Alle tierexperimentellen Verfahren folgten den Richtlinien der US National Institutes of Health zur Verwendung von Tieren in der intramuralen Forschung und wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Vorbereitung von fixierten Hippocampus-Schnitten Betäubung von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (Ketamin: 100 mg/kg; Xylazin: 8 mg/kg). Validieren Sie die Anästhesie durch Schwanzklemme und befestigen Sie die Maus an der Perfusionsplatte. Entfernen Sie mit einer großen chirurgischen Schere die Haut und das Fell von der Brust, um den darunter liegenden Brustkorb leichter sichtbar zu machen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt unterhalb der Breite des Brustkorbs und vermeiden Sie dabei Leber und Zwerchfell. Ziehe mit einer feinen Pinzette den Processus xiphoid nach oben und schneide jede Seite des Brustkorbs durch. Klappen Sie den Brustkorb bis zum Halsbereich hoch und klemmen Sie ihn mit einer Hämostat-Pinzette fest. Führen Sie eine 21-G-Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens ein und beginnen Sie mit der Perfusion mit Raumtemperatur 1x PBS bei ca. 5 ml/min. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof. Perfundierte mit PBS, bis die Lösung, die den Vorhof verlässt, klar ist. Schalten Sie die Perfusionspumpe aus, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Schlauch gelangen. Legen Sie den Schlauch von PBS in eiskaltes 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Perfundieren Sie mit PFA mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min, bis das Tier vollständig versteift ist, ca. 25 mL.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PFA frisch ist (nicht älter als 1 Woche, wenn der Vorrat bei 4° C gelagert wird), um eine optimale Fixierung zu gewährleisten. Entfernen Sie die Haut mit einer kleinen chirurgischen Schere von der Schädeloberfläche. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen Schnitt in der Mitte des Schädels. Machen Sie seitliche Schnitte rostral zum Riechkolben und über dem Kleinhirn. Öffnen Sie den Schädel mit einer feinen Pinzette, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie mit einem Spatel das Gehirn vorsichtig aus den Riechkolben heraus und geben Sie über Nacht 4% PFA in PBS.HINWEIS: Für ein umfassenderes Protokoll der Perfusion von Nagetieren verweisen wir auf Gage et al.33. Kryoschützen Sie das fixierte Gehirn, indem Sie das 4%ige PFA 1 Tag lang durch 15% Saccharose in PBS ersetzen. Ersetzen Sie anschließend die 15% ige Saccharose durch 30% Saccharose in PBS-Lösung für 1 Tag, bis das Gehirn in die Lösung sinkt. Nehmen Sie das Gehirn aus der Saccharoselösung und geben Sie es in eine Petrischale mit PBS. Schneide das Kleinhirn und den Riechkolben mit einer Skalpellklinge ab. Geben Sie eine kleine Menge der Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) mit einem Durchmesser von 1-2 cm auf die Oberfläche des Probenhalters. Montieren Sie das Gehirn koronal an den Probenhalter mit der kaudalen Schnittfläche im OCT. Frieren Sie das Gehirn schnell ein, indem Sie den Probenhalter in pulverisiertes Trockeneis legen, bis es sichtbar gefroren ist, ca. 5-7 Minuten. Achten Sie darauf, dass der Schaufelwinkel des Kryostaten zwischen 0° und 5° eingestellt ist, um gleichmäßige Schnitte zu erzeugen. Passen Sie den Winkel der Walzplatte an, um eine optimale Scheibenabflachung zu erzielen. Spezifische Anweisungen finden Sie im Gerätehandbuch. Platzieren Sie den Probenhalter so in den Kryostaten, dass die ventrale Oberfläche des Gehirns der Klinge am nächsten ist. Schneiden Sie das Gehirn in 30 μm lange dorsale Hippocampus-Schnitte, wobei alle Scheiben rostral zum Hippocampus verworfen werden.HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann an jede gewünschte Gehirnregion angepasst werden. Die Schritte 1.9 bis 1.12 ändern sich je nach interessierter Region. Übertragen Sie dorsale Hippocampusschnitte auf PBS. Montieren Sie die Hippocampus-Schnitte vorsichtig mit einem Pinsel auf einen Objektträger. Entfernen Sie überschüssige Lösung mit Wattestäbchen oder zarten Tüchern. Tragen Sie 100 μl hartes Eindeckmedium auf den Objektträger auf, der alle Hirnschnitte bedeckt. Um Blasenbildung zu vermeiden, senken Sie das Deckglas langsam mit einer Pinzette auf das Eindeckmedium ab. Wenn sich Blasen bilden, klopfen Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf das Deckglas, damit sie entweichen können. Lassen Sie die Objektträger über Nacht aushärten, bevor Sie sie aufnehmen. 