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Neuroscience

Quantificação da coluna dendrítica usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios

Published: September 27, 2024
, , ,
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health,National Institutes of Health, 2Colgate University

Summary

As espinhas dendríticas são compartimentos pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias. Alterações na morfologia da coluna dendrítica ocorrem durante o neurodesenvolvimento, envelhecimento, aprendizado e muitos distúrbios neurológicos e psiquiátricos, ressaltando a importância de uma análise confiável da coluna dendrítica. Este protocolo descreve a quantificação da morfologia da coluna dendrítica de forma precisa e reprodutível usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios.

Abstract

As conexões sinápticas permitem a troca e o processamento de informações entre os neurônios. O local pós-sináptico das sinapses excitatórias é freqüentemente formado nas espinhas dendríticas. As espinhas dendríticas são estruturas de grande interesse em pesquisas centradas em plasticidade sináptica, neurodesenvolvimento e distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Os espinhos dendríticos sofrem modificações estruturais durante sua vida útil, com propriedades como número total de espinhos, tamanho da coluna dendrítica e subtipo morfologicamente definido alterando em resposta a diferentes processos. Delinear os mecanismos moleculares que regulam essas alterações estruturais das espinhas dendríticas depende da medição morfológica. Isso exige uma análise precisa e reprodutível da coluna dendrítica para fornecer evidências experimentais. O presente estudo descreve um protocolo detalhado para quantificação e classificação da coluna dendrítica usando o Neurolucida 360 (software de reconstrução automática de neurônios tridimensionais). Este protocolo permite a determinação das principais propriedades dendríticas da coluna, como densidade total da coluna, volume da cabeça da coluna vertebral e classificação em subtipos da coluna, permitindo assim a análise eficaz dos fenótipos estruturais da coluna dendrítica.

Introduction

As espinhas dendríticas são saliências de dendritos, muitas vezes compreendendo o local pós-sináptico das sinapses glutamatérgicas 1,2. As espinhas dendríticas são de particular interesse no campo da plasticidade sináptica. As espinhas são frequentemente alteradas quando a força sináptica muda, tornando-se maiores e mais fortes na potenciação sináptica de longo prazo ou menores e mais fracas na depressão sináptica de longo prazo 3,4,5,6,7. Além da plasticidade sináptica, o perfil das espinhas dendríticas muda ao longo da vida. No desenvolvimento inicial, há um período de formação e crescimento da espinha dendrítica, seguido pela poda da espinha dendrítica até atingir um estado estacionário 8,9,10. No cérebro envelhecido, a perda da coluna acompanha o encolhimento do cérebro e o declínio cognitivo11. Além disso, muitos distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e psiquiátricos são caracterizados por espinhas dendríticas aberrantes. Várias regiões cerebrais em indivíduos afetados com esquizofrenia têm menos espinhas dendríticas, provavelmente resultantes de poda sináptica alterada12. Os transtornos do espectro do autismo também são caracterizados por patologias da coluna dendrítica13. A perda da coluna dendrítica é uma marca registrada da doença de Alzheimer e Parkinson14,15. Dada a ampla gama de tópicos de pesquisa que abrangem investigações sobre as propriedades da coluna dendrítica, as técnicas para quantificação precisa da coluna vertebral são de suma importância.

A coloração, ou seja, o método de Golgi, ou a marcação de neurônios por meio de preenchimento de corante ou expressão de proteínas fluorescentes são métodos comuns para visualização da coluna dendrítica 16,17,18. Uma vez visualizados, os espinhos podem ser analisados com uma variedade de clientes de software gratuitos e disponíveis comercialmente. A saída desejada da análise é um fator importante para determinar qual software será mais útil. Fiji é uma opção de software viável para questões centradas na densidade da coluna dendrítica. No entanto, essa técnica depende em grande parte da contagem manual demorada que pode introduzir o potencial de viés. Novos plug-ins, como o SpineJ, permitem a quantificação automática, além de permitir uma análise mais precisa do pescoço da colunavertebral 19. Uma desvantagem dessas abordagens é a perda de uma análise tridimensional para determinar o volume da coluna, já que o SpineJ é limitado a pilhas de imagens bidimensionais. Além disso, a obtenção de informações sobre o subtipo de coluna torna-se um desafio por meio desses processos. Os quatro subtipos predominantes da coluna, fino, cogumelo, atarracado e filopodia, todos conotam funções individuais e são amplamente classificados por morfologia20. Os espinhos finos são caracterizados por pescoço alongado e cabeça definida21. Os espinhos de cogumelo têm uma cabeça de espinha muito maior e pronunciada22. Os espinhos atarracados são curtos e têm pouca variação entre a cabeça e o pescoço23. Os filopódios são espinhos imaturos com pescoço longo e fino e sem cabeça obviamente observável24. Embora a classificação forneça informações valiosas, os espinhos existem em um continuum de dimensões. A classificação em categorias é baseada em intervalos de medidas morfológicas 25,26. Medir manualmente as espinhas para classificação aumenta a carga logística para os pesquisadores nessa abordagem.

