Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas

Existen numerosas estrategias para comprender la biología celular. Un enfoque implica una estrategia de arriba hacia abajo, en la que se introducen mutaciones genéticas en un gen, seguidas de la evaluación de los cambios fenotípicos resultantes en un organismo modelo. Por el contrario, un enfoque reduccionista implica la elucidación inicial de los mecanismos moleculares y las funciones enzimáticas de una proteína en particular, acompañada de la caracterización de sus interacciones con otros componentes celulares. Posteriormente, se evalúa el impacto de esta proteína en una vía biológica. Aunque cada enfoque de investigación posee sus ventajas y limitaciones inherentes, lograr una comprensión integral de una vía biológica requiere investigaciones interdisciplinarias.

Dado que el ADN es el modelo genético de la vida, la comprensión de los mecanismos de duplicación del ADN y el mantenimiento del genoma ha sido un área de interés activo durante más de siete décadas. Los estudios en el campo de la replicación del ADN han proporcionado abundantes datos sobre las estructuras y funciones individuales de numerosas proteínas de replicación. Estas investigaciones, que abarcan aspectos mecanicistas y ensayos de actividad bioquímica, se han hecho posibles gracias a la purificación de estas proteínas, lo que ha permitido su examen meticuloso en un entorno in vitro . En consecuencia, la purificación de proteínas emerge como una técnica indispensable y ubicua en la mayoría de los esfuerzos de investigación orientados a desentrañar los conocimientos mecanicistas sobre la replicación del ADN.

Este artículo presenta una metodología para aislar una proteína de replicación de ADN marcada con 6X-histidina, que ha sido sobreexpresada en células bacterianas. La proteína de interés es la endonucleasa 1 (FEN1) de colgajo humano, una nucleasa específica de la estructura que desempeña un papel fundamental en la replicación de la hebra rezagada y también es un participante crítico en las vías de reparación del ADN, como la reparación por escisión de bases (BER)^1,2,3. La función principal de FEN1 es escindirse en la base de una estructura de colgajo desplazada 5′, un intermediario que surge durante la replicación del ADN o BER. Inicialmente, las investigaciones bioquímicas que evaluaban la actividad enzimática de FEN1 sugirieron un mecanismo de “seguimiento”, en el que la nucleasa reconocería el extremo libre de 5′-fosfato de una estructura de colgajo y luego seguiría a lo largo de la aleta hasta su base antes de^escindirla. Investigaciones posteriores revelaron que FEN1 opera a través de un mecanismo de “enhebrado”, en el que primero se une a la base de la solapa y luego enhebra el extremo libre de 5′ a través de su sitio activo antes de la escisión (Figura 1)⁵. La capacidad de sobreexpresar y aislar FEN1 recombinante ha facilitado estos avances, lo que permite a los investigadores emplearlo en investigaciones bioquímicas y estructurales.

La cromatografía de afinidad es un método de separación comúnmente utilizado para purificar el ADN. Esta técnica utiliza la afinidad de unión reversible de las proteínas diana hacia los ligandos inmovilizados en una resina para atrapar específicamente la proteína de interés. Una de las bioafinidades más utilizadas es la interacción robusta entre el aminoácido, la histidina y los iones metálicos como el níquel y el cobalto y, por lo tanto, se puede capturar en una resina cargada con Ni²⁺ o Co²⁺.

La secuencia de ADN que codifica una cadena de residuos de histidina 6-9 (His) se incorpora con frecuencia a la construcción del plásmido que codifica la proteína de interés (ya sea en el extremo N o en el extremo C), marcando la proteína con una etiqueta 6X-His o una etiqueta poli-His. A continuación, la proteína marcada con His puede purificarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC), un subtipo de cromatografía de afinidad en el que los iones metálicos de la resina capturan proteínas con una etiqueta de afinidad, que posteriormente pueden eluirse utilizando agentes de elución adecuados. Los iones de metales de transición, como Ni²⁺ y Co²⁺ , pueden inmovilizarse en matrices de agarosa o gel de sílice derivadas de los grupos N, N, N’-tris-(carboximetil)-etilendiamina o ácido nitrilotriacético (NTA)⁶.

