نموذج الفئران لفشل القلب الناجم عن فرط شحميات الدم مع الكسر القذفي المحفوظ
Summary
يقدم هذا البروتوكول نهجا مفصلا لتكرار نموذج الفئران لفشل القلب الناجم عن فرط شحميات الدم مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF). يجمع التصميم بين إدارة مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة 9-troponin T-heart المرتبط بالفيروس الغدي (AAV9-cTnT-LDLR) و poloxamer-407 (P-407).
Abstract
الفيزيولوجيا المرضية لفشل القلب مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF) المدفوع بالسمية الدهنية غير مفهومة بشكل كامل. نظرا للحاجة الملحة لنماذج حيوانية تحاكي بدقة HFpEF الأيضي للقلب ، تم تطوير نموذج الفئران الناجم عن فرط شحميات الدم من خلال الأنماط الظاهرية للهندسة العكسية التي شوهدت في مرضى HFpEF. يهدف هذا النموذج إلى التحقيق في HFpEF ، مع التركيز على التفاعل بين السمية الدهنية ومتلازمة التمثيل الغذائي. تم تحفيز فرط شحميات الدم في الفئران من النوع البري (WT) على خلفية سلالة 129J من خلال الحقن داخل الصفاق كل أسبوعين من poloxamer-407 (P-407) ، وهو بوليمر مشترك كتلة يمنع ليباز البروتين الدهني ، جنبا إلى جنب مع حقنة واحدة في الوريد من الفيروس المرتبط بالغدي 9-القلب تروبونين T- مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (AAV9-cTnT-LDLR). تم إجراء تقييمات مكثفة بين 4 و 8 أسابيع بعد العلاج ، بما في ذلك تخطيط صدى القلب ، وتسجيل ضغط الدم ، وتخطيط التحجم لكامل الجسم ، وقياس صدى القلب (ECG) عن بعد ، ومراقبة عجلة النشاط (AWM) ، والتحليلات الكيميائية الحيوية والنسيجية. أظهرت الفئران LDLR / P-407 سمات مميزة في أربعة أسابيع ، بما في ذلك الخلل الانبساطي ، والحفاظ على جزء القذف ، وزيادة سمك جدار البطين الأيسر. والجدير بالذكر أن ضغط الدم ووظائف الكلى ظلت ضمن النطاقات الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، كشف ECG و AWM عن كتل القلب وانخفاض النشاط ، على التوالي. تدهورت الوظيفة الانبساطية في ثمانية أسابيع ، مصحوبة بانخفاض كبير في معدلات التنفس. كشف مزيد من التحقيق في نموذج العلاج المزدوج عن ارتفاع التليف ونسب الرئة الرطبة / الجافة ونسب وزن القلب / وزن الجسم. أظهرت الفئران LDLR / P-407 زانثلازما ، استسقاء ، ونقص تروية القلب. ومن المثير للاهتمام أن الوفيات المفاجئة حدثت بين 6 و 12 أسبوعا بعد العلاج. يوفر نموذج الفئران HFpEF موردا تجريبيا قيما وواعدا لتوضيح تعقيدات متلازمة التمثيل الغذائي التي تساهم في الخلل الانبساطي في سياق HFpEF بوساطة السمية الدهنية.
Introduction
يشير قصور القلب مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF) إلى متلازمة قلبية أيضية مصحوبة بأمراض مصاحبة متعددة ويشكل أكثر من 50٪ من جميع حالات قصور القلب 1,2. علاوة على ذلك ، ارتفع تواتر HFpEF بشكل مطرد خلال العقد الماضي3. مع خيارات العلاج المحدودة ، يمثل HFpEF أهم ضرورة طبية غير ملباة في أمراض القلب والأوعية الدموية ، نظرا للفيزيولوجيا المرضية متعددة الأوجه4. وبالتالي ، توجد حاجة ملحة لتعزيز فهم الآليات الأساسية والفيزيولوجيا المرضية ل HFpEF لتطوير علاجات فعالة.
على الرغم من التطورات الكبيرة في السنوات الأخيرة ، لا تزال الفيزيولوجيا المرضية ل HFpEF المنسوبة إلى السمية الدهنية غير مفهومة بشكل كامل. ثبت أن المرضى الذين يعانون من HFpEF يظهرون تراكما ملحوظا لدهون عضلة القلب مقارنة بأولئك الذين يعانون من قصور القلب مع انخفاض الكسر القذفي (HFrEF) والضوابط الصحية5. أظهرت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من خزعات القلب انخفاضا في تنظيم جين ليباز البروتين الدهني (LPL) في مجموعة HFpEF مقارنة بالمرضى الأصحاء ومرضى HFrEF6. Poloxamer-407 (P-407) عبارة عن بوليمر مشترك يحفز فرط شحميات الدم عن طريق منع LPL وبالتالي زيادة الدهون الثلاثية في البلازما وكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL)7. أظهرت الدراسات السابقة ارتفاع تعبير مستقبلات LDL (LDLR) في قلوب الفئران HFpEF8.
بناء على هذه النتائج والاعتراف بالحاجة الملحة لنماذج حيوانية تحاكي بدقة HFpEF الاستقلابي للقلب ، تم تطوير نموذج الفئران الناجم عن فرط شحميات الدم وتقديمه. تم تصميم هذا النموذج لاستكشاف HFpEF ، مع التركيز بشكل صريح على تورط السمية الدهنية جنبا إلى جنب مع متلازمة التمثيل الغذائي. تم إنشاء هذا النموذج الناجم عن حصار فرط شحميات الدم / LPL وتعزيز تعبير LDLR القلبي ، في الفئران WT-129 على خلفية 129J من خلال الحقن داخل الصفاق (i.p) كل أسبوعين من P-407 جنبا إلى جنب مع حقنة وريدية واحدة (IV) من الفيروس المرتبط بالغدي 9-تروبونين القلب T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR) 9.
بين 4 و 8 أسابيع بعد العلاج ، تم إجراء مجموعة واسعة من التقييمات ، بما في ذلك تخطيط صدى القلب ، وتسجيلات ضغط الدم ، وتخطيط التحجم لكامل الجسم (WBP) ، والقياس عن بعد لتخطيط القلب الكهربائي المستمر (ECG) ، ومراقبة عجلة النشاط (AWM) ، بالإضافة إلى التحليلات الكيميائية الحيوية والنسيجية9. في أربعة أسابيع ، أظهرت الفئران LDLR / P407 أو “العلاج المزدوج” ميزات HFpEF مميزة ، بما في ذلك الخلل الانبساطي ، والكسر القذفي المحفوظ ، وزيادة سمك جدار البطين الأيسر9. بالإضافة إلى ذلك ، كشف القياس عن بعد ECG و AWM عن كتل القلب وانخفاض النشاط ، على التوالي. والجدير بالذكر أن ضغط الدم ووظائف الكلى ظلت طبيعية9. بحلول ثمانية أسابيع ، تدهورت الوظيفة الانبساطية ، وكشفت قياسات WBP النقاب عن انخفاض معدلات التنفس9.
كشف مزيد من الاستكشاف لنموذج العلاج المزدوج عن التليف ، وارتفاع نسب الرئة الرطبة / الجافة ، ونسب وزن القلب / وزن الجسم9. كشف التشريح عن الاستسقاء ونقص تروية القلب والزانثلازما. ومن المثير للاهتمام ، تم توثيق الوفيات المفاجئة بين 6 و 12 أسبوعا بعد العلاج9. يوفر نموذج HFpEF الذي يحركه فرط شحميات الدم في الفئران أداة تجريبية سريعة وقيمة وواعدة لكشف تعقيدات متلازمة التمثيل الغذائي التي تساهم في الخلل الانبساطي مع HFpEF بوساطة السمية الشحمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من الزيادة المطردة في انتشار HFpEF على مدى العