Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Inúmeras estratégias estão disponíveis para compreender a biologia celular. Uma abordagem envolve uma estratégia de cima para baixo, em que mutações genéticas são introduzidas em um gene, seguidas pela avaliação das mudanças fenotípicas resultantes em um organismo modelo. Por outro lado, uma abordagem reducionista envolve a elucidação inicial dos mecanismos moleculares e funções enzimáticas de uma determinada proteína, acompanhada pela caracterização de suas interações com outros componentes celulares. Posteriormente, avalia-se o impacto dessa proteína em uma via biológica. Embora cada abordagem de pesquisa possua suas vantagens e limitações inerentes, alcançar uma compreensão abrangente de uma via biológica requer investigações interdisciplinares.

Com o DNA sendo o projeto genético da vida, entender os mecanismos de duplicação de DNA e manutenção do genoma tem sido uma área de interesse ativo por mais de sete décadas. Estudos no campo da replicação do DNA produziram dados abundantes sobre as estruturas e funções individuais de numerosas proteínas de replicação. Essas investigações, que englobam aspectos mecanísticos e ensaios de atividade bioquímica, foram viabilizadas por meio da purificação dessas proteínas, possibilitando seu exame meticuloso em meio in vitro . Consequentemente, a purificação de proteínas surge como uma técnica indispensável e onipresente na maioria dos esforços de pesquisa voltados para desvendar insights mecanicistas sobre a replicação do DNA.

Este artigo apresenta uma metodologia para isolar uma proteína de replicação de DNA marcada com 6X-histidina, que foi superexpressa em células bacterianas. A proteína de interesse é a endonuclease 1 do retalho humano (FEN1), uma nuclease específica da estrutura que desempenha um papel fundamental na replicação da fita atrasada e também é um participante crítico nas vias de reparo do DNA, como o reparo por excisão de base (BER) ^{1 , 2 , 3} . A função primária do FEN1 é clivar a base de uma estrutura de retalho deslocada de 5′, um intermediário que surge durante a replicação do DNA ou BER. Inicialmente, investigações bioquímicas avaliando a atividade enzimática do FEN1 sugeriram um mecanismo de “rastreamento”, no qual a nuclease reconheceria a extremidade 5′-fosfato livre de uma estrutura de retalho e, em seguida, seguiria ao longo do retalho até sua base antes de clivá-lo⁴. Pesquisas subsequentes revelaram que o FEN1 opera por meio de um mecanismo de “rosqueamento”, no qual primeiro se liga à base do retalho e, em seguida, enfia a extremidade 5 ‘livre através de seu sítio ativo antes da clivagem (Figura 1)⁵. A capacidade de superexpressar e isolar o FEN1 recombinante facilitou esses avanços, permitindo que os pesquisadores o empregassem em investigações bioquímicas e estruturais.

A cromatografia de afinidade é um método de separação comumente usado para purificar o DNA. Esta técnica usa a afinidade de ligação reversível de proteínas-alvo em relação a ligantes imobilizados em uma resina para capturar especificamente a proteína de interesse. Uma das bioafinidades mais amplamente utilizadas é a interação robusta entre o aminoácido, histidina e íons metálicos, como níquel e cobalto e, portanto, pode ser capturada em uma resina carregada com Ni²⁺ ou Co²⁺.

A sequência de DNA que codifica uma sequência de 6-9 resíduos de histidina (His) é freqüentemente incorporada à construção do plasmídeo que codifica a proteína de interesse (no terminal N ou no terminal C), marcando a proteína com uma etiqueta 6X-His ou uma marca poli-His. A proteína marcada com His pode então ser facilmente purificada por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC), um subtipo de cromatografia de afinidade em que os íons metálicos na resina capturam proteínas com uma etiqueta de afinidade, que pode ser eluída posteriormente usando agentes de eluição apropriados. Íons de metais de transição, como Ni²⁺ e Co²⁺ , podem ser imobilizados em matrizes de agarose ou sílica gel derivadas de grupos N,N,N’-tris-(carboximetil)-etilenodiamina ou ácido nitrilotriacético (NTA)⁶.

