כימות עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדיים
Summary
קוצים דנדריטיים הם תאים פוסט-סינפטיים של רוב הסינפסות המעוררות. שינויים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי מתרחשים במהלך התפתחות עצבית, הזדקנות, למידה והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות, המדגישים את החשיבות של ניתוח עמוד שדרה דנדריטי אמין. פרוטוקול זה מתאר כימות מדויק ושחזור של מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת-ממדיים.
Abstract
קשרים סינפטיים מאפשרים חילופי מידע ועיבודו בין נוירונים. האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות נוצר לעתים קרובות על קוצים דנדריטיים. עמוד השדרה הדנדריטי הוא מבנה בעל עניין רב במחקר המתמקד בפלסטיות סינפטית, התפתחות עצבית והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. עמוד השדרה הדנדריטי עובר שינויים מבניים במהלך חייו, כאשר תכונות כגון מספר עמוד השדרה הכולל, גודל עמוד השדרה הדנדריטי ותת-סוג מוגדר מורפולוגית משתנות בתגובה לתהליכים שונים. התוויית המנגנונים המולקולריים המווסתים שינויים מבניים אלה של עמוד השדרה הדנדריטי מסתמכת על מדידה מורפולוגית. זה מחייב ניתוח מדויק וניתן לשחזור של עמוד השדרה הדנדריטי כדי לספק ראיות ניסיוניות. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לכימות וסיווג עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות Neurolucida 360 (תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדי). פרוטוקול זה מאפשר לקבוע תכונות מפתח של עמוד השדרה הדנדריטי כגון צפיפות עמוד השדרה הכוללת, נפח ראש עמוד השדרה וסיווג לתת-סוגים של עמוד השדרה ובכך מאפשר ניתוח יעיל של פנוטיפים מבניים של עמוד השדרה הדנדריטי.
Introduction
קוצים דנדריטיים הם בליטות של דנדריטים המהווים לעתים קרובות את האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות גלוטמטרגיות 1,2. קוצים דנדריטיים הם בעלי עניין מיוחד בתחום הפלסטיות הסינפטית. עמוד השדרה משתנה לעתים קרובות כאשר הכוח הסינפטי משתנה, הופך גדול וחזק יותר בעוצמה סינפטית לטווח ארוך או קטן יותר וחלש יותר בדיכאון סינפטי לטווח ארוך 3,4,5,6,7. מעבר לפלסטיות הסינפטית, הפרופיל של עמוד השדרה הדנדריטי משתנה לאורך תוחלת החיים. בהתפתחות מוקדמת, יש תקופה של היווצרות וצמיחה של עמוד השדרה הדנדריטי, ואחריה גיזום עמוד השדרה הדנדריטי עד הגעה למצב יציב 8,9,10. במוח מזדקן, אובדן עמוד השדרה מלווה בהתכווצות המוח ובירידה קוגניטיבית11. בנוסף, הפרעות נוירולוגיות, נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות רבות מאופיינות בעמוד שדרה דנדריטי חריג. באזורים מרובים במוח אצל אנשים הסובלים מסכיזופרניה יש פחות עמוד שדרה דנדריטי, ככל הנראה כתוצאה משינוי בגיזום סינפטי12. הפרעות בספקטרום האוטיסטי מאופיינות גם בפאתולוגיות עמוד השדרה הדנדריטי13. אובדן עמוד השדרה הדנדריטי הוא סימן ההיכר של מחלת אלצהיימר ופרקינסון14,15. בהתחשב במגוון הרחב של נושאי המחקר הכוללים חקירות של תכונות עמוד השדרה הדנדריטי, טכניקות לכימות מדויק של עמוד השדרה הן בעלות חשיבות עליונה.
