Аффинная очистка белка, меченного 6X-His-Tag, с помощью системы жидкостной хроматографии быстрого белка

Существует множество стратегий для постижения клеточной биологии. Один из подходов включает в себя нисходящую стратегию, при которой генетические мутации вводятся в ген с последующей оценкой полученных фенотипических изменений в модельном организме. С другой стороны, редукционистский подход предполагает первоначальное выяснение молекулярных механизмов и ферментативных функций конкретного белка, сопровождаемое характеристикой его взаимодействий с другими клеточными компонентами. Впоследствии оценивается влияние этого белка на биологический путь. Несмотря на то, что каждый исследовательский подход имеет свои преимущества и ограничения, достижение всестороннего понимания биологического пути требует междисциплинарных исследований.

Поскольку ДНК является генетическим планом жизни, понимание механизмов дупликации ДНК и поддержания генома является областью активного интереса на протяжении более семи десятилетий. Исследования в области репликации ДНК дали обширные данные об отдельных структурах и функциях многочисленных репликационных белков. Эти исследования, которые охватывают механистические аспекты и анализы биохимической активности, стали возможными благодаря очистке этих белков, что позволяет тщательно исследовать их в среде in vitro . Следовательно, очистка белка становится незаменимым и повсеместным методом в большинстве исследовательских начинаний, направленных на разгадку механистических представлений о репликации ДНК.

В данной статье представлена методика выделения белка репликации ДНК, меченного 6X-гистидином, который был сверхэкспрессирован в бактериальных клетках. Интересным белком является эндонуклеаза лоскута человека 1 (FEN1), структурно-специфическая нуклеаза, которая играет ключевую роль в репликации запаздывающей цепи, а также является важным участником путей репарации ДНК, таких как эксцизионная репарация оснований (BER)^1,2,3. Основная функция FEN1 заключается в расщеплении в основании 5′-смещенной структуры лоскута, промежуточного продукта, который возникает во время репликации ДНК или BER. Первоначально биохимические исследования, оценивающие ферментативную активность FEN1, предполагали механизм «слежения», при котором нуклеаза распознает свободный 5′-фосфатный конец структуры лоскута, а затем следует вдоль лоскута к его основанию, прежде чем расщепить его^. Последующие исследования показали, что FEN1 работает с помощью механизма «нарезания резьбы», при котором он сначала связывается с основанием лоскута, а затем продевает свободный 5′-конец через его активный участок до расщепления (Рисунок 1)⁵. Способность сверхэкспрессировать и изолировать рекомбинантный FEN1 способствовала этим прорывам, что позволило исследователям использовать его в биохимических и структурных исследованиях.

Аффинная хроматография является широко используемым методом разделения для очистки ДНК. В этом методе используется обратимое аффинность связывания белков-мишеней по отношению к лигандам, иммобилизованным на смоле, чтобы специфически захватить интересующий белок. Одним из наиболее широко используемых биосродств является устойчивое взаимодействие между аминокислотой, гистидином и ионами металлов, таких как никель и кобальт, и, следовательно, может быть захвачено смолой, заряженной Ni²⁺ или Co²⁺.

Последовательность ДНК, кодирующая цепочку из 6-9 остатков гистидина (His), часто встраивается в плазмидную конструкцию, которая кодирует представляющий интерес белок (либо на N-конце, либо на C-конце), помечая белок 6X-His-меткой или поли-His-меткой. Меченный His-меткой белок затем может быть легко очищен с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC), подтипа аффинной хроматографии, при которой ионы металлов на смоле захватывают белки с аффинной меткой, которые впоследствии могут быть элюированы с помощью соответствующих элюирующих агентов. Ионы переходных металлов, такие как Ni²⁺ и Co^2+, могут быть иммобилизованы на агарозных или силикагелевых матрицах, полученных из N,N,N’-трис-(карбоксиметил)-этилендиамина или группы нитрилотриуксусной кислоты (NTA)⁶.

Известно, что лиганды металлов устойчивы к деградации под воздействием физических, химических и биологических факторов и обладают этим преимуществом перед другими типами лигандов ^6,7. Кроме того, His-метка является относительно небольшой меткой и не оказывает существенного влияния на структуру белка или функцию⁷. Однако в бактериальной экспрессионной системе многие хромосомно экспрессируемые белки имеют сродство к ионам металлов и могут совместно очищаться с белком-мишенью. Никель и кобальт являются типичными ионами металлов, используемыми в матрицах IMAC. Смола Ni-NTA и смола на основе кобальта TALON обычно используются для очистки белков, меченных His.

Ni-NTA в сравнении с TALON
Соответствующие ионы металлов Ni-NTA и TALON иммобилизуются на смоле с помощью лигандов NTA. Считается, что Ni-NTA обладает более высокой связывающей способностью, связывая до 100 мг/мл белка. Это может привести к более высокому выходу белка с оговоркой, что загрязняющие белки могут подвергаться совместной очистке. Напротив, смола обладает более высокой специфичностью связывания по отношению к белкам, меченным His, и может быть способна производить фракции более высокой чистоты. В этом исследовании мы стремимся сравнить эффективность очистки обеих смол с помощью эталонной автоматизированной системы жидкостной хроматографии быстрых белков, системы NGC (см. Таблицу материалов).

Буферы и совместимость
Буферы необходимы во время очистки белка для лизиса клеток, подготовки образцов, уравновешивания смолы и элюирования захваченного белка из смолы. Буферы Tris, MOPS и HEPES с концентрацией до 100 мМ являются известными совместимыми буферами для смолы Ni-NTA. Буферы часто включают восстановители для предотвращения окисления белка и его агрегации. Однако при превышении порогового предела восстановители могут лишить смолу ионов металлов. Рекомендуемая концентрация восстановителей, таких как бета-меркаптоэтанол (BME) или дитиотреитол (DTT), составляет менее 1 мМ для вышеупомянутых смол на основе никеля и кобальта.

Буферами для очистки hFEN1 являются трис-буферы, содержащие NaCl, BME, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), ЭДТА и глицерин. NaCl поддерживает белок в растворимой форме и нарушает молекулярные взаимодействия, такие как связывание ДНК. БМЭ восстанавливает окисленные белки и тем самым предотвращает агрегацию белков. PMSF) является ингибитором протеазы, который предотвращает протеазно-опосредованную деградацию белка-мишени. ЭДТА удаляет двухвалентные катионы из образца, предотвращая их доступ к нуклеазам и протеазам. Глицерин усиливает стабильность белка в водной форме. Кроме того, буфер для лизиса содержит полные таблетки ингибитора протеазы для обеспечения максимальной защиты целевого белка от деградации протеаз во время лизиса клеток. Уравновешивающий и элюирующий буферы содержат имидазол, при этом элюирующий буфер содержит большее количество имидазола для вытеснения связанного белка из смолы во время элюирования.

Система хроматографии нового поколения (NGC)
Эта автоматизированная хроматографическая система среднего давления, предназначенная для быстропроточной жидкостной хроматографии белков (FPLC), использует два насоса для одновременной накачки двух разных буферов и способна вводить образцы в широком диапазоне объемов от 250 μл до 100 мл. Петля образца (известная в этой системе как Dynaloop) позволяет вводить образцы больших объемов. Система может управляться с помощью программного обеспечения Chromlab, которое облегчает создание индивидуальных методов, управление очистными циклами и анализ УФ-пиков и белковых фракций.