות בחושך ב-4°C. בצע את שלבים 3.17-3.19. להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ permeabilization, ולהוסיף קוקטייל נוגדנים (IL-17A [intracellular], 1:200; RORγT [גרעיני], 1:200) לתאים. לאחר קיבוע וקרע הממברנה, לדגור על תערובות נוגדנים התא בחושך במשך 40-60 דקות עם רעד מדי פעם לפרקי זמן קצרים ב 4 ° C. הוסף 1 מ”ל של 1x Permeabilization/Wash פתרון לשטוף את התאים 2x, צנטריפוגה התאים ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C; לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט. בחנו את התאים בציטומטר זרימה ונתחו את הנתונים באמצעות התוכנה (איור 3).הפעל את ציטומטר הזרימה והפעל את תהליך הניקוי והכיול העצמי. בחר את תעלת הלייזר ששימשה בניסוי זה, והגדר צינור ריק, צינורות מוכתמים בודדים ושפופרות דגימה. לחץ על אפשרות הצינור הריק ובדוק במכונה; כוונן את המתח כך שאירוע התא יהיה, ככל האפשר, במרכז תיבת האיסוף. לאסוף תאי צינור מוכתמים בודדים ולבצע זיהוי ספקטרלי של התעלות המתאימות כדי לאשר כי נוגדן פלואורסצנטי נוסף כראוי. לחץ על לחצן ביטול הערבוב ואפשר למכונה להתאים אוטומטית את הפיצוי הספקטרלי. עם מכשירים ציטומטריית זרימה אחרים, להתאים את פיצוי פלואורסצנטיות בדרך כלל. אסוף כל תא צינור לדוגמה, שמור את תבנית הנתונים כקבצי FCS וייצוא. לנתח ולהתוות בתוכנה הרלוונטית לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה.הקף את אוכלוסיית התאים הראשית והסר הידבקויות תאים אפשריות דרך שערי המעגל האלכסוניים של FSC-H ו- FSC-A. מעגל תאים חיים על פי אזור המעגל השלילי FVS; לאחר מכן, הקף את אוכלוסיית תאי CD4+. בנה את שער הצלב עם הציר האופקי כ- IL-17 A והציר האנכי כ- RORγT; הסלקציה החיובית הכפולה באזור Q2 היא אוכלוסיית תאי Th17. 6. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) לזיהוי הפרשת IL-17A הנגרמת על ידי מדיות שונות הפשירו את הסופרנאטנטים הקפואים של התאים שנאספו בסעיף 4.5. הוסף 100 μL של התקן המדולל, ריק, ודגימה לתוך הבארות המיועדות. השתמשו באטם כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37°C.הערה: הוסיפו היטב את התמיסות לתחתית צלחת micro-ELISA מבלי לגעת בדופן הפנימית או לגרום להקצפה. דקרו את הנוזל מכל באר והוסיפו מיד 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה. השתמשו באטם חדש כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C. דקרו את התמיסה והוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל באר. לאחר דקה, שאפו או רוקנו את התמיסה מכל באר וייבשו אותה בטפיחות קלות כנגד נייר סופג נקי. חזור על שלב זה של השטיפה 3x. הוסף 100 μL של חזרת peroxidase פתרון עבודה מצומד לכל באר. השתמשו באטם חדש כדי לכסות את הצלחת ולדגור במשך 30 דקות ב-37°C. נקו את התמיסה מכל באר, וחזרו על תהליך השטיפה פי 5 כמתואר בשלב 6.4. מוסיפים 90 μL של מגיב המצע לכל באר, ודגרים במשך כ -15 דקות ב 37 ° C עם אוטם חדש, המגן על הצלחת מפני אור.הערה: ניתן לשנות את זמן התגובה בהתבסס על שינוי הצבע בפועל, אך לא יעלה על 30 דקות. תן לקורא microplate להתחמם במשך ~ 15 דקות לפני מדידת OD. הוסף 50 μL / באר של תמיסת עצירה באותו סדר כמו תמיסת המצע. קבע את הצפיפות האופטית (ערך OD) של כל באר בבת אחת באמצעות קורא מיקרו-לוחות המוגדר ל- 450 ננומטר. קבל את ערכי OD עבור הדגימות הסטנדרטיות ושכפל בארות של הדגימות, והחסר את ערכי OD של הבארות הריקות כדי לקבל את הערכים המתוקנים. לאחר מכן, בצע התאמה ליניארית עם ריכוז כערך abscissa וערך OD כאורדינטה. בהתבסס על המשוואה המותאמת, חשב את ערכי הריכוז IL-17A עבור בארות הדגימה.