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Neuroscience

Modellazione dell'esposizione altamente ripetitiva a basse esplosioni nei topi

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66592
, , , , , , ,
1United States Army Special Operations Command, 2CU Anschutz Center for COMBAT Research, Department of Emergency Medicine,University of Colorado School of Medicine, 3University of Washington School of Nursing, 4University of Delaware School of Nursing, 5Veterans Affairs Northwest Mental Illness Research, Education, and Clinical Center (MIRECC),VA Puget Sound Health Care System, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of Washington School of Medicine

Summary

Qui vengono presentati i metodi per produrre esposizioni ripetute a esplosioni a bassa intensità utilizzando i topi.

Abstract

L’esposizione a esplosioni esplosive è un fattore di rischio significativo per il trauma cerebrale tra le persone esposte. Sebbene gli effetti di grandi esplosioni sul cervello siano ben compresi, gli effetti di esplosioni più piccole come quelle che si verificano durante l’addestramento militare sono meno compresi. Questa piccola esposizione alle esplosioni di basso livello varia anche molto a seconda dell’occupazione militare e del ritmo di addestramento, con alcune unità che sperimentano poche esposizioni nel corso di diversi anni, mentre altre ne sperimentano centinaia nel giro di poche settimane. I modelli animali sono uno strumento importante per identificare sia i meccanismi di lesione che i rischi clinici per la salute a lungo termine a seguito di un’esposizione a basse esplosioni. Sono necessari modelli in grado di ricapitolare questa vasta gamma di esposizioni per informare gli esiti delle lesioni acute e croniche attraverso questi profili di rischio disparati.

Sebbene i risultati a seguito di alcune esposizioni a basse esplosioni siano facilmente modellabili per lo studio meccanicistico, le esposizioni croniche che si verificano nel corso di una carriera possono essere meglio modellate dai paradigmi delle lesioni da esplosione con esposizioni ripetute che si verificano frequentemente nell’arco di settimane e mesi. Qui sono mostrati i metodi per modellare l’esposizione altamente ripetitiva a basse esplosioni nei topi. Le procedure si basano su modelli di tubi pneumatici di esposizione all’esplosione in campo aperto, che possono essere scalati per regolare i parametri di sovrapressione e il numero o l’intervallo delle esposizioni. Questi metodi possono quindi essere utilizzati per consentire indagini meccanicistiche o ricapitolare le esposizioni di routine alle esplosioni dei gruppi clinici in studio.

Introduction

L’esposizione a basse esplosioni (LLB) si verifica quando individui o strutture subiscono entità relativamente basse di forza esplosiva, tipicamente derivanti da piccoli incidenti industriali, demolizioni controllate o determinate attività di addestramento militare. Al contrario, l’esposizione ad alte esplosioni (HLB) comporta l’esposizione a entità di forza esplosiva intense e potenzialmente distruttive, comunemente riscontrate in combattimenti militari, attacchi terroristici o esplosioni accidentali su larga scala. La distinzione principale tra LLB e HLB risiede quindi nell’intensità degli eventi esplosivi e, per estensione, nella capacità delle persone esposte di tollerare esposizioni ripetute prima di subire lesioni fisiche o funzionali. A questo proposito, gli effetti dell’esposizione all’HLB tendono ad essere più evidenti degli effetti dell’esposizione all’HLB. Per questo motivo, le persone con un’esposizione significativa a LLB possono essere a maggior rischio di lesioni o deficit a sviluppo lento che non vengono rilevati fino a quando i loro effetti cumulativi non diventano distinguibili.

La ricerca in corso mira a migliorare la nostra comprensione di come le proprietà dell’esposizione alle esplosioni, come l’intensità o la ripetizione, possano causare lesioni, in modo da poter guidare meglio la prevenzione e la gestione medica. Nella medicina militare, la comprensione delle implicazioni cliniche dell’esposizione alle esplosioni è di fondamentale importanza e, di conseguenza, sono necessari modelli animali in grado di informare tali risultati. Sebbene i modelli animali abbiano contribuito a chiarire gli effetti dell’HLB, gli effetti dell’esposizione a LLB rimangono in gran parte poco studiati. Numerosi studi di modellazione esaminano gli effetti delle sovrapressioni di esplosione vicine o superiori a 10 libbre per pollice quadrato (psi) di pressione di picco 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18, ma pochi rapporti si concentrano su livelli di pressione che vanno da 1 a 7 psi 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, 32,33,34,35,36, che sono più comuni negli ambienti di addestramento militare 37,38,39,40 e si avvicinano alla soglia storica di 4 psi per l’esposizione ambientale sicura. Pertanto, una più ampia diffusione dei metodi per lo studio delle pressioni di picco di LLB utilizzate di frequente può aiutare a catalizzare rapide intuizioni cliniche per l’applicazione alla medicina militare e all’ottimizzazione della forza.

Un’associazione significativa tra il rischio professionale di LLB e diverse diagnosi cliniche sta emergendo dalle indagini epidemiologiche di LLBmilitare 41,42,43,44. Questi studi supportano una relazione dose-dipendente scarsamente definita, con esposizioni ripetitive a LLB che dimostrano rischi aumentati41. Ciò suggerisce che l’aumento dell’esposizione cumulativa alle esplosioni svolge un ruolo cruciale nel plasmare i risultati clinici in ambito militare.

Precedenti studi di modellizzazione animale di LLB sotto i 10 psi hanno utilizzato principalmente esplosivi o sistemi di tubi d’urto per studiare gli effetti dell’esposizione. Sebbene questi modelli esaminino tipicamente gli effetti di una o tre esposizioni, hanno comunque contribuito a una crescente comprensione delle conseguenze meccanicistiche 19,20,30,31, neuropatologiche 29,31,33 e comportamentali 19,20,23,25,32,34 , associati a esposizioni a esplosioni a bassa intensità tipiche dell’ambiente di addestramento militare.

