Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hücresel biyolojiyi anlamak için çok sayıda strateji mevcuttur. Bir yaklaşım, genetik mutasyonların bir gene sokulduğu ve ardından bir model organizmada ortaya çıkan fenotipik değişikliklerin değerlendirilmesinin izlediği yukarıdan aşağıya bir stratejiyi içerir. Tersine, indirgemeci bir yaklaşım, belirli bir proteinin moleküler mekanizmalarının ve enzimatik fonksiyonlarının, diğer hücresel bileşenlerle etkileşimlerinin karakterizasyonu ile birlikte ilk açıklanmasını gerektirir. Daha sonra, bu proteinin biyolojik bir yol üzerindeki etkisi değerlendirilir. Her araştırma yaklaşımının kendine özgü avantajları ve sınırlamaları olmasına rağmen, biyolojik bir yolun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, disiplinler arası araştırmaları gerektirir.

DNA’nın yaşamın genetik planı olmasıyla, DNA kopyalanması ve genom bakımı mekanizmalarını anlamak, yetmiş yılı aşkın bir süredir aktif bir ilgi alanı olmuştur. DNA replikasyonu alanındaki çalışmalar, çok sayıda replikasyon proteininin bireysel yapıları ve işlevleri hakkında bol miktarda veri sağlamıştır. Mekanik yönleri ve biyokimyasal aktivite testlerini kapsayan bu araştırmalar, bu proteinlerin saflaştırılması yoluyla mümkün hale getirilmiş ve in vitro ortamda titiz bir şekilde incelenmelerini sağlamıştır. Sonuç olarak, protein saflaştırması, DNA replikasyonuna ilişkin mekanik içgörüleri çözmeye yönelik araştırma çabalarının çoğunda vazgeçilmez ve her yerde bulunan bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.

Bu makale, bakteri hücrelerinde aşırı eksprese edilmiş 6X-histidin ile etiketlenmiş bir DNA replikasyon proteinini izole etmek için bir metodoloji sunmaktadır. İlgilenilen protein, gecikmeli iplik replikasyonunda çok önemli bir rol oynayan ve aynı zamanda baz eksizyon onarımı (BER) gibi DNA onarım yollarında kritik bir katılımcı olan yapıya özgü bir nükleaz olan insan flep endonükleaz 1’dir (^FEN1)1,2,3. FEN1’in birincil işlevi, DNA replikasyonu veya BER sırasında ortaya çıkan bir ara ürün olan 5′ yer değiştirmiş bir flep yapısının tabanında parçalanmaktır. Başlangıçta, FEN1’in enzimatik aktivitesini değerlendiren biyokimyasal araştırmalar, nükleazın bir flep yapısının serbest 5′-fosfat ucunu tanıyacağı ve daha sonra onu parçalamadan önce flebi^{tabanına kadar} takip edeceği bir “izleme” mekanizması önerdi 4. Daha sonraki araştırmalar, FEN1’in bir “diş açma” mekanizması ile çalıştığını, burada önce kanadın tabanına bağlandığını ve daha sonra serbest 5′ ucunu bölünmeden önce aktif bölgesinden geçirdiğini ortaya koydu (Şekil 1)⁵. Rekombinant FEN1’i aşırı eksprese etme ve izole etme yeteneği, bu atılımları kolaylaştırmış ve araştırmacıların onu biyokimyasal ve yapısal araştırmalarda kullanmalarını sağlamıştır.

Afinite kromatografisi, DNA’yı saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan bir ayırma yöntemidir. Bu teknik, ilgilenilen proteini spesifik olarak yakalamak için hedef proteinlerin bir reçine üzerinde hareketsiz hale getirilmiş ligandlara doğru tersinir bağlanma afinitesini kullanır. En yaygın olarak kullanılan biyo-afinitelerden biri, amino asit, histidin ve nikel ve kobalt gibi metal iyonları arasındaki sağlam etkileşimdir ve bu nedenle Ni2⁺ veya Co²⁺ ile yüklü bir reçine üzerine yakalanabilir.

6-9 histidin kalıntısından (His) oluşan bir diziyi kodlayan DNA dizisi, sıklıkla ilgilenilen proteini (N-terminalinde veya C-terminalinde) kodlayan plazmit yapısına dahil edilir ve proteini bir 6X-His-etiketi veya bir poli-His etiketi ile etiketler. His etiketli protein daha sonra, reçine üzerindeki metal iyonlarının daha sonra uygun elüsyon ajanları kullanılarak ayrıştırılabilen bir afinite etiketi ile proteinleri yakaladığı bir afinite kromatografisinin bir alt türü olan hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) ile kolayca saflaştırılabilir. Ni2+ ve Co²⁺ gibi geçiş metali iyonları, N, N, N’-tris- (karboksimetil) -etilendiamin veya nitrilotriasetik asit (NTA) gruplarından⁶‘ türetilen agaroz veya silika jel matrisleri üzerine immobilize edilebilir.