הערה: לאחר 4 ימים של הבחנה, התוכן של IL-17A בסופרנאטנט של כל קבוצה מוצג באיור 4. שיטת ההתאמה יכולה להתייחס לתוכנת Orgin21. לעקומה הסטנדרטית המתקבלת מניסוי זה יש ערך R2 של 0.9946. 7. התמיינות תאי T על ידי בדיקות ביטוי גנים חתימה באמצעות PCR כמותי (qPCR) הערה: כדי לשלול את האפשרות של חוסר יציבות ציטומטריית זרימה עקב השפעות של צבעים וקיבוע/קרע, זיהינו ביטוי של גנים אופייניים על ידי qPCR כדי להבהיר את אפקט ההתמיינות של Th17 פתוגני ברמת השעתוק. מדדו את מספר התאים בסוף תרבית תאי T. לאסוף את התאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ”ל וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות. בזהירות להשליך את כל supernatants. מיצוי RNAהערה: תהליך המיצוי חייב להתבצע במכסה אדים או בספסל נקי במיוחד כדי למנוע זיהום אנזים RNA.הוסף 500 μL של חיץ ליזיס (למשל, ל 1-2 × 106 תאים) לצינור הדגימה (שלב 7.1), מיד לנער ולערבב עד שאין מסת תא, ולתת לו לעמוד במשך 1 דקות. מוסיפים את התערובת לעמוד הספיחה המונח בצינור איסוף, צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 30 שניות, ומשליכים את התסנין. הוסף את הכמות שצוינה של אתנול מוחלט לבקבוק חיץ הכביסה לפני השימוש הראשון בו. מוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד הספיחה, צנטריפוגה ב-13,400 × גרם למשך 30 שניות, ומשליכים את התסנין. חזור על הכביסה בשלב 7.2.3. הניחו את עמוד הספיחה RA לתוך צינור האיסוף הריק והצנטריפוגה במשקל של 13,400 × גרם למשך 2 דקות כדי להסיר את תמיסת השטיפה.הערה: יש להסיר את תמיסת השטיפה כדי למנוע משאריות האתנול בתמיסת השטיפה לעכב את התגובה במורד הזרם. הסר את עמודת הספיחה RA והנח אותה בצינור צנטריפוגה נקי ללא RNase. הוסף 50 μL של H2O ללא RNase למרכז קרום הספיחה, תן לו לעמוד במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה ב 9,600 × גרם למשך דקה אחת. למדוד את הטוהר והריכוז של RNA. סנתז את הגדיל הראשון של cDNA על-ידי ביצוע הוראות יצרן הערכה.הסר DNA גנומי. קח 500 ng של RNA תבנית מופק בצינור צנטריפוגה ללא RNase; הוסף תערובת ddH2O ו- 4x gDNA ללא RNase ליצירת תערובת. יש לערבב בעדינות עם פיפטה, ולהכניס לאמבט מים בטמפרטורה של 42°C למשך 2 דקות.הערה: כמות תערובת התגובה והכמות שנוספה קשורות לריכוז הרנ”א; עיין בהוראות בפירוט. מערכת התגובה של 20 μL שימשה בניסוי זה. הוסף ישירות מערכת תגובת שעתוק לאחור 5x בצינור התגובה של השלב הקודם. קח 4 μL של מערכת תגובת שעתוק לאחור ו 16 μL של התערובת מן השלב הקודם ומערבבים בעדינות עם פיפטה.הערה: מערכת התמלול ההפוך כוללת את כל התמלול ההפוך הנדרש, שהוא מערכת תמלול לאחור המוגדרת ישירות. הגדר את תגובת השעתוק ההפוך: 37 ° C 15 דקות, 85 ° C, 5 שניות, ולבסוף קריר ל 4 ° C. הגדר את תגובת ה-PCR בהתאם להוראות היצרן.הוסף 10 μL של 2x תערובת אנזימי תגובת PCR בצינור qPCR, 0.4 μL של פריימר 1, 0.4 μL של פריימר 2, 0.4 μL של 50x של צבע ייחוס ROX 1, 2 μL של cDNA תבנית ו- 6.8 μL של ddH2O כדי להכין תערובת של 20 μL. בצע PCR במכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת באמצעות ההגדרות הבאות: שלב 1, 95 °C, 30 שניות, Rep x 1; שלב 2, תחילה 95 מעלות צלזיוס, 10 שניות, ואז 60 מעלות צלזיוס, 30 שניות, נציג x 40; שלב 3, הראשון 95 ° C, 15 שניות, הבא 60 ° C, 60 שניות, לבסוף 95 ° C, 15 שניות, נציג x 1.הערה: לאחר 4 ימים של התמיינות, רמות הביטוי היחסיות של Il17a, Il17f, Rora ו- Il23r בתאי T נאיביים CD4+ מוצגות באיור 5.