Gli studi che esaminano i singoli LLB generati da esplosivi in campo aperto hanno riportato prove di sottili patologie cerebrali e cambiamenti comportamentali frequentemente associati allo stress post-traumatico. Woods e colleghinon sono stati in grado di rilevare lesioni cerebrali microscopiche a 2,5-5,5 psi, ma hanno rilevato cambiamenti quantitativi nei glicosfingolipidi del tessuto cerebrale mediante spettrometria di massa. Utilizzando le stesse pressioni di picco e il disegno sperimentale, Rubovitch e colleghihanno osservato cambiamenti comportamentali a seguito di esplosioni che si sono verificate con una simile mancanza di patologia cerebrale quando misurate al microscopio ottico. Tuttavia, in successive indagini patologiche, è stato identificato un danno ultrastrutturale inequivocabile alla mielina cerebrale, ai mitocondri, ai neuroni e alla neurovascolarizzazione mediante microscopia elettronica 29,30,31,32,33 in topi esposti a 6,7 psi LLB. È interessante notare che diversi studi LLB che utilizzano esplosivi in campo aperto con pressioni di ~10 psi e inferiori riportano circa il 3-8% di mortalità dopo una singola esposizione25,36.

Risultati simili sono stati precedentemente notati da diversi studi che utilizzano shocktube da laboratorio. Negli studi che hanno esaminato singoli LLB prodotti da shocktubes, sono state trovate prove di lesioni neuroscheletriche e cambiamenti nei modelli di attivazione neuronale sviluppati dopo l’esposizione a un singolo blast da 1,7 psi22. A 4 psi, è stato riportato che la disfunzione del corpo calloso accompagna i deficit neurocomportamentali nei ratti esposti a LLB23. Rispetto alla durata dell’esplosione misurata nell’aria, Chavko e colleghihanno scoperto che la durata della fase positiva della sovrapressione dell’esplosione era significativamente più lunga nel cervello dei ratti esposti a 5,8 psi. Le biofirme di risposte simili alle lesioni possono essere supportate da uno studio sui topi dopo un’esposizione a 7,5 psi in cui Ahmed e colleghi35 riportano cambiamenti rilevabili nei livelli sierici di specifiche proteine infiammatorie, metaboliche, vascolari e neurali fino a un mese dopo l’esposizione. È interessante notare che questo studio ha anche riportato una mortalità del 4,5% a 24 ore dopo l’esposizione.

Negli studi che hanno esaminato tre LLB shocktube in una singola sessione di esposizione di 20 minuti, LLB compresi tra 1,4 e 8,7 psi hanno causato aumenti psi-dipendenti della pressione intracranica (ICP) nei ratti, con cambiamenti osservabili dell’ICP che richiedono più tempo per psi20 inferiori e con conseguenti cambiamenti cognitivi 19,20. Utilizzando suini, lo stesso gruppo ha determinato che tre esposizioni a 4 psi LLB da una varietà di attrezzature militari erano sufficienti per causare neuropatologia istologica quando gli animali sono stati collocati in posizioni di artigliere simulando l’uso umano dell’attrezzatura21.

Questi studi illustrano collettivamente i diversi effetti dell’esposizione a LLB che possono verificarsi in condizioni di esposizione limitata e periodi di recupero. L’esposizione ripetitiva a LLB sembra indurre deficit cognitivi e comportamentali persistenti, sottolineando la necessità di una comprensione sfumata degli effetti cumulativi in modo da poter determinare meglio quando tali effetti possono diventare clinicamente significativi; ciò è particolarmente rilevante per gli allievi militari che sono esposti ad alti livelli di LLB ripetitivo. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari nuovi studi poiché la letteratura attuale non modella adeguatamente le esperienze cliniche di esposizioni di routine all’addestramento militare che superano da una a poche esplosioni nel corso di pochi giorni.