2. Hochauflösende konfokale Bildgebung Verwenden Sie Okulare mit geringer Vergrößerung, um fluoreszierende Zellen zu identifizieren. Wechseln Sie zu einem 63-fachen (NA = 1,4) oder höherem Objektiv und wenden Sie das richtige Immersionsmedium auf das Objektiv an.HINWEIS: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einem 63-fachen oder höheren Objektiv verwenden. Identifizieren Sie gut beschriftete dendritische Segmente mit begrenzter Überlappung für die Bildaufnahme. Stellen Sie die Laserleistung und -verstärkung so ein, dass die fluoreszierenden Dendriten nicht gesättigt sind. Darüber hinaus kann eine Verringerung der Scangeschwindigkeit zu einer besseren Bildauflösung führen. Erfassen Sie Z-Stapel, die die vollständigen dendritischen Segmente für zukünftige Analysen umfassen. Z-Stapel, die größer als 10 μm sind, sind aufgrund des zusätzlichen Potenzials für dendritische Überlappungen in der z-Ebene unerwünscht.HINWEIS: Verwenden Sie die kleinste verfügbare Z-Schritt-Größe (0,2-0,7 μm) und 1 Lochblende für eine luftige Einheit. Die kleinere Schrittweite führt zu mehr Bildern im Z-Stapel, wodurch die begrenzte Z-Auflösung vieler Mikroskope kompensiert wird. Optional: Falls verfügbar, verwenden Sie die jeweilige Dekonvolutionssoftware-Funktionalität des Mikroskops, um Bilder zu entfalten. Dies ermöglicht Bilder mit höherer Auflösung. 3. Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule Öffnen Sie Neurolucida 360 (v2022.1.1 oder höher). Öffnen Sie die Bilddatei in der Wirbelsäulenanalyse-Software (Datei > > Bild öffnen). Stellen Sie sicher, dass die Bilddatei im Hauptfenster und in der 3D-Umgebung sichtbar ist. Wenn das Fenster “3D-Umgebung” nicht angezeigt wird, klicken Sie mit der linken Maustaste auf “3D-Umgebung” in der oberen Symbolleiste des Hauptfensters auf der Registerkarte “Trace ” (Ergänzende Abbildung 1)HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann für alle dendritischen Bilder angepasst werden, nicht ausschließlich für Dendriten aus Mausgewebe. Stellen Sie sicher, dass das Bild auf der Registerkarte “Bildanzeige ändern” des Fensters “3D-Umgebung” im Feld “Bild anzeigen als” als 3D-Volumen angezeigt wird. Wählen Sie auf der Registerkarte Bild im Feld Einstellungen für den Bildstapel die Option Maximale Projektion im Dropdown-Menü Oberfläche anzeigen als aus. (Ergänzende Abbildung 2) Identifizieren Sie ein geeignetes dendritisches Segment für die Rückverfolgung.Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Werkzeug Drehpunkt verschieben in der oberen Symbolleiste des Fensters 3D-Umgebung . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den gewünschten Dendriten, um einen neuen Drehpunkt zu setzen. Dadurch wird die Ausrichtung geändert, um ein effektives Heranzoomen zu ermöglichen. Stellen Sie die ursprüngliche Ausrichtung wieder her, indem Sie mit der linken Maustaste auf das Symbol Ausrichtung zurücksetzen klicken. Nachdem Sie den Drehpunkt festgelegt haben, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Werkzeug Drehpunkt verschieben , um mit dem Nachzeichnen des Dendriten zu beginnen. (Ergänzende Abbildung 2).HINWEIS: Der ideale Dendrit ist ein Dendrit mit begrenzter Überlappung mit anderen Dendriten in einer der Koordinatenebenen, der sich nicht mit einem anderen Dendriten schneidet oder oberflächlich zu einem anderen darunter liegt. Dendriten in geringer Nähe zu anderen in der XY-Ebene sind ebenfalls vorzuziehen, um eine unangemessene Zuordnung benachbarter Stacheln zu dem verfolgten Dendriten zu verhindern. Es muss auch beachtet werden, dass Dendriten unterschiedlicher Dicke, Ordnung und Abstände vom Soma unterschiedliche dendritische Dornendichten aufweisen 34,35. Dies muss bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden. Dendriten sekundärer Ordnung mit einer Dicke von <1,5 μm sind ideale Kandidaten für die Verfolgung (Abbildung 1). Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Struktur des Fensters 3D-Umgebung . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Benutzergeführt, um den Ablaufverfolgungsmodus anzuzeigen, und auf Richtungskernel als Methode in den Ablaufverfolgungsoptionen für Benutzergeführt. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten, wenn ein kreisförmiger Kern erscheint, um die Verfolgung zu starten. Bewegen Sie den Cursor entlang des dendritischen Segments. Dadurch werden die Kernel automatisch gefüllt. Wenn die Kernel nicht automatisch gefüllt werden, siehe Schritt 3.51.Bewegen Sie den Cursor vorsichtig auf dem Dendriten hin und her, bis sich die Körner bevölkern. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die vorhandenen erkannten Kernel beizubehalten. Wenn Kernel nicht mehr bestückt werden, klicken Sie mit der linken Maustaste, wenn sich ein Kernel weiter unten im Dendriten befindet, um ihn manuell zu platzieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Ablaufverfolgung zu beenden. Stellen Sie sicher, dass der verfolgte Dendrit mindestens 7 μm lang ist (Ergänzende Abbildung 3). Überprüfen Sie die Genauigkeit der dendritischen Verfolgung anhand aller drei Richtungen der 3D-Umgebung, Nicken, Gieren und Rollen, indem Sie mit der linken Maustaste auf das Fenster “3D-Umgebung ” klicken und es ziehen. Identifizieren Sie Punkte, an denen sich die dendritische Spur außerhalb der entsprechenden Stelle auf dem Dendriten befindet. Es kann Fälle geben, in denen es von oben nach unten genau nachgezeichnet aussieht, aber in der Z-Dimension befinden sich die Punkte nicht auf dem Dendriten (Abbildung 2). Um falsch nachgezeichnete dendritische Segmente zu korrigieren, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten im Menü Baum . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten von Interesse, und klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf Punkte. Verschieben Sie falsch platzierte Punkte per Klick und Ziehen zurück auf das Dendritensegment. Löschen Sie überflüssige Punkte, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Punkt klicken und dann auf die Schaltfläche Löschen klicken. Ändern Sie die Größe der Punkte, wenn der Dendrit nicht ausreichend gefüllt ist. Um die Größe des Punktes zu ändern, klicken Sie mit der linken Maustaste auf einen Punkt, und passen Sie den Schieberegler für die Dicke an, um die Größe zu ändern (Ergänzende Abbildung 4).HINWEIS: Unzureichend gefüllte Dendriten können dazu führen, dass falsche Stacheln identifiziert werden, die Bestandteile des dendritischen Segments sind. Umgekehrt kann eine Überfüllung der Dendriten die wahren Stacheln verdecken. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.8 für mehrere Dendriten im Bild, bevor Sie mit der Identifizierung der Wirbelsäule in Schritt 3.10 fortfahren. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Wirbelsäule im Fenster 3D-Umgebung. Legen Sie die Erkennungseinstellungen für den äußeren Bereich, die minimale Höhe und die minimale Voxelanzahl fest. Je nach Vorbereitung kann es vorkommen, dass die voreingestellten Werte geändert werden müssen, wenn eine klare und spezifische Begründung für Änderungen vorliegt. Die voreingestellten Bedingungen sind: Äußerer Bereich: 2,5 μm, Minimale Höhe: 0,3 μm, Minimale Voxelzahl: 10 Voxel.HINWEIS: Unterschiedliche Präparate, wie z. B. Zellkulturen vs. akutes Gewebe, sowie unterschiedliche Entwicklungszeitpunkte erfordern unterschiedliche Kriterien, die aus der vorhandenen Literatur abgeleitet werden müssen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Ändern der Erkennungseinstellungen die Ergebnisse erheblich verändern kann. So kann z.B. eine höhere Mindesthöhe kurze Stacheln ausschließen. Die Nachweiseinstellungen