צביעה, כלומר שיטת גולג’י, או תיוג נוירונים באמצעות מילוי צבע או ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים הן שיטות נפוצות להדמיית עמוד השדרה הדנדריטי 16,17,18. לאחר הדמיה, ניתן לנתח קוצים עם מגוון לקוחות תוכנה חופשיים וזמינים מסחרית. התפוקה הרצויה של הניתוח היא גורם חשוב בקביעת איזו תוכנה תהיה בשימוש הרב ביותר. פיג’י היא אפשרות תוכנה מעשית לשאלות המתמקדות בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטי. עם זאת, טכניקה זו מסתמכת במידה רבה על ספירה ידנית גוזלת זמן שיכולה להציג את הפוטנציאל להטיה. תוספים חדשים כגון SpineJ מאפשרים כימות אוטומטי, ובנוסף מאפשרים ניתוח מדויק יותר של צוואר עמוד השדרה19. החיסרון של גישות אלה הוא אובדן ניתוח תלת מימדי לקביעת נפח עמוד השדרה, מכיוון ש- SpineJ מוגבל לערימות תמונות דו-ממדיות. בנוסף, השגת מידע על תת-סוג עמוד השדרה הופכת למאתגרת באמצעות תהליכים אלה. ארבעת תת-הסוגים הדומיננטיים של עמוד השדרה, דק, פטרייה, עקשן ופילופודיה, כולם מרמזים על פונקציות נפרדות ומסווגים במידה רבה באמצעות מורפולוגיה20. קוצים דקים מאופיינים בצוואר מוארך וראש מוגדר21. לקוצים פטריות יש ראש עמוד שדרה הרבה יותר גדול ובולט22. קוצים עקשניים קצרים ויש להם שונות מועטה בין הראש לצוואר23. פילופודיה הם קוצים לא בוגרים עם צוואר ארוך ודק וללא ראש שניתן להבחין בו בבירור24. בעוד שסיווג מספק מידע בעל ערך, קוצים קיימים על רצף של ממדים. הסיווג לקטגוריות מבוסס על טווחי מדידות מורפולוגיות25,26. מדידה ידנית של קוצים לצורך סיווג מגבירה את הנטל הלוגיסטי על החוקרים בגישה זו.
אפשרויות תוכנה אחרות המתמקדות באופן ספציפי בניתוח תלת מימדי של עמוד השדרה הדנדריטי מתאימות יותר לחקירות של נפח עמוד השדרה ותכונות תת-סוג 27,28,29,30,31. למרות הקושי שמציג ניתוח תלת מימדי, כגון רזולוציה ירודה של מישור Z ומריחה, אפשרויות תוכנה אלה מאפשרות שחזור תלת מימדי אמין של דנדריטים ועמוד שדרה דנדריטי באופן חצי אוטומטי מונחה משתמש. סיווג אוטומטי של קוצים מזוהים לתתי הסוגים שלהם הוא גם תכונה הקיימת בחלק מחבילות התוכנה לניתוח עמוד השדרה הללו. זה יכול להקל על חששות של עומס עבודה פוטנציאלי והטיה ניסיונית. Neurolucida 360 היא תוכנה מסחרית אחת המאפשרת זיהוי וסיווג עמוד שדרה דנדריטי תלת מימדי אמין וניתן לשחזור32. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף כדי להכין ביעילות רקמות קבועות, לרכוש תמונות, ובסופו של דבר לכמת ולסווג עמוד שדרה דנדריטי באמצעות תוכנה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את השלבים הספציפיים של הכנת הדגימה, הדמיה ותהליך הכימות והסיווג של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנת שחזור תלת מימדית. תוכנה זו היא כלי רב עוצמה המסוגל לייצר נתונים מבניים חזקים התורמים למגוון רחב של חקירות. לאורך התהליך, ישנם כמה שלבים קריטיים שהופכים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרולין סמית, שרה ויליאמס אברם, טד אוסדין וה-NIMH SNIR על הסיוע הטכני. בנוסף, ברצוננו להכיר בקבוצת המחקר הביו-רפואי של אוניברסיטת קולגייט בת’סדה. עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית NIMH Intramural (1ZIAMH002881 עד Z.L).
Materials
| 518F Immersion Oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | For slice preparation |
| Fine Forceps | FST | 11150-10 | |
| Hemostat Forceps | FST | 13020-12 | |
| Large Surgical Scissors | FST | 14002-16 | |
| LSM 880 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-035 | |
| Mini-Peristaltic Pump II | Harvard Apparatus | 70-2027 | For perfusions |
| Neurolucida 360 | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Spine Analysis Software |
| Neurolucida Explorer | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Spine Analysis Software |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | For cryostat sectioning |
| Paraformaldehyde (37%) | Fisherbrand | F79-1 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Scalpel Blade | FST | 10022-00 | |
| Small Surgical Scissors | FST | 14060-09 | |
| Spatula | FST | 10091-12 | |
| Sucrose | FIsherbrand | S5-500 | |
| Superfrost Plus Microslides | Diagger | ES4951+ | |
| Vectashield HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 |
References
- Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
- Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
- Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
- Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
- Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
- Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
- Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390 (2010).
- Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
- Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
- Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28 (2014).
- Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
- Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
- Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer’s disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
- Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson’s disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
- Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30 (2014).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
- Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
- Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700 (2018).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
- Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31 (2020).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997 (2008).
- Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38 (2011).
- Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545 (2018).
- Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561 (2023).
- Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
- Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
- Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368 (2021).
- Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
- Megias, M., Emri, Z. s., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
- Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
- Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
- Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36 (2020).
- Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
- Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