Outras opções de software com foco específico na análise tridimensional da coluna dendrítica são mais adequadas para investigações sobre o volume da coluna e as propriedades do subtipo 27,28,29,30,31. Apesar da dificuldade apresentada pela análise tridimensional, como baixa resolução do plano z e esfregaço, essas opções de software permitem a reconstrução tridimensional confiável de dendritos e espinhas dendríticas de maneira semiautomatizada guiada pelo usuário. A classificação automática de espinhos identificados em seus subtipos também é um recurso presente em alguns desses pacotes de software de análise de coluna. Isso pode melhorar as preocupações com a carga de trabalho potencial e o viés experimental. O Neurolucida 360 é um software disponível comercialmente que permite a identificação e classificação tridimensional confiável e reprodutível da coluna dendrítica32. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para preparar efetivamente o tecido fixo, adquirir imagens e, finalmente, quantificar e classificar as espinhas dendríticas usando este software.

Protocol

Todos os procedimentos com animais seguiram as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA usando animais em pesquisa intramural e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Mental. 1. Preparação de fatias fixas do hipocampo Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina (cetamina: 100 mg / kg; Xilazina: 8 mg/kg). Valide a anestesia por meio d…

Representative Results

A utilização eficaz deste método de análise começa com a seleção de segmentos dendríticos para traçado. Conforme descrito na Figura 1, os dendritos ideais para rastreamento não estão próximos a outros dendritos. Dendritos executados em paralelo podem resultar na identificação inadequada de espinhos de um dendrito vizinho. Os dendritos que se cruzam diretamente ou correm perpendicularmente em um plano z diferente também adicionam dificuldade si…

Discussion

Este protocolo detalha as etapas específicas de preparação da amostra, imagem e o processo de quantificação e classificação da coluna dendrítica usando software de reconstrução tridimensional. Este software é uma ferramenta poderosa capaz de produzir dados estruturais robustos que contribuem para uma gama diversificada de investigações. Ao longo do processo, existem algumas etapas críticas que tornam esse protocolo menos oneroso metodológico e melhoram a produção geral d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin e ao NIMH SNIR pela assistência técnica. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Grupo de Estudos de Pesquisa Biomédica Bethesda da Colgate University. Este trabalho é apoiado pelo Programa Intramural do NIMH (1ZIAMH002881 a Z.L.).

Materials

518F Immersion Oil Zeiss 444960-0000-000
Cryostat Leica CM3050S For slice preparation
Fine Forceps FST 11150-10
Hemostat Forceps FST 13020-12
Large Surgical Scissors FST 14002-16
LSM 880 Confocal Microscope Zeiss LSM 880
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II Harvard Apparatus 70-2027 For perfusions
Neurolucida 360 MBF Bioscience v2022.1.1 Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer MBF Bioscience v2022.1.1 Spine Analysis Software
OCT Compound Sakura Finetek 4583 For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%) Fisherbrand F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC Zeiss 440762-9904-000
Scalpel Blade FST 10022-00
Small Surgical Scissors FST 14060-09
Spatula  FST 10091-12
Sucrose FIsherbrand S5-500
Superfrost Plus Microslides Diagger ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium Vector Laboratories H-1400-10
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References

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Keary III, K. M., Sojka, E., Gonzalez, M., Li, Z. Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software. J. Vis. Exp. (211), e66493, doi: (2024).
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