Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Dendritische Dornen sind Ausstülpungen von Dendriten, die häufig die postsynaptische Stelle der glutamatergen Synapsen bilden ^1,2. Dendritische Dornen sind im Bereich der synaptischen Plastizität von besonderem Interesse. Die Stacheln verändern sich oft, wenn sich die synaptische Stärke ändert, und werden größer und stärker bei langfristiger synaptischer Potenzierung oder kleiner und schwächer bei langfristiger synaptischer Depression 3,4,5,6,7. Über die synaptische Plastizität hinaus verändert sich das Profil der dendritischen Stacheln im Laufe des Lebens. In der frühen Entwicklung gibt es eine Periode der Bildung und des Wachstums der dendritischen Wirbelsäule, gefolgt von der Beschneidung der dendritischen Wirbelsäule bis zum Erreichen eines stabilen Zustands ^8,9,10. Im alternden Gehirn geht der Verlust der Wirbelsäule mit einer Schrumpfung des Gehirns und einem kognitiven Verfall einher¹¹. Darüber hinaus sind viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Erkrankungen durch aberrante dendritische Dornen gekennzeichnet. Mehrere Hirnregionen bei Personen, die von Schizophrenie betroffen sind, haben weniger dendritische Stacheln, was wahrscheinlich auf eine veränderte synaptische Beschneidung zurückzuführen^{ist 12}. Autismus-Spektrum-Störungen sind auch durch dendritische Wirbelsäulenpathologien gekennzeichnet¹³. Der Verlust der dendritischen Wirbelsäule ist ein Kennzeichen sowohl der Alzheimer- als auch der Parkinson-Krankheit^14,15. Angesichts des breiten Spektrums an Forschungsthemen, die Untersuchungen der Eigenschaften der dendritischen Wirbelsäule umfassen, sind Techniken zur genauen Quantifizierung der Wirbelsäule von größter Bedeutung.

Die Färbung, d.h. die Golgi-Methode, oder die Markierung von Neuronen durch Farbstofffüllung oder die Expression fluoreszierender Proteine sind gängige Methoden zur Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule 16,17,18. Einmal visualisiert, können Spines mit einer Vielzahl von kostenlosen und kommerziell erhältlichen Software-Clients analysiert werden. Das gewünschte Ergebnis der Analyse ist ein wichtiger Faktor, um zu bestimmen, welche Software am meisten genutzt werden kann. Fiji ist eine praktikable Softwareoption für Fragen, die sich auf die Dichte der dendritischen Wirbelsäule konzentrieren. Diese Technik beruht jedoch weitgehend auf zeitaufwändiger manueller Zählung, die das Potenzial für Verzerrungen einführen kann. Neue Plugins wie SpineJ ermöglichen eine automatische Quantifizierung und zusätzlich eine genauere Analyse des Wirbelsäulenhalses¹⁹. Ein Nachteil dieser Ansätze ist der Verlust einer dreidimensionalen Analyse zur Bestimmung des Spine-Volumens, da SpineJ auf zweidimensionale Bildstapel beschränkt ist. Darüber hinaus wird die Gewinnung von Informationen über den Spine-Subtyp durch diese Prozesse zu einer Herausforderung. Die vier vorherrschenden Stachelsubtypen dünn, pilzförmig, stumpf und filopodisch bezeichnen alle individuelle Funktionen und werden weitgehend über die Morphologie^{klassifiziert 20}. Dünne Stacheln zeichnen sich durch einen länglichen Hals und einen definierten Kopf^{aus 21}. Pilzstacheln haben einen viel größeren und ausgeprägten Wirbelsäulenkopf²². Die Stummelstacheln sind kurz und weisen eine geringe Varianz zwischen Kopf und Hals^{auf 23}. Filopodien sind unreife Stacheln mit einem langen, dünnen Hals und ohne offensichtlich beobachtbaren Kopf²⁴. Während die Klassifizierung wertvolle Informationen liefert, existieren Spines in einem Kontinuum von Dimensionen. Die Einteilung in Kategorien basiert auf morphologischen Messbereichen^25,26. Die manuelle Vermessung von Stacheln für die Klassifizierung erhöht den logistischen Aufwand für die Forscher bei diesem Ansatz.

Andere Softwareoptionen, die sich speziell auf die dreidimensionale Analyse der dendritischen Wirbelsäule konzentrieren, eignen sich besser für die Untersuchung des Wirbelsäulenvolumens und der Subtyp-Eigenschaften 27,28,29,30,31. Trotz der Schwierigkeiten, die die dreidimensionale Analyse mit sich bringt, wie z. B. schlechte z-Ebenen-Auflösung und Abstrich, ermöglichen diese Softwareoptionen eine zuverlässige dreidimensionale Rekonstruktion von Dendriten und dendritischen Dornen in einer benutzergeführten halbautomatischen Weise. Die automatische Klassifizierung der identifizierten Stacheln in ihre Subtypen ist ebenfalls eine Funktion, die in einigen dieser Softwarepakete zur Analyse der Wirbelsäule vorhanden ist. Dies kann Bedenken hinsichtlich einer möglichen Arbeitsbelastung und experimentellen Verzerrung ausräumen. Neurolucida 360 ist eine kommerziell erhältliche Software, die eine zuverlässige und reproduzierbare dreidimensionale dreidimensionale Identifizierung und Klassifizierung der dendritischen Wirbelsäule ermöglicht³². Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um fixiertes Gewebe effektiv zu präparieren, Bilder zu erfassen und schließlich dendritische Dornen mit dieser Software zu quantifizieren und zu klassifizieren.