Le Forze per le Operazioni Speciali (SOF) possono sopportare un LLB significativo e altamente ripetitivo durante le esposizioni di routine. Uno studio recente stima che l’esposizione rappresentativa resa anonima in tutte le posizioni in una squadra di sfondamento esplosiva sia di 184 psi di picco cumulativo nel corso di una settimana di formazione42. Ciò si basa, in parte, su una stima prudente di 6 cariche da rottura utilizzate al giorno, con una media di 4 psi di pressione di picco ciascuna, misurata da esplosivi montati sul personale; Non tiene conto delle flashbang e di altri dispositivi45. Un ciclo di allenamento di routine può durare diverse settimane. Per facilitare lo studio delle esperienze cliniche di LLB, come quelle dei membri della formazione SOF, presentiamo un modello di laboratorio di shocktube di esposizione altamente ripetitiva a LLB. Il metodo, basato su sistemi pneumatici a tubo d’urto 46,47,48, consente indagini altamente riproducibili di pressioni di 2 psi e superiori. La procedura non dipende da fattori esterni come le condizioni meteorologiche, non provoca mortalità osservata ed è basata su laboratorio. Di conseguenza, il metodo consente esposizioni LLB ripetitive e quotidiane negli stessi soggetti per studi che durano settimane o mesi, facilitando l’indagine ad alta fedeltà dell’addestramento militare.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo #1588223, approvato dal Veterans Affairs Puget Sound Health Care System Institutional Animal Care Care Committee e in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 1. Cura degli animali NOTA: I modelli animali di LLB sono limitati esclusivamente dalla loro disponibilità e dalla capacità del tubo d’urto di adattarsi alle loro dimensioni. Lo shocktube qui descritto è stato progettato specificamente per l’uso con i topi. Utilizzare topi C57BL/6J maschi o femmine di 3-4 mesi o altri ceppi/linee di topo approvati in base alle esigenze sperimentali. Mantenere i topi su un ciclo buio-luce di 12 ore in strutture specifiche prive di agenti patogeni con accesso ad libitum a cibo e acqua. I topi sono in genere alloggiati socialmente con 4 o 5 in una gabbia. Mantenere le temperature dell’impianto a 20-22 °C. Porta le gabbie contenenti topi esplosivi e finti in un’area di detenzione vicina. Portare gabbie vuote separate per trasferire i singoli topi da e verso la camera di sabbiatura. 2. Preparazione del tubo d’urto (Controllo di sicurezza) Verificare che siano stati completati i necessari controlli di sicurezza per il sistema specifico. Assicurarsi che l’alimentazione del gas (elio) e l’alimentazione principale siano spente/scollegate. Preparare le membrane secondo necessità per il numero specifico di esplosioni a bassa intensità da condurre (Figura 1.1). Tagliare le dimensioni della membrana come richiesto per lo specifico tubo d’urto utilizzato in questo protocollo:Taglia un foglio di pellicola trasparente in un quadrato da 5.5 “x 5.5″ per sigillare la bobina, lasciandola pressurizzare. Tagliare un foglio di carta standard da 8,5″ x 11″ per fotocopiatrici (peso 75 g/m2 ) a 5,5″ x 11″; Piega il foglio di carta risultante a metà per formare un quadrato di 5,5″ x 5,5”. Procurarsi un foglio di membrana mylar da 500 G (spessore 125 μm).NOTA: Questi fogli non vengono rotti o deformati in modo significativo dalla sabbiatura standard a bassa intensità e possono essere riutilizzati per la durata di una giornata di procedura. Prendi un quadrato di pellicola trasparente e un quadrato di carta piegata e disponili su una superficie piana (Figura 1.2). Posiziona la carta piegata sopra la pellicola trasparente e allinea i due l’uno con l’altro nel miglior modo possibile (Figura 1.3). Per accelerare le esplosioni ripetitive, disponi ora tutte le pile di membrane. Inserire la membrana in mylar tra il driver e la bobina arrotolandola in un piccolo tubo (grande circa quanto il dito indice; Figura 1.4,1.5). Inseriscilo completamente nel meccanismo, e lascialo andare per permettergli di srotolarsi contro la guarnizione in gomma che separa la sezione driver dalla bobina. Spingere la bobina verso il driver per fissare il foglio di mylar in posizione; Questo aprì la bobina dalla sezione condotta del tubo d’urto. Posiziona le dita sotto la metà superiore della pellicola trasparente e arrotola con cura sia la pellicola che la carta verso di te, assicurandoti che si arrotolino insieme senza disallinearsi (Figura 1.6). Inserire la pila di membrane tra la bobina e le sezioni guidate del tubo d’urto (Figura 1.7). Lasciare che la pila di membrane si srotoli in modo che la guarnizione di plastica sia rivolta verso la bobina e la carta sia rivolta verso la sezione guidata del tubo (Figura 1.8).NOTA: Questo orientamento creerà una chiusura ermetica in modo che il sistema possa essere pressurizzato. Chiudere il gruppo bobina (Figura 1.9, 1.10). A seconda dei casi, serrare i bulloni a mano o idraulicamente, fissando il gruppo driver-bobina-tubo dell’ammortizzatore in modo che il sistema possa essere pressurizzato. (Controllo di sicurezza; Figura 1.10)NOTA: Per i sistemi idraulici, assicurarsi che la pressione target del gruppo di chiusura sia raggiunta per evitare mancate accensioni, che possono richiedere la sostituzione della membrana e rallentare il processo di esposizione LLB. Usiamo l’idraulica per chiudere il nostro assemblaggio a 500 psi. 