Purification d’affinité d’une protéine marquée 6X-His à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides

De nombreuses stratégies sont disponibles pour comprendre la biologie cellulaire. Une approche implique une stratégie descendante, dans laquelle des mutations génétiques sont introduites dans un gène, suivies de l’évaluation des changements phénotypiques qui en résultent dans un organisme modèle. À l’inverse, une approche réductionniste implique l’élucidation initiale des mécanismes moléculaires et des fonctions enzymatiques d’une protéine particulière, accompagnée de la caractérisation de ses interactions avec d’autres composants cellulaires. Par la suite, l’impact de cette protéine sur une voie biologique est évalué. Bien que chaque approche de recherche possède ses avantages et ses limites inhérents, la compréhension complète d’une voie biologique nécessite des investigations interdisciplinaires.

L’ADN étant le modèle génétique de la vie, la compréhension des mécanismes de duplication de l’ADN et de maintenance du génome est un domaine d’intérêt actif depuis plus de sept décennies. Des études dans le domaine de la réplication de l’ADN ont fourni de nombreuses données concernant les structures et les fonctions individuelles de nombreuses protéines de réplication. Ces recherches, qui englobent les aspects mécanistes et les dosages d’activité biochimique, ont été rendues possibles grâce à la purification de ces protéines, ce qui a permis leur examen méticuleux dans un environnement in vitro . Par conséquent, la purification des protéines apparaît comme une technique indispensable et omniprésente dans la majorité des efforts de recherche visant à démêler les connaissances mécanistes de la réplication de l’ADN.

Cet article présente une méthodologie permettant d’isoler une protéine de réplication de l’ADN marquée avec de la 6X-histidine, qui a été surexprimée dans les cellules bactériennes. La protéine d’intérêt est l’endonucléase de lambeau humain 1 (FEN1), une nucléase spécifique à la structure qui joue un rôle central dans la réplication des brins retardés et qui est également un participant essentiel dans les voies de réparation de l’ADN comme la réparation par excision de base (BER)^1,2,3. La fonction principale de FEN1 est de cliver à la base d’une structure de lambeau déplacée de 5′, un intermédiaire qui se produit lors de la réplication de l’ADN ou BER. Initialement, des études biochimiques évaluant l’activité enzymatique de FEN1 ont suggéré un mécanisme de « suivi », dans lequel la nucléase reconnaîtrait l’extrémité libre 5′-phosphate d’une structure de lambeau, puis suivrait le lambeau le long de sa base avant de le fendre⁴. Des recherches ultérieures ont révélé que FEN1 fonctionne via un mécanisme de « filetage », dans lequel il se lie d’abord à la base du rabat, puis enfile l’extrémité libre de 5′ à travers son site actif avant le clivage (Figure 1)⁵. La capacité de surexprimer et d’isoler FEN1 recombinant a facilité ces percées, permettant aux chercheurs de l’utiliser dans des études biochimiques et structurales.

La chromatographie d’affinité est une méthode de séparation couramment utilisée pour purifier l’ADN. Cette technique utilise l’affinité de liaison réversible des protéines cibles envers des ligands immobilisés sur une résine pour piéger spécifiquement la protéine d’intérêt. L’une des bio-affinités les plus largement utilisées est l’interaction robuste entre l’acide aminé, l’histidine et les ions métalliques tels que le nickel et le cobalt et, par conséquent, peut être capturée sur une résine chargée de Ni²⁺ ou de Co²⁺.

La séquence d’ADN codant pour une chaîne de 6 à 9 résidus d’histidine (His) est fréquemment incorporée dans la construction plasmidique qui code pour la protéine d’intérêt (soit à l’extrémité N-terminale, soit à l’extrémité C), en marquant la protéine avec une étiquette 6X-His-Tag ou une étiquette poly-His. La protéine marquée par His peut ensuite être facilement purifiée par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC), un sous-type de chromatographie d’affinité où les ions métalliques sur la résine capturent des protéines avec un marqueur d’affinité, qui peuvent ensuite être éluées à l’aide d’agents d’élution appropriés. Les ions de métaux de transition tels que le Ni²⁺ et le Co²⁺ peuvent être immobilisés sur des matrices d’agarose ou de gel de silice dérivées des groupes⁶ de la N,N,N’-tris-(carboxyméthyl)-éthylènediamine ou de l’acide nitrilotriacétique (NTA).

