マウスにおける高反復低レベル爆風曝露のモデリング

すべての手続きは、退役軍人省ピュージェットサウンドヘルスケアシステム施設用動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル#1588223に基づいて、および実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所ガイドに従って行われました。 1. アニマルケア 注:LLBの動物モデルは、その入手可能性とサイズに対応するためのショックチューブの容量によってのみ制限されます。本明細書に記載のショックチューブは、マウスで使用するために特別に設計されました。 実験的なニーズに応じて、生後3〜4ヶ月の雄または雌のC57BL / 6Jマウスまたはその他の承認されたマウス系統を使用してください。マウスを特定の病原体のない施設で12時間の暗光サイクルに維持し、食物と水に 自由 にアクセスできます。マウスは通常、ケージに4匹または5匹と一緒に社会的に飼育されています。施設の温度を20〜22°Cに保ちます。 ブラストマウスと偽マウスが入ったケージを近くの待機エリアに持って行きます。ブラストルームとの間で個々のマウスを移すために、別々の空のケージを持参してください。 2. ショックチューブの準備 (安否確認) 特定のシステムに必要な安全性チェックが完了していることを確認します。ガス供給(ヘリウム)とマスター電源がオフになっている/切断されていることを確認してください。 必要に応じて、特定の数の低強度ブラストを行うために膜を準備します(図1.1)。このプロトコルで使用される特定のショックチューブの必要に応じて、メンブレンの寸法をカットします。プラスチック製のラップを1枚5.5インチ x 5.5インチの正方形にカットしてスプールを密封し、加圧します。 標準の8.5 “x 11″コピー用紙(75 g / m2 重量)の1枚を5.5 “x 11″にカットします。出来上がった紙を半分に折り、5.5 “x5.5″の正方形を形成します。 500 Gのマイラーメンブレン(厚さ125 μm)を1枚入手します。注:これらのシートは、標準的な低強度ブラストによって破裂したり、大幅に変形したりすることはなく、1日の処置期間中は再利用できます。 四角いラップと折りたたまれた紙の正方形を取り、平らな面に置きます(図1.2)。折りたたんだ紙をラップの上に置き、2つをできるだけ一致させます(図1.3)。反復的なブラストを迅速化するために、ここですべてのメンブレンスタックを配置します。 ドライバーとスプールの間にマイラーメンブレンを巻き上げて小さなチューブ(人差し指と同じくらいの大きさ)に挿入します。 図1.4、1.5)。それをメカニズムに完全に挿入し、ドライバーセクションをスプールから分離するゴム製シールに対して展開できるように離します。スプールをドライバーに向かって押して、マイラーシートを所定の位置に固定します。これにより、ショックチューブの駆動部分からスプールが外れます。 指をラップの上半分の下に置き、ラップと紙の両方を慎重に手前に転がし、位置がずれないように一緒に丸めるようにします(図1.6)。 スプールとショックチューブの被駆動部分の間にメンブレンスタックを挿入します(図1.7)。 プラスチックシールがスプールに向けられ、用紙がチューブの被駆動部に向くように、メンブレンスタックを広げます(図1.8)。注意: この向きにより、システムを加圧できるように気密シールが作成されます。 スプールアセンブリを閉じます(図1.9、1.10)。必要に応じて、ボルトを手または油圧で締め、ドライバー-スプール-ショックチューブアセンブリを固定して、システムを加圧できるようにします。(安全チェック;図1.10)注:油圧システムの場合、クロージャーアセンブリの目標圧力に達していることを確認して、メンブレンの交換が必要になり、LLB曝露プロセスが遅くなる可能性のある失火を防ぎます。油圧を使用して、500psiでアセンブリを閉じます。 3.動物の調理 温度を37°Cに設定して、麻酔チャンバーの下にある循環水加熱パッドをオンにします(図1.11)。ヒートパッドの上に吸収性医療パッドを置きます。 待合室で、1匹のマウスをホームケージから取り出し、空のトランスファーケージに入れます。ケージに入れられたネズミをブラストルームに持ってきます。 酸素流量を1.0 L / min(lpm)に回し、真空スカベンジシステムをオンにします(図1.12)。 