3. Preparazione degli animali Accendere il termoforo di ricircolo dell’acqua sotto la camera di anestesia, con la temperatura impostata a 37 °C (Figura 1.11). Posiziona un tampone medico assorbente sopra il termoforo. Nella stanza di attesa, rimuovi un topo dalla sua gabbia domestica e posizionalo in una gabbia di trasferimento vuota. Porta il topo in gabbia nella stanza di esplosione. Portare la portata di ossigeno a 1,0 L/min (lpm) e attivare il sistema di recupero del vuoto (Figura 1.12). Attivare l’isoflurano al 5% (per indurre una rapida perdita di coscienza) e indirizzare il flusso verso la camera di anestesia del roditore (Figura 1.13). Posizionare il topo nella camera per indurre l’anestesia (Figura 1.14). Una volta che il topo è completamente anestetizzato e mostra una respirazione stabile per altri 30 secondi, raggiungere la camera e dare un pugno all’orecchio al topo per un’identificazione inequivocabile a lungo termine del topo per tutto il resto dello studio. Fare questo passaggio ora è necessario per evitare di interferire con i tempi di recupero dopo l’esplosione. Quindi, applicare un lubrificante oftalmico sterile su entrambi gli occhi per prevenire l’essiccazione della cornea. Rimuovi il topo dalla camera e posiziona il naso nell’ogiva (Figura 1.15). Commutare il flusso di anestesia (ad es. isoflurano) dalla camera di induzione al cono di trasmissione. Usa piccoli pezzi di nastro adesivo da laboratorio per trattenere leggermente gli arti del topo contro la barella (Figura 1.16). Dopo aver trattenuto il topo, posizionare una fascetta metallica attorno a ciascun arto e attorcigliarla saldamente, fissando il topo alla barella ai polsi e alle caviglie (Figura 1.17). Metti una fascetta più grande intorno al petto, legandola molto liberamente in modo che la respirazione del topo non sia limitata. Questo servirà come meccanismo di ritenuta secondario nel caso in cui uno qualsiasi dei sistemi di ritenuta degli arti si allenti. Solleva la coda del topo e posizionala sotto il piede sinistro per assicurarti che non venga schiacciata quando la barella viene inserita nel tubo d’urto (Figura 1.18). 4. Procedura LLB Aprire la sezione di esposizione degli animali del tubo d’urto e orientare il mouse in modo che sia rivolto verso l’onda d’urto in arrivo (Figura 1.19). Fissare/sospendere la barella nella sezione di esposizione degli animali (Figura 1.20). Chiudere bene la porta per la sezione di esposizione dell’animale, assicurandosi che il tubo di flusso dell’anestetico non venga schiacciato dalla porta (Figura 1.21). Ridurre l’anestesia al 2,5-3% di isoflurano, 1 lpm per il resto della sessione. Alimentare il sistema in modo appropriato (Figura 1.22). Individuare e collegare la linea di alimentazione per il gas elio compresso (Figura 1.23, 1.24). Lasciare la camera di granigliatura per accedere alla console di controllo del tubo di granigliatura in una stanza adiacente e assicurarsi che non vi siano persone o animali nella sala di granigliatura.NOTA: La protezione dell’udito può essere richiesta dall’istituto o dalle condizioni operative. Tali condizioni possono includere disposizioni di tubi d’urto in cui la console di comando si trova nello stesso spazio aperto del tubo d’urto. Dalla console, accendere il software di acquisizione per registrare l’evento di esplosione (vedere il riquadro verde in Figura 1.25).NOTA: Per queste procedure, raccogliamo i dati dei sensori a una frequenza di campionamento di 20 kHz, che vengono poi elaborati utilizzando il software LabView. Si consiglia di acquisire il campionamento del sensore a ≥10 kHz per ottenere curve di tempo e pressione di alta qualità. Disinnestare qualsiasi blocco di sicurezza (ad esempio, i tasti di controllo dell’alimentazione, che sono rappresentati da una freccia verde nella Figura 1.26). Chiudere entrambe le prese d’aria del gas e pressurizzare passivamente la bobina (Figura 1.27). Non utilizzare il lato conducente. Continuare a riempire fino a quando la membrana non si rompe da sola al picco psi target, come determinato dal numero di fogli di membrana utilizzati. Registrare la pressione di picco, la durata della fase positiva e l’impulso nella posizione dell’animale. (Figura 1.28). Disattivare il meccanismo di riempimento. Tornare al tubo d’urto, scollegare la linea di alimentazione dell’elio e spegnere l’alimentazione al circuito di controllo dell’esplosione (Figura 1.29). Per condurre ripetute esposizioni di LLB sullo stesso animale, aprire la bobina, rimuovere la pila di membrane della bobina, quindi arrotolare e inserire un’altra pila di membrane della bobina (Figure 1.30, 1.31, 1.32). Appiattire la pila di membrane e richiudere l’assieme.NOTA: Per modellare l’esperienza clinica di esposizioni a blasti di basso livello durante l’allenamento SOF empiricamente definito, esponiamo i topi a 5-6 LLB al giorno, limitando le esposizioni giornaliere a un conservativo ~20 psi totale cumulativo45. Gli studi che enfatizzano le relazioni meccanicistiche e dose-risposta possono in alternativa scegliere di utilizzare un numero consistente di esposizioni a LLB con parametri di sovrapressione definiti per sessione. Dopo l’ultimo LLB per l’animale in corso, rimuoverlo dal tubo d’urto, lasciando l’anestesia attiva (Figura 1.33). Slegare l’animale mentre è sotto anestesia. Rimuoverlo dal cono dell’anestesia, posizionandolo sulla schiena sul cuscinetto dell’acqua riscaldata (Figura 1.34). Una volta che l’animale è stato posizionato sul cuscinetto d’acqua, avvia un timer e registra la quantità di tempo fino a quando il topo si capovolge sul lato ventrale (cioè lo stomaco) da solo (Figura 1.35). Registra questo tempo come il tempo di raddrizzamento. Una volta che il topo si è ripreso, rimettilo nella gabbia di casa e continua il monitoraggio secondo necessità. 