Os ligantes metálicos são conhecidos por serem robustos contra a degradação por fatores físicos, químicos e biológicos e possuem essa vantagem sobre outros tipos de ligantes ^6,7. Além disso, a marca His é uma marca relativamente pequena e não afeta significativamente a estrutura ou função da proteína⁷. No entanto, em um sistema de expressão bacteriana, muitas proteínas expressas cromossomicamente têm afinidade por íons metálicos e podem co-purificar com a proteína alvo. Níquel e cobalto são os íons metálicos típicos usados em matrizes IMAC. A resina Ni-NTA e a resina à base de cobalto TALON são comumente usadas para a purificação de proteínas marcadas com His.

Ni-NTA versus TALON
Os respectivos íons metálicos de Ni-NTA e TALON são imobilizados na resina por meio de ligantes NTA. Acredita-se que o Ni-NTA tenha uma capacidade de ligação mais alta, ligando-se a até 100 mg / mL de proteína. Isso pode resultar em um maior rendimento de proteína, com a ressalva de que as proteínas contaminantes podem ser co-purificadas. Em contraste, a resina tem uma maior especificidade de ligação para proteínas marcadas com His e pode ser capaz de produzir frações de maior pureza. Neste estudo, pretendemos comparar a eficiência de purificação de ambas as resinas usando o sistema automatizado de cromatografia líquida de proteína rápida referenciado, o sistema NGC (ver Tabela de Materiais).

Buffers e compatibilidade
Os tampões são necessários durante a purificação da proteína para lise celular, preparação da amostra, equilíbrio da resina e eluição da proteína capturada da resina. Os tampões Tris, MOPS e HEPES até uma concentração de 100 mM são os tampões compatíveis conhecidos para a resina Ni-NTA. Os tampões geralmente incluem agentes redutores para evitar a oxidação de proteínas e agregação de proteínas. No entanto, acima de um limite, os agentes redutores podem retirar a resina de íons metálicos. A concentração recomendada de agentes redutores, como beta-mercaptoetanol (BME) ou ditiotreitol (DTT), é inferior a 1 mM para as resinas à base de níquel e cobalto acima mencionadas.

Os tampões para a purificação de hFEN1 são tampões Tris contendo NaCl, BME, fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), EDTA e glicerol. O NaCl mantém a proteína na forma solúvel e interrompe as interações moleculares, como a ligação ao DNA. O BME reduz as proteínas oxidadas e, assim, evita a agregação de proteínas. PMSF) é um inibidor de protease que previne a degradação mediada por protease da proteína-alvo. O EDTA elimina os cátions divalentes da amostra, impedindo seu acesso a nucleases e proteases. O glicerol aumenta a estabilidade da proteína na forma aquosa. Além disso, o tampão de lise contém comprimidos inibidores de protease completos para garantir a máxima proteção da proteína-alvo contra a degradação de proteases durante a lise celular. Os tampões de equilíbrio e eluição contêm imidazol, com o tampão de eluição contendo quantidades maiores para o imidazol deslocar a proteína ligada da resina durante a eluição.

Sistema de cromatografia de próxima geração (NGC)
Este sistema automatizado de cromatografia de média pressão projetado para cromatografia líquida de proteína de fluxo rápido (FPLC) usa duas bombas para bombear simultaneamente dois tampões diferentes e é capaz de injetar uma ampla gama de volumes de amostra de 250 μL a 100 mL. O loop de amostra (conhecido como Dynaloop neste sistema) possibilita injetar volumes de amostra maiores. O sistema pode ser operado usando o software Chromlab, que facilita a criação de métodos personalizados, a manipulação de execuções de purificação e a análise de picos de UV e frações de proteínas.