イソフルランを5%にオンにし(急速な意識喪失を誘発するため)、流れをげっ歯類の麻酔室にルーティングします(図1.13)。 マウスをチャンバーに入れて麻酔を誘発します(図1.14)。 マウスが完全に麻酔され、さらに 30 秒間安定した呼吸を示したら、チャンバーに手を伸ばしてマウスを耳にパンチし、残りの研究を通じてマウスを明確に長期的に識別します。この手順を今すぐ行うことは、爆発後の回復時間を妨げないようにするために必要です。その後、角膜の乾燥を防ぐために、滅菌済みの眼科用潤滑剤を両眼に塗布します。 マウスをチャンバーから取り外し、その鼻をノーズコーンに入れます(図1.15)。麻酔の流れ(イソフルランなど)を誘導室からノーズコーンに切り替えます。 実験用テープの小片を使用して、マウスの手足を担架に軽く拘束します(図1.16)。 マウスを拘束した後、各肢にワイヤーツイストタイを付け、しっかりとねじり、マウスを手首と足首の担架に固定します(図1.17)。胸の周りに大きなツイストタイを置き、マウスの呼吸が制限されないように非常に緩く結びます。これは、手足の拘束具が緩んだ場合の二次的な拘束メカニズムとして機能します。 マウスのテールを持ち上げて左足の下に置き、ガーニーをショックチューブに挿入したときにマウスが挟まれないようにします(図1.18)。 4. LLB手続き ショックチューブの動物への露出部分を開き、マウスが迫り来る爆風に面するようにマウスを向けます(図1.19)。 動物暴露セクションの担架を固定/吊り下げます(図1.20)。 動物暴露セクションのドアをしっかりと閉め、麻酔薬の流れチューブがドアに挟まれないようにします(図1.21)。 麻酔を 2.5-3% イソフルラン、セッションの残りの部分で 1 lpm に減らします。 必要に応じてシステムの電源を入れます(図1.22)。 圧縮ヘリウムガスの供給ラインを見つけて接続します(図1.23、1.24)。 ブラストルームを出て、隣接するルームのブラストチューブコントロールコンソールにアクセスし、ブラストルームに人員や動物が残っていないことを確認します。注:聴覚保護は、機関または運用条件によって必要になる場合があります。このような条件には、制御コンソールがショックチューブと同じオープンスペースに配置されているショックチューブの配置が含まれる場合があります。 コンソールから、爆破イベントを記録するための集録ソフトウェアをオンにします( 図1.25の緑色のボックスを参照)。注:これらの手順では、20キロヘルツ(kHz)のサンプリングレートでセンサーデータを収集し、LabViewソフトウェアを使用して処理します。≥10 kHzでセンサー・サンプリングを取込むことで、高品質の時間対圧力曲線を実現することをお勧めします。 安全ロック( 図1.26の緑色の矢印で示されている電源制御キーなど)をすべて解除します。 両方のガスベントを閉じ、スプールを受動的に加圧します(図1.27)。ドライバー側は使用しないでください。メンブレンが、使用するメンブレンシートの数によって決定される目標ピークpsiで自力で破裂するまで充填を続けます。 動物の位置でのピーク圧力、正相の持続時間、およびインパルスを記録します。(図1.28)。塗りつぶしメカニズムをオフにします。 ショックチューブに戻り、ヘリウム供給ラインを切断し、ブラスト制御回路への電源を切ります(図1.29)。 同じ動物でLLB曝露を繰り返し行うには、スプールを開き、スプールメンブレンスタックを取り外してから、別のスプールメンブレンスタックをロールして挿入します(図1.30、1.31、1.32)。メンブレンスタックを平らにし、アセンブリを再度閉じます。注:経験的に定義されたSOFトレーニング中の低レベルの爆風曝露の臨床経験をモデル化するために、マウスを1日あたり5〜6 LLBsに曝露し、毎日の曝露を保守的な~20累積合計psi45に制限します。メカニズムと用量反応の関係を強調する研究では、セッションごとに定義された過圧パラメータで一貫した数のLLB曝露を使用することを選択することもできます。 現在の動物の最終的なLLBの後、麻酔をかけたままショックチューブから取り外します(図1.33)。 麻酔下にある間に動物をほどきます。麻酔ノーズコーンから取り外し、仰向けにして温水パッドに置きます(図1.34)。 動物をウォーターパッドに置いたら、タイマーを開始し、マウスが腹側(つまり、胃)にひっくり返るまでの時間を記録します(図1.35)。この時間を正しい時間として記録します。マウスが回復したら、ホームケージに戻し、必要に応じてモニタリングを続けます。 5. 