5. Procedure plurigiornaliere Per modellare le esposizioni di routine ai LLB dalle cariche da sfondamento utilizzate durante l’addestramento SOF Close Quarter Battle, eseguire esposizioni giornaliere ripetute sui topi 5 giorni alla settimana (dal lunedì al venerdì) per un totale di 15 giorni in 3 settimane lavorative standard. 6. Modifica delle pressioni di picco LLB Aumenta la pressione di picco attraverso l’uso di materiali a membrana più resistenti o semplicemente impilando membrane aggiuntive. Ad esempio, utilizzare la membrana Mylar Roll Clear 0,005 (500 G) per produrre una pressione di picco di ~20 psi (se utilizzata sia come membrane driver che come guaine della bobina) o la membrana Mylar Roll Clear 0,002 (200 G) per produrre una pressione di picco di ~10 psi. Regolare i parametri per la durata della fase positiva e l’impulso dell’esplosione per soddisfare le esigenze sperimentali. Per regolare le durate delle fasi positive e gli impulsi, determinare empiricamente le condizioni target sostituendo le fonti di gas compresso47,49 o modificando la lunghezza del driver quando possibile. Il protocollo di cui sopra utilizza l’elio per creare una pressione di picco e una forma d’onda simili a una curva di Friedlander idealizzata. 7. Raccolta dei tessuti NOTA: Le pratiche di raccolta dei tessuti possono essere adattate in base alle esigenze sperimentali. Anestetizzare il topo tramite iniezione intraperitoneale con 210 mg/kg di pentobarbital. Posiziona il mouse in una gabbia per topi o topi con barre o una rete prefabbricata; Metti il topo in gabbia in una cappa aspirante. Una volta che il topo non risponde, posizionalo sulla schiena sulle barre in cima alla gabbia e chiudi la bocca attorno a una delle barre per aiutarlo a rimanere in posizione durante la perfusione. Afferra la pelle dello stomaco, tirala verso l’alto e usa un paio di forbici grandi per fare un buco nella cavità addominale, facendo attenzione a non tagliare nessuno degli organi. Continua a tagliare più in basso lungo la base delle costole per consentire un’articolazione più libera della gabbia toracica. Usando un emostato, avvicinati al topo di lato e afferra il tessuto direttamente sopra la gabbia toracica, ruotando l’emostatico all’indietro per mantenere la base della gabbia toracica angolata in una posizione facilmente accessibile. Usa un paio di pinze o uno strumento simile per tenere l’emostatico in posizione. Usando un piccolo paio di forbici chirurgiche, taglia con cura il diaframma per consentire l’accesso al cuore. Usa un paio di pinze per inclinare delicatamente il cuore in modo che la parte inferiore sia rivolta direttamente verso l’esterno della base aperta della gabbia toracica. Lavora rapidamente in modo che il cuore continui a battere durante la perfusione. Se raccogli sangue, tieni il cuore con un paio di pinze e perfora con cura il ventricolo destro usando una siringa da 3 ml con un ago da 0,5″ da 25 G. Inserire dalla parte inferiore del ventricolo e entrare nel senso della lunghezza, facendo attenzione a non perforare il lato opposto del ventricolo. Tirare delicatamente la siringa fino a quando non sono stati raccolti 0,5-1,0 ml di sangue o il flusso si interrompe, quindi rimuovere la siringa. Usa un paio di forbici chirurgiche per praticare una piccola incisione nell’atrio destro per consentire al sangue e al perfusato di defluire. Tenere il cuore con un paio di pinze e inserire con cautela un ago a farfalla da 25 G nel ventricolo sinistro, inserendolo dal basso. Tenere l’ago a farfalla in posizione con un morsetto di tenuta o a mano. Perfondere l’animale.Collegare una siringa contenente 50 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un ago a farfalla e perfondere a una velocità di circa 10 mL/min. Cerca lo sbiancamento del fegato come segno di una corretta perfusione. Dopo aver svuotato la siringa, scollegarla dall’ago a farfalla. Per la preparazione dei tessuti per la microscopia, sostituire la siringa PBS vuota con una siringa contenente 50 ml di formalina tamponata neutra (NBF) al 10% o una soluzione di formaldeide al 4%. Ripetere i passaggi precedenti per perfondere con formalina.NOTA: Si deve osservare che il topo perfuso si contrae durante la perfusione; Ciò dovrebbe comportare un rigore o una rigidità di tutto il corpo dopo il completamento della procedura. Rimuovere l’ago a farfalla dal cuore e rimuovere il topo dalle barre della gabbia per la raccolta dei tessuti. Rimuovere e sezionare gli organi bersaglio in base alle necessità; Fare attenzione a eseguire le procedure sul ghiaccio quando vengono raccolti materiali freschi e non fissati. Congelare rapidamente tutti i tessuti non fissati che sono stati raccolti in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino a quando non vengono utilizzati nei protocolli di analisi di bersagli proteici o RNA. Per i tessuti fissati, prelevare in una provetta conica da 50 ml etichettata riempita di formalina (una provetta per organo).