Les ligands métalliques sont connus pour être robustes contre la dégradation par des facteurs physiques, chimiques et biologiques et présentent cet avantage sur les autres types de ligands ^6,7. De plus, le His-tag est un marqueur relativement petit et n’a pas d’impact significatif sur la structure ou la fonction des protéines⁷. Cependant, dans un système d’expression bactérien, de nombreuses protéines exprimées chromosomiquement ont une affinité pour les ions métalliques et peuvent co-se purifier avec la protéine cible. Le nickel et le cobalt sont les ions métalliques typiques utilisés dans les matrices IMAC. La résine Ni-NTA et la résine à base de cobalt TALON sont couramment utilisées pour la purification des protéines marquées His.

Ni-NTA contre TALON
Les ions métalliques respectifs du Ni-NTA et du TALON sont immobilisés sur la résine par des ligands NTA. On pense que le Ni-NTA a une capacité de liaison plus élevée, se liant jusqu’à 100 mg/mL de protéines. Cela peut entraîner un rendement en protéines plus élevé, avec la mise en garde que les protéines contaminantes peuvent être co-purifiées. En revanche, la résine a une spécificité de liaison plus élevée envers les protéines marquées par His et peut être capable de produire des fractions de plus grande pureté. Dans cette étude, nous visons à comparer l’efficacité de purification des deux résines à l’aide du système automatisé de chromatographie liquide à protéines rapides référencé, le système NGC (voir le tableau des matériaux).

Tampons et compatibilité
Des tampons sont nécessaires lors de la purification des protéines pour la lyse cellulaire, la préparation des échantillons, l’équilibrage de la résine et l’élution de la protéine capturée de la résine. Les tampons Tris, MOPS et HEPES jusqu’à une concentration de 100 mM sont les tampons compatibles connus pour la résine Ni-NTA. Les tampons comprennent souvent des agents réducteurs pour empêcher l’oxydation des protéines et l’agrégation des protéines. Cependant, au-delà d’une limite seuil, les agents réducteurs pourraient débarrasser la résine des ions métalliques. La concentration recommandée d’agents réducteurs tels que le bêta-mercaptoéthanol (BME) ou le dithiothréitol (DTT) est inférieure à 1 mM pour les résines à base de nickel et de cobalt mentionnées ci-dessus.

Les tampons pour la purification de hFEN1 sont des tampons Tris contenant du NaCl, du BME, du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), de l’EDTA et du glycérol. Le NaCl maintient la protéine sous forme soluble et perturbe les interactions moléculaires telles que la liaison à l’ADN. Le BME réduit les protéines oxydées et empêche ainsi l’agrégation des protéines. PMSF) est un inhibiteur de la protéase qui empêche la dégradation de la protéine cible par la protéase. L’EDTA élimine les cations divalents de l’échantillon, empêchant leur accès aux nucléases et aux protéases. Le glycérol améliore la stabilité de la protéine sous forme aqueuse. De plus, le tampon de lyse contient des comprimés complets d’inhibiteur de protéase pour assurer une protection maximale de la protéine cible contre la dégradation des protéases pendant la lyse cellulaire. Les tampons d’équilibrage et d’élution contiennent de l’imidazole, le tampon d’élution contenant des quantités plus élevées pour que l’imidazole déplace la protéine liée de la résine pendant l’élution.

Système de chromatographie de nouvelle génération (NGC)
Ce système automatisé de chromatographie à moyenne pression conçu pour la chromatographie liquide protéique à débit rapide (FPLC) utilise deux pompes pour pomper simultanément deux tampons différents et est capable d’injecter une large gamme de volumes d’échantillons allant de 250 μL à 100 ml. La boucle d’échantillonnage (appelée Dynaloop dans ce système), permet d’injecter des volumes d’échantillons plus importants. Le système peut être utilisé à l’aide du logiciel Chromlab, ce qui facilite la création de méthodes personnalisées, la manipulation des cycles de purification et l’analyse des pics UV et des fractions de protéines.