Se sabe que los ligandos metálicos son robustos frente a la degradación por factores físicos, químicos y biológicos y tienen esta ventaja sobre otros tipos de ligandos ^6,7. Además, la etiqueta His es una etiqueta relativamente pequeña y no afecta significativamente la estructura o función de la proteína⁷. Sin embargo, en un sistema de expresión bacteriana, muchas proteínas expresadas cromosómicamente tienen afinidad hacia los iones metálicos y pueden copurificarse con la proteína objetivo. El níquel y el cobalto son los iones metálicos típicos utilizados en las matrices IMAC. La resina de Ni-NTA y la resina a base de cobalto TALON se utilizan habitualmente para la purificación de proteínas marcadas con His.

Ni-NTA frente a TALON
Los respectivos iones metálicos de Ni-NTA y TALON se inmovilizan en la resina a través de ligandos NTA. Se cree que el Ni-NTA tiene una mayor capacidad de unión, uniéndose a hasta 100 mg/mL de proteína. Esto puede resultar en un mayor rendimiento de proteínas, con la advertencia de que las proteínas contaminantes pueden ser co-purificadas. Por el contrario, la resina tiene una mayor especificidad de unión hacia las proteínas marcadas con His y puede ser capaz de producir fracciones de mayor pureza. En este estudio, nuestro objetivo es comparar la eficiencia de purificación de ambas resinas utilizando el sistema automatizado de cromatografía líquida rápida de proteínas referenciado, el sistema NGC (ver la Tabla de Materiales).

Búferes y compatibilidad
Los tampones son necesarios durante la purificación de proteínas para la lisis celular, la preparación de muestras, el equilibrio de la resina y la elución de la proteína capturada de la resina. Los tampones Tris, MOPS y HEPES hasta una concentración de 100 mM son los tampones compatibles conocidos para la resina Ni-NTA. Los tampones a menudo incluyen agentes reductores para evitar la oxidación de las proteínas y la agregación de proteínas. Sin embargo, por encima de un límite umbral, los agentes reductores podrían despojar a la resina de iones metálicos. La concentración recomendada de agentes reductores como el beta-mercaptoetanol (BME) o el ditiotreitol (DTT) es inferior a 1 mM para las resinas a base de níquel y cobalto mencionadas anteriormente.

Los tampones para la purificación de hFEN1 son tampones Tris que contienen NaCl, BME, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), EDTA y glicerol. El NaCl mantiene la proteína en forma soluble e interrumpe las interacciones moleculares, como la unión al ADN. El BME reduce las proteínas oxidadas y, por lo tanto, evita la agregación de proteínas. PMSF) es un inhibidor de la proteasa que previene la degradación mediada por la proteasa de la proteína diana. El EDTA elimina los cationes divalentes de la muestra, impidiendo su acceso a nucleasas y proteasas. El glicerol mejora la estabilidad de la proteína en forma acuosa. Además, el tampón de lisis contiene comprimidos completos de inhibidores de la proteasa para garantizar la máxima protección de la proteína diana frente a la degradación de las proteasas durante la lisis celular. Los tampones de equilibrio y elución contienen imidazol, y el tampón de elución contiene cantidades más altas para que el imidazol desplace la proteína unida a la resina durante la elución.

Sistema de cromatografía de próxima generación (NGC)
Este sistema automatizado de cromatografía de presión media diseñado para la cromatografía líquida de proteínas de flujo rápido (FPLC) utiliza dos bombas para bombear simultáneamente dos tampones diferentes y es capaz de inyectar una amplia gama de volúmenes de muestra de 250 μL a 100 mL. El bucle de muestra (conocido como Dynaloop en este sistema), permite inyectar volúmenes de muestra más grandes. El sistema se puede operar utilizando el software Chromlab, que facilita la creación de métodos personalizados, la manipulación de las tiradas de purificación y el análisis de los picos UV y las fracciones de proteínas.