Representative Results

Durante lo studio dei risultati sperimentali nei topi a seguito di esposizioni a forze esplosive di esplosione, la registrazione e la caratterizzazione dell’evento attraverso l’analisi della pressione rispetto al tempo è fondamentale per valutare il successo dell’esperimento. Questo metodo, che prevede la misurazione delle variazioni dinamiche di pressione durante l’esplosione, aiuta gli investigatori a comprendere gli effetti delle esplosioni sui sistemi biologici. Negli esperimenti di successo, le registrazioni della pressione mostrano un modello d’onda ben definito e controllato. L’aumento di pressione è brusco, raggiungendo i valori di picco entro i tempi previsti (Figura 2). Il successivo calo di pressione segue una curva prevedibile, esemplificata dalla forma d’onda di Friedlander, che indica un’efficiente dissipazione dell’energia. In termini di valutazione delle lesioni, non sono presenti segni evidenti di lesioni negli esperimenti LLB, anche quando si conduce un’esposizione LLB altamente ripetitiva con un massimo di sei esplosioni che si verificano entro 15-20 minuti (Figura 3). Tuttavia, un’analisi dei tempi di raddrizzamento a seguito di esposizione ripetitiva a LLB indica che i topi blast tornano alla coscienza più velocemente dei topi fittizi (Figura 4). Pertanto, l’LLB ripetitivo provoca cambiamenti riproducibili nelle risposte acute di eccitazione neurocomportamentale dopo l’esposizione. Gli esperimenti non ottimali possono mostrare profili di pressione irregolari. I casi in cui le pressioni di picco vengono abbassate inaspettatamente possono indicare un rilascio prematuro o lento di gas, impedendo il rilascio brusco di espansione del gas lungo la lunghezza della sezione del tubo d’urto azionato per incontrare l’animale nell’area bersaglio. La perdita prematura di pressione del gas è spesso il risultato di sezioni del driver o della bobina sigillate in modo improprio. Ciò può derivare da difetti nella membrana o da un serraggio inadeguato del gruppo driver-bobina-tubo dell’ammortizzatore. In questi casi, i campioni biologici possono mostrare segni ridotti di trauma. L’interpretazione dei dati comporta il collegamento dei profili pressione-tempo con le risposte biologiche osservate. Esperimenti di successo dimostrano che i parametri dell’esplosione scelti, come la pressione di picco e la durata, suscitano le risposte biologiche attese o stabilite in fase di indagine. Le correlazioni tra specifiche caratteristiche di pressione e risultati biologici aiutano a stabilire relazioni causali. Gli studi longitudinali sono resi possibili da questo protocollo a causa della mancanza di perdite di animali osservate per i punti temporali dello studio fino a 6 mesi dopo il LLB finale (Figura 5). La gamma di esiti clinici a seguito dell’esposizione a LLB è sottile e poco compresa. L’esposizione ripetuta agli LLB è stata storicamente considerata dannosa sia per le persone che per i topi. Ciò è supportato da un rapido ritorno alla normale deambulazione, al comportamento e all’attività fisica dopo esposizioni a 2-5 psi. Tuttavia, la mancanza di sintomi neurosensoriali acuti schiaccianti o di cambiamenti comportamentali non preclude l’esistenza di effetti insidiosi negativi. Poiché i fenotipi correlati a LLB sono nella migliore delle ipotesi sottili, l’intera gamma di effetti è un’area di indagine attiva e può richiedere molto tempo o ripetizione per provocare esiti clinicamente significativi. Figura 1: Fasi procedurali per il modello di tubo d’urto di LLB murino ripetuto. Dopo la preparazione del tubo d’urto (Fasi 1-10) e le fasi di preparazione dell’animale (Fasi 11-18), i topi vengono esposti a una o più LLB (Fasi 19-32), prima di essere rimossi dal tubo (Fase 33). I topi vengono quindi posizionati sul retro su un termoforo riscaldato (passaggio 34). La quantità di tempo impiegata dall’animale per capovolgersi sul lato ventrale viene registrata come tempo di raddrizzamento (Passaggio 35). Abbreviazione: LLB = Esplosione di basso livello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Curve pressione-tempo rappresentative per esposizioni vicine a 4 psi. (A) Gli stack di additivi forniscono pressioni di picco lineari nell’intervallo di 2-4,5 psi di picco. I profili rappresentativi di pressione rispetto al tempo (millisecondi) hanno una media di 3-6 esplosioni di tubi d’urto (rosso) rispetto alle curve di Friedlander idealizzate (blu) per (B) 1 foglio, (C) 2 fogli, (D) 3 fogli e (E) 4 fogli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Intervallo intersoggettivo. La messa a punto e l’esecuzione di un singolo getto richiede in media 9,8 ± 1,9 min (media ± errore standard della media (sem)). Ulteriori esposizioni alle esplosioni richiedono ulteriori 1,7 ± 0,4 minuti per evento (media ± sem). I punti rappresentano i risultati dei singoli animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Tempi giornalieri di raddrizzamento durante 3 settimane di esposizioni LLB altamente ripetitive. Il grafico rappresenta i tempi di raddrizzamento normalizzati sham su 3 settimane di esposizione a LLB. I topi LLB sono stati soggetti a 6 esposizioni giornaliere a blast per un totale di 90 esposizioni totali a LLB che si sono verificate nell’arco di 15 giorni. Le caratteristiche medie di sovrapressione erano (± sem) 3,05 ± 0,07 psi di picco, 0,94 ± 0,04 di durata della fase positiva e 2 ± 0,1 psi * msec impulso. I valori p riflettono i risultati dell’ANOVA a 2 vie. Abbreviazione: LLB = Esplosione di basso livello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Effetti del modello LLB shocktube da laboratorio sull’attrito animale a seguito di esposizioni LLB altamente ripetitive. Tassi di abbandono per topi sham (N = 24) e LLB (N = 32) dalla prima esposizione a LLB (giorno 1) fino a tutte le esposizioni dello studio (che termina il giorno 19) e dopo un periodo di recupero di 6 mesi (giorno 199). Non c’è stata alcuna differenza significativa tra i tassi di abbandono dei gruppi sham e LLB nel periodo osservato. I topi LLB hanno sperimentato una media di 62 esposizioni a una media di 4,78 ± 0,01 psi di picco e 3,16 ± 0,023 psi∙ms di impulso. Le esposizioni sono state somministrate ai topi 5 giorni alla settimana (cioè dal lunedì al venerdì) per 3 settimane consecutive per modellare le esposizioni da sovrapressione SOF riportate di recente durante l’allenamento di routine per la violazione45. Abbreviazione: LLB = Esplosione di basso livello; SOF = Forze per le Operazioni Speciali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Non possiamo trattare adeguatamente ciò che non comprendiamo adeguatamente e non comprendiamo ancora i meccanismi di lesione legati all’esposizione altamente ripetitiva a LLB. Molti membri del personale SOF segnalano lo sviluppo di menomazioni legate alla salute che si ritiene siano correlate all’esposizione altamente ripetitiva a LLB entro cinque-dieci anni dal servizio operativo50,51. Alcuni membri del personale SOF sviluppano effetti neurocognitivi simili a lesioni cerebrali traumatiche acute (TBI) subito dopo l’esposizione a LLB39. Inoltre, i medici riferiscono che i sintomi derivanti dall’esposizione alle esplosioni sono spesso refrattari ai trattamenti tradizionali, il che può spingere i SOF e i medici a cercare trattamenti alternativi52,53. Nonostante la frequente esposizione di SOF a LLB e meccanismi di sovrapressione45, la gravità e la resistenza al trattamento dei sintomi risultanti e il modello documentato di cicatrici astrogliali correlate ai blasti51, gli esiti di salute a lungo termine rimangono relativamente sconosciuti. I medici e la leadership militare si affidano alla ricerca modellistica per scoprire i meccanismi di lesione e la fisiopatologia. Questi modelli sono fondamentali per lo sviluppo di politiche e strategie per identificare, interrompere, prevenire e trattare precocemente il processo patologico.

Fondamentalmente, si prevede che la modellazione murina delle comuni esposizioni militari a LLB informerà i modelli di previsione della salute. La pratica clinica trarrebbe vantaggio dai modelli predittivi LLB che identificano chi può essere a maggior rischio di patologia correlata all’esplosione, quali proprietà dell’esplosione provocano gli esiti più gravi e come il processo patologico può evolversi in base alla cronicità, al dosaggio o alla specificità dell’esposizione all’esplosione. Pertanto, la modellazione dell’esposizione ripetitiva a LLB è essenziale per lo sviluppo di ipotesi e previsioni su come le esposizioni influenzeranno gli esiti sanitari di SOF e di altri membri del servizio. I modelli di previsione e di meccanismo di lesione informerebbero la diagnostica e il trattamento, nonché le decisioni di ritorno in servizio basate sui sintomi e sull’esposizione.

Lo studio del trauma cranico indotto da blasti (bTBI) nei topi ha visto progressi significativi negli ultimi anni, in particolare con lo sviluppo di modelli che prevedono gli esiti a seguito di bTBI lieve cronico ripetitivo nell’uomo54,55. Mentre lo studio dell’esposizione a esplosioni di livello medio-alto utilizzando shocktube è ben sviluppato con centinaia di articoli indicizzati da PubMed 46,56,57,58, l’uso di shocktube negli studi di esplosioni vicino a sovrapressioni di addestramento militare di routine (pressione di picco <6 psi40) è meno sviluppato, con meno di dieci articoli identificati in una recente ricerca su PubMed 19,20, 22,23,26,27,28. Per facilitare lo sviluppo di questo campo poco studiato, il modello presentato si concentra su considerazioni chiave per sovrapressioni LLB costanti nei topi, recupero post-esplosione e monitoraggio, notando diversi vantaggi distinti di questo modello rispetto all’uso di esplosivi in campo aperto. Infatti, sosteniamo che il modello di LLB di laboratorio descritto può consentire lo sviluppo di modelli predittivi degli esiti clinici a seguito di LLB cronico ripetitivo.