複数日の手続き SOF近接戦闘訓練中に使用される違反電荷からの日常的なLLB曝露をモデル化するには、マウスに対して週5日(月曜日から金曜日)に毎日繰り返し曝露を行い、3つの標準作業週にわたって合計15日間曝露します。 6. ピークLLB圧力の変更 より強力なメンブレン材料を使用するか、追加のメンブレンを積み重ねるだけで、ピーク圧力を上げます。たとえば、マイラー ロール クリア 0.005 (500 G) メンブレンを使用して ~20 psi のピーク圧力を生成するか (ドライバー メンブレンとスプール メンブレンの両方として使用する場合)、マイラー ロール クリア 0.002 (200 G) メンブレンを使用して ~10 psi のピーク圧力を生成します。 実験のニーズに合わせて、爆風の正の位相、持続時間、およびインパルスのパラメータを調整します。正の位相の持続時間とインパルスを調整するには、圧縮ガス源47、49 を代入するか、可能な限りドライバーの長さを変更することにより、目標条件を経験的に決定する。上記のプロトコルは、ヘリウムを使用して、理想的なフリードランダー曲線に似た鋭いピーク圧力と波形を作成します。 7. ティッシュコレクション 注:組織採取の方法は、実験のニーズに応じて調整することができます。 210 mg / kgのペントバルビタールによる腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。 マウスをバーまたは既製のメッシュを備えたマウスまたはラットケージに入れます。ケージに入れられたマウスをドラフトに入れます。 マウスが反応しなくなったら、ケージ上部のバーにマウスを仰向けに置き、バーの1つの周りで口を閉じて、灌流中にマウスが所定の位置に留まるようにします。 胃の皮膚をつかんで上に引っ張り、臓器を切らないように注意しながら、大きなハサミで腹腔内に穴を開けます。リブの基部に沿ってさらに切り込み続けて、リブケージのより自由な関節を可能にします。 止血器を使用して、マウスに横から近づき、胸郭の真上で組織をつかみ、止血器を後ろに転がして、胸郭の基部が簡単にアクセスできる位置に角度をつけます。一対の鉗子または同様のツールを使用して、止血剤を所定の位置に保持します。 小さな手術用ハサミを使用して、横隔膜を慎重に切断し、心臓にアクセスできるようにします。一対の鉗子を使用して、底が胸郭の開いた基部から直接出るように心臓をゆっくりと傾けます。灌流中も心臓が鼓動し続けるように、素早く作業します。 採血する場合は、一対の鉗子で心臓を保持し、先端に0.5インチ25Gの針が付いた3mLの注射器を使用して右心室を慎重に突き刺します。心室の底から挿入し、心室の反対側を突き刺さないように注意しながら、縦方向に入れます。0.5〜1.0 mLの血液が採取されるか流れが止まるまでシリンジをそっと引っ張ってから、シリンジを取り外します。. 外科用ハサミを使用して、右心房の小さな切開部を切開し、血液と灌流液を排出します。一対の鉗子で心臓を保持し、25Gの蝶針を左下から挿入して左心室に慎重に挿入します。保持clで蝶針を所定の位置に保持しますamp または手で。 動物を灌流します。50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシリンジをバタフライニードルに接続し、約10 mL /分の速度で灌流します。.適切な灌流の兆候として肝臓のブランチングを探します。シリンジが空になったら、バタフライニードルから外します。 顕微鏡検査用の組織を調製する場合は、空のPBSシリンジを、50 mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)または4%ホルムアルデヒド溶液を含むシリンジと交換します。上記の手順を繰り返して、ホルマリンで灌流します。注:灌流されたマウスは、灌流中にけいれんすることが観察されるべきです。これにより、手順が完了した後に全身の厳しさまたは硬直が生じるはずです。 心臓から蝶の針を取り外し、組織収集のためにケージバーからマウスを取り出します。 必要に応じて、標的臓器を取り外して細分化します。新鮮な固定されていない材料が収集されている場合は、氷上で手順を実行するよう注意してください。 液体窒素に採取した未固定組織を急速凍結し、タンパク質またはRNAターゲットをアッセイするプロトコルで使用するまで-80°Cで保存します。 固定組織の場合は、ホルマリンで満たされたラベル付きの50 mLコニカルチューブ(臓器ごとに1本のチューブ)に移します。.