müssen während des gesamten Verlaufs des Experiments konsistent bleiben. Stellen Sie die Detektorempfindlichkeit auf 70 % ein und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Alle erkennen. Dadurch werden die durch diese Detektorempfindlichkeit identifizierten Stacheln auf allen Dendriten bevölkert. Wenn die Auswahl von Stacheln auf Dendriten-spezifische Weise gewünscht wird, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Kontrollkästchen Bild klicken, um alle am nächsten Ast zu erkennen, und klicken Sie mit der linken Maustaste auf jeden Dendriten manuell mit unterschiedlichen Detektorempfindlichkeiten.HINWEIS: In diesem Stadium ist es normal, dass sich nicht alle dendritischen Stacheln besiedeln. Ebenso können Nicht-Stacheln falsch ausgefüllt werden. Die anfängliche Empfindlichkeit von 70 % ist ebenfalls flexibel. Dies kann sich je nach Zubereitung ändern. Untersuchen Sie die durch diese Detektorempfindlichkeit ausgewählten Stacheln, indem Sie auf den Dendriten klicken und ihn in alle drei Richtungen ziehen. Wenn die Mehrheit der erkannten Stacheln nicht vollständig gefüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.12.1 fort. Wenn die erkannten Stacheln überfüllt sind, fahren Sie mit Schritt 3.12.2 fort. Wenn die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt zu sein scheinen, fahren Sie mit Schritt 3.13 fort.Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit um 5 % bis 10 % und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste auf Alle erkennen . Dadurch werden alle zuvor erkannten Stacheln durch neue mit höherer Empfindlichkeit ersetzt. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt sind. Verringern Sie die Empfindlichkeit des Detektors um 5 % bis 10 % und klicken Sie erneut mit der linken Maustaste auf Alle erkennen . Dadurch werden alle zuvor erkannten Stacheln durch neue mit geringerer Empfindlichkeit ersetzt. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis die erkannten Stacheln ausreichend gefüllt sind. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Vorhandene Wirbelsäulen beibehalten auf der Registerkarte Wirbelsäule der 3D-Umgebung. Wenn die Option “Bild klicken, um alle im nächstgelegenen Zweig zu erkennen ” ausgewählt wurde, deaktivieren Sie die Option.HINWEIS: Durch Aktivieren von Vorhandene Stacheln beibehalten wird sichergestellt, dass neu identifizierte dendritische Stacheln manuell keine zuvor identifizierten Stacheln überschrieben werden. Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, bevor Sie fortfahren, um die vorherige Arbeit nicht zu überschreiben. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Drehpunkt verschieben und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendriten, der eine weitere Dornerkennung erfordert, um den Drehpunkt zu setzen.Deaktivieren Sie Drehpunkt verschieben. Identifizieren Sie eine ungefüllte dendritische Wirbelsäule. Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit um 10%-20% gegenüber der vorherigen Erkennung und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Wirbelsäule. Wenn die erkannte Wirbelsäule unter- oder überfüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.3 oder 3.14.4 fort. Wenn der Rücken nicht ausgefüllt wird, wird die Meldung Kein Rücken an der ausgewählten Position kann erkannt werden. Fahren Sie in diesem Fall mit Schritt 3.14.2 fort. Erhöhen Sie die Detektorempfindlichkeit schrittweise, möglicherweise über 100 %, bis die Wirbelsäule erkannt und ausreichend gefüllt wurde. Wenn die Wirbelsäule erkannt, aber unzureichend gefüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.3 fort. Wenn die Wirbelsäule überfüllt ist, fahren Sie mit Schritt 3.14.4 fort (Abbildung 3). Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den unterfüllten Buchrücken. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Entfernen. Deaktivieren Sie die Registerkarte Bearbeiten . Erhöhen Sie die Empfindlichkeit um 5%-10% und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Wirbelsäule. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn der Rücken noch unterfüllt ist. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den überfüllten Buchrücken. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Entfernen. Deaktivieren Sie die Registerkarte Bearbeiten . Verringern Sie die Empfindlichkeit um 5%-10% und klicken Sie auf die Wirbelsäule. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn der Rücken immer noch überfüllt ist. Wiederholen Sie die Schritte 3.14 bis 3.14.4, bis alle durch visuelle Identifizierung identifizierten Stacheln erkannt wurden. Überprüfen Sie den Dendriten auf Stacheln, die zu benachbarten Dendriten gehören, auf falsche Stacheln, die keinem echten Signal entsprechen, oder auf mögliche Dendritensegmente, die fälschlicherweise als Stachel bezeichnet wurden. Löschen Sie diese falschen Spines mit der Remove-Funktion . Untersuchen Sie die identifizierten Stacheln auf dem Dendriten. In einigen Fällen können mehrere Stacheln als ein Konglomeratstachel erscheinen. Wenn eine Wirbelsäule zwei zu umfassen scheint, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Bearbeiten . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Rücken und dann mit der linken Maustaste auf Auswahl ausblenden. Nachdem Sie einen Konglomeratrücken bestätigt haben, klicken Sie auf der Registerkarte Bearbeiten mit der linken Maustaste auf Auswahl anzeigen , und wählen Sie Teilen aus. Wenn sich mehr als zwei Stacheln in einem Konglomerat befinden, muss dieser Schritt möglicherweise wiederholt werden (Abbildung 4).HINWEIS: Wenn sich der Konglomeratwirbel nach Schritt 3.16 nicht spaltet, entfernen Sie den Rücken . Wählen Sie dann die intensivere Wirbelsäule des Konglomerats mit einer niedrigeren Empfindlichkeit. Sobald die intensivere Wirbelsäule gefüllt ist, erhöhen Sie die Empfindlichkeit, um die andere ungefüllte Wirbelsäule auszuwählen. Alternativ kann das Löschen des Konglomeratwirbels und das anschließende Erhöhen der Empfindlichkeit eine korrekte Aufteilung ermöglichen. Wenn alle visuell identifizierbaren Stacheln erkannt und entsprechend gefüllt wurden, klicken Sie auf der Registerkarte Spine mit der linken Maustaste auf Classify All , um die Stacheln in vier Untertypen zu klassifizieren: Thin, Mushroom, Stubby und Filopodia (Abbildung 5).HINWEIS: Die Parameter für die Klassifizierung von Wirbelsäulen können im Fenster “Einstellungen ” des Felds “Klassifizierung” auf der Registerkarte “Wirbelsäule ” geändert werden. Wie bei den Detektoreinstellungen wird eine klare Begründung für die Änderung der bestehenden Parameter dringend empfohlen. Die voreingestellten Werte sind: Kopf-zu-Hals-Verhältnis: 1,1, Längen-zu-Kopf-Verhältnis: 2,5, Pilzkopfgröße: 0,35 μm, Filopodium-Länge: 3 μm. Wählen Sie in der oberen Symbolleiste des Fensters “3D-Umgebung” die Option “Speichern und anzeigen” im Neurolucida Explorer aus. Neurolucida Explorer ist der Ort, an dem die Daten aus den Tracings gesammelt werden. Die Arbeit wird als .dat Datei gespeichert, die alle Zeichnungen und Buchrücken enthält. Klicken Sie im Explorer-Fenster auf der Registerkarte Ansicht mit der linken Maustaste auf Alle auswählen , um alle Dendriten und Stacheln hervorzuheben. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Analysieren in der oberen Symbolleiste. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Dropdown-Menü Struktur . Klicken Sie mit der linken Maustaste auf Analyse verzweigter Strukturen. Abhängig von den interessierenden Variablen kann eine beliebige der Analysen ausgewählt werden. Die beiden nützlichsten für Fragen, die sich auf die Wirbelsäulendichte und das durchschnittliche Stachelvolumen konzentrieren , sind Jeder Baum > Jeder Dendrite und Stacheln > Details zur Wirbelsäule. Wählen Sie OK aus, und die Daten werden in zwei separaten Fenstern angezeigt. Kopieren Sie die Daten zur weiteren Zusammenstellung und Analyse in eine Tabelle.HINWEIS: Der einzelne Baum wird durch Dendriten getrennt, das Spine-Volumen jedoch nicht. Mit der Sortierfunktion in der Tabelle können die Spine-Details nach Merkmalen gefiltert werden.