Il modello LLB offre vantaggi critici rispetto ai modelli con esplosivo esplosivo in campo aperto, in particolare in termini di benessere degli animali. I modelli in campo aperto possono portare a tassi di mortalità del 3-8%25,36, mentre questo modello LLB basato su laboratorio non mostra perdite. Questa distinzione è cruciale, soprattutto quando si simulano le elevate esposizioni cumulative tipiche dell’addestramento militare, dove praticamente nessun tirocinante sperimenta esiti fatali dall’esposizione a LLB. L’apparente assenza di apnea o di altre cause di morte, come un trauma polmonare letale, garantisce l’affidabilità e la coerenza del modello, posizionandolo come scelta preferita per gli studi sugli effetti clinicamente rilevanti della LLB ripetitiva.

Questo protocollo è specifico per un tubo d’urto “aperto” con un design in tre parti, costituito da driver, bobina e sezioni condotte. LLB altamente ripetitivi possono essere ottenibili con altri modelli di tubi d’urto con opportune modifiche al protocollo. I design dei tubi d’urto aperti sono spesso utilizzati per lo studio dei neurotraumi indotti da esplosioni 46,47,48. Il tubo d’urto aperto, dotato di un’estremità di uscita aperta, consente all’onda d’urto generata di propagarsi liberamente lungo la lunghezza del tubo dove incontra il suo bersaglio (ad esempio, il soggetto animale) prima di uscire dall’estremità opposta del tubo. Questo design facilita la riproduzione e lo studio di sovrapressioni di esplosione primaria relativamente pure, approssimando le proprietà delle esplosioni di esplosione come si verificherebbero in campo aperto48. Di conseguenza, la fedeltà dell’onda di sovrapressione dell’esplosione misurata empiricamente viene confrontata con un’onda di Friedlander idealizzata; Ciò consente di valutare le prestazioni del tubo per produrre uno specifico evento di sovrapressione. Per modellare l’esposizione all’LLB, utilizziamo un tubo di scoppio aperto da48 esemplari precedentemente costruito, originariamente progettato per riprodurre gli effetti delle detonazioni di HLB di oltre 200+ libbre di trinitrotoluene (TNT) a una distanza di standoff di ~25 piedi. Per consentire elevate sovrapressioni di picco, un gas viene pressurizzato nel driver, che è separato dalla bobina da una membrana, sigillando il gas nel driver. La bobina, a sua volta, è anche separata dalla sezione aperta da un’altra membrana. Questa seconda membrana consente di pressurizzare separatamente la bobina. Il sistema a doppia camera consente di pressurizzare i gas nel driver oltre il normale punto di rottura della membrana. Ciò si verifica perché la bobina pressurizzata funge da tampone, sostenendo la membrana all’interfaccia del driver e della bobina, prevenendone così la rottura. Quando l’operatore del tubo d’urto desidera generare un’onda d’urto alla pressione target, una valvola elettronica scarica il gas dalla bobina, abbassando rapidamente la pressione nella bobina e consentendo al gas sovrapressurizzato nella sezione del driver di rompere sia la membrana del driver che quella della bobina e di espandersi rapidamente lungo la lunghezza del tubo dove incontra l’animale nella zona target. La modifica chiave che consente lo studio dell’LLB in tubi ad alte prestazioni di questo design è che blocchiamo il driver e utilizziamo la bobina solo in combinazione con membrane a bassa soglia.

Per garantire l’affidabilità e la riproducibilità degli esperimenti LLB, è necessario intraprendere alcune azioni durante la configurazione. Fissare saldamente le braccia e le gambe ai polsi e alle caviglie è fondamentale. Ciò riduce al minimo la variabilità dei movimenti corporei e l’esposizione alle esplosioni e previene lesioni involontarie che potrebbero confondere i risultati. Inoltre, la rotazione dei polsi e delle caviglie verso l’interno aiuta a dirigere il movimento delle appendici verso la linea mediana dell’animale, riducendo il rischio di lesioni distali che potrebbero influenzare le successive valutazioni delle prestazioni motorie. Il raddrizzamento della testa e la curvatura della colonna vertebrale sono un altro fattore essenziale per garantire un’esposizione uniforme ai blast tra i soggetti, in quanto aiuta a ridurre le potenziali differenze nel raggio di movimento. Si raccomanda di aumentare la percentuale di isoflurano utilizzata per l’anestesia per i protocolli che durano più giorni o settimane. Questa regolazione aiuta a mantenere costante la profondità dell’anestesia per tutta la durata estesa dell’esperimento. Nella nostra esperienza, un aumento dello 0,5% di isoflurano è sufficiente per mantenere un’anestesia adeguata.

Tuttavia, l’erogazione dell’anestesia tramite ogiva potrebbe non essere possibile per tutti i modelli di tubi di sabbiatura, in particolare per quelli con involucri completi che non consentono l’inserimento del tubo nella sezione guidata. In tali casi, possono essere preferibili anestetici iniettabili. Si consiglia di determinare quanto tempo è necessario per l’erogazione delle esplosioni sequenziali ripetute e quindi di somministrare una quantità sufficiente di anestetico per mantenere l’incoscienza durante la procedura. Durante lo sviluppo di questo metodo modificato potrebbero essere necessari ulteriori controlli sul benessere degli animali per garantire un corretto mantenimento dell’anestesia. Inoltre, l’uso di sostanze iniettabili può rendere impossibile il monitoraggio della risposta post-acuta, come la raccolta di misure del tempo di raddrizzamento.