Metal ligandların fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerle bozulmaya karşı dayanıklı oldukları bilinmektedir ve bu avantajı diğer ligand türlerine göre ^6,7 tutarlar. Ek olarak, His-tag nispeten küçük bir etikettir ve protein yapısını veya işlevini önemli ölçüde etkilemez⁷. Bununla birlikte, bir bakteri ekspresyon sisteminde, kromozomal olarak eksprese edilen birçok protein, metal iyonlarına karşı bir afiniteye sahiptir ve hedef protein ile birlikte saflaştırılabilir. Nikel ve kobalt, IMAC matrislerinde kullanılan tipik metal iyonlarıdır. Ni-NTA reçinesi ve TALON kobalt bazlı reçine, His etiketli proteinlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılır.

Ni-NTA, TALON’a karşı
Hem Ni-NTA hem de TALON’un ilgili metal iyonları, NTA ligandları aracılığıyla reçine üzerinde hareketsiz hale getirilir. Ni-NTA’nın 100 mg / mL’ye kadar protein bağlayan daha yüksek bir bağlanma kapasitesine sahip olduğu düşünülmektedir. Bu, kirletici proteinlerin birlikte saflaştırılabileceği uyarısı ile daha yüksek bir protein verimi ile sonuçlanabilir. Buna karşılık, reçine, His etiketli proteinlere karşı daha yüksek bir bağlanma özgüllüğüne sahiptir ve daha yüksek saflıkta fraksiyonlar üretebilir. Bu çalışmada, referans alınan otomatik hızlı protein sıvı kromatografi sistemi olan NGC sistemini kullanarak her iki reçinenin saflaştırma verimliliğini karşılaştırmayı amaçlıyoruz (Malzeme Tablosuna bakınız).

Tamponlar ve uyumluluk
Hücre parçalanması, numune hazırlama, reçine dengesi ve yakalanan proteinin reçineden elüsyonu için protein saflaştırması sırasında tamponlar gereklidir. 100 mM konsantrasyona kadar Tris, MOPS ve HEPES tamponları, Ni-NTA reçinesi için bilinen uyumlu tamponlardır. Tamponlar genellikle proteinin oksidasyonunu ve protein agregasyonunu önlemek için indirgeyici maddeler içerir. Bununla birlikte, bir eşik sınırının üzerinde, indirgeyici maddeler reçineyi metal iyonlarından sıyırabilir. Yukarıda belirtilen nikel ve kobalt bazlı reçineler için beta-merkaptoetanol (BME) veya ditiyotreitol (DTT) gibi indirgeyici ajanların önerilen konsantrasyonu 1 mM’nin altındadır.

hFEN1’in saflaştırılması için tamponlar, NaCl, BME, fenilmetilsülfonil florür (PMSF), EDTA ve gliserol içeren Tris tamponlarıdır. NaCl, proteini çözünür formda tutar ve DNA bağlanması gibi moleküler etkileşimleri bozar. BME, oksitlenmiş proteinleri azaltır ve böylece protein agregasyonunu önler. PMSF), hedef proteinin proteaz aracılı bozunmasını önleyen bir proteaz inhibitörüdür. EDTA, numunedeki iki değerlikli katyonları ortadan kaldırarak nükleazlara ve proteazlara erişimlerini engeller. Gliserol, proteinin sulu formdaki stabilitesini arttırır. Ek olarak, lizis tamponu, hücre lizizi sırasında hedef proteinin bozulan proteazlardan maksimum korumasını sağlamak için tam proteaz inhibitör tabletleri içerir. Dengeleme ve elüsyon tamponları imidazol içerir, elüsyon tamponu, imidazolün elüsyon sırasında bağlı proteini reçineden uzaklaştırması için daha yüksek miktarlar içerir.

Yeni Nesil Kromatografi (NGC) sistemi
Hızlı akışlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) için tasarlanan bu otomatik, orta basınçlı kromatografi sistemi, iki farklı tamponu aynı anda pompalamak için iki pompa kullanır ve 250 μL’den 100 mL’ye kadar çok çeşitli numune hacimlerini enjekte edebilir. Numune döngüsü (bu sistemde Dynaloop olarak bilinir), daha büyük numune hacimlerinin enjekte edilmesini mümkün kılar. Sistem, özelleştirilmiş yöntem oluşturmayı, saflaştırma çalışmalarının manipülasyonunu ve UV tepe noktalarının ve protein fraksiyonlarının analizini kolaylaştıran Chromlab yazılımı kullanılarak çalıştırılabilir.