Le considerazioni etiche sono fondamentali nella ricerca sugli animali e questo modello LLB basato su laboratorio incorpora protocolli completi di recupero e monitoraggio post-esplosione. Gli endpoint umanitari dopo l’esposizione all’esplosione, tra cui difficoltà respiratorie, incapacità di raddrizzarsi, stato non deambulante dopo un periodo di osservazione di 2 ore, movimenti simili a convulsioni, movimenti goffi, compromissione della vista e evidenza di emorragie interne o arti fratturati, sono attentamente osservati. In particolare, i topi blast LLB non hanno mostrato nessuna di queste condizioni nei nostri esperimenti. Tuttavia, durante gli HLB possono verificarsi fratture degli arti, spesso a causa di un errore dell’operatore. La mitigazione di questo rischio comporta la rotazione delle mani e dei piedi verso la linea mediana dell’animale durante il fissaggio della barella. Questa tecnica impedisce al vento di spazzare le appendici all’indietro e rompere le ossa associate.

I vantaggi di questo modello LLB ripetitivo si estendono oltre le considerazioni etiche agli aspetti pratici e metodologici. Il suo design da laboratorio elimina la necessità di maneggiare esplosivi, migliorando così la sicurezza e l’accessibilità. Il modello è altamente riproducibile e personalizzabile, consentendo ai ricercatori di influenzare i parametri di esposizione attraverso l’uso di diversi tipi di gas, impostazioni del dispositivo e intensità della membrana. L’elio, che viene scelto qui per la sua capacità di riprodurre la cinetica di esplosione in campo aperto49, può fornire una linea di base affidabile 47,59,60. La regolazione empirica della pressione di picco si ottiene modificando lo spessore o la forza della membrana di ritenzione, consentendo la messa a punto per specifici requisiti sperimentali. Infine, il modello LLB elimina l’impatto delle variazioni stagionali o meteorologiche sui dati, sull’esposizione degli animali e su altri fattori sperimentali. Questa coerenza garantisce risultati robusti e affidabili, rendendo questo modello LLB ripetitivo uno strumento inestimabile per la ricerca longitudinale e altamente ripetitiva dell’esplosione.

La comprensione del neurotrauma correlato all’esplosione richiede di chiarire i meccanismi di lesione, le metriche di intensità dell’esplosione e i valori di soglia. Tuttavia, le incertezze circondano i meccanismi di lesione cerebrale umana negli scenari di esplosione. I criteri precedentemente proposti per le lesioni umane a seguito di esposizione all’esplosione si sono basati su studi sugli animali, ma è difficile applicare direttamente questi studi all’uomo a causa di criteri di scala incompleti tra le specie61. La scala delle lesioni polmonari basata sulla massa corporea animale è un’eccezione, data la presenza di criteri accettati62,63. Le leggi di scala proposte per gli effetti cerebrali, basate sul corpo64,65 o sulla massa cerebrale66, tuttavia, trascurano le differenze anatomiche note e sconosciute, in particolare per quanto riguarda le strutture protettive all’interno e intorno al cervello. La scala di massa prevede rischi di lesioni più elevati nelle specie più piccole, che sono contraddetti da studi sia negli uccelli 67,68,69 che nell’uomo 70. Lo sviluppo di leggi di scala accurate richiede quindi una comprensione empirica della relazione tra l’intensità dell’evento di esplosione esterna e gli effetti cerebrali interni tra le specie. Nel caso delle LLB, si sa molto poco sull’esposizione singola o cronica in modelli animali o persone. Di conseguenza, gli studi empirici necessari per informare lo sviluppo delle future leggi di scala nell’intervallo di intensità LLB possono essere catalizzati dal nostro metodo.

In sintesi, questo modello di shocktube di laboratorio rappresenta un progresso significativo nello studio degli effetti cronici dell’esposizione a LLB nei topi. Incorporando procedure per la modellazione di sovrapressioni costanti, dando priorità al recupero e al monitoraggio post-esplosione ed evidenziando vantaggi distinti rispetto ai modelli alternativi, questo modello LLB basato su laboratorio può fornire una scelta affidabile ed etica per far progredire la nostra comprensione delle lesioni correlate all’esposizione cronica a LLB.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JSM ha ricevuto finanziamenti dal Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti (VA), dall’Office of Biomedical Laboratory Research & Development (JSM, I01BX004896) e dal VA Northwest Mental Illness Research Education and Clinical Center, un’entità VA su mandato del Congresso che indaga sulle lesioni cerebrali indotte da esplosioni e sullo stress post-traumatico in comorbilità. JSM riporta finanziamenti non correlati dal FY22 Traumatic Brain Injury and Psychological Health Research Program Translational Research Award (W81XWH-22-TBIPHRPTRA, numero di premio HT94252310755). Gli autori ringraziano Andrew Shutes-David per la sua assistenza editoriale.

Materials

Adroit Thermal Recirculating Heat Pump (120 V) Parkland Scientific HTP-1500
Copy paper, 75 g/m2 weight Staples 897804
Disposable Absorbant Blue Pads VWR 82020-845
Forane Inhalant Solution MedLine 10019-360-60
Helium Linde UN1046
Laboratory tape (1") VWR 89098-076
LabView software Emerson V 2011
Medical oxygen Central Welding Supply UN1072
Mylar, 0.005 thickness Tapp Plastics 22934
Plastic cling wrap Santa Cruz Biotechnology sc-3687
Plastic twist ties  VWR 11215-940
Pneumatic Shocktube (with driver and spool sections; target area sized for mice, 20 kHz sampling rate pressure sensors, control and acquisition software) BakerRisk, San Antonio, TX custom
Reusable Heavy Duty Heating Pad (12" x 18") Parkland Scientific 121218
Scissor-style, Rodent Ear Punch Kent Scientific INS750076-2
Sliding Top Chambers for Traditional Vaporizers Kent Scientific VetFlo-0530SM
VetFlo Isoflurane Vaporizer Kent Scientific VetFlo-1210S
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Repetitive Low-level Blast ExposureMouse ModelPneumatic Shock TubeOpen-field BlastTraumatic Brain InjuryMilitary TrainingBlast Overpressure

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Crabtree, A., McEvoy, C., Muench, P., Ivory, R. A., Rodriguez, J., Omer, M., Charles, T., Meabon, J. S. Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (207), e66592, doi:10.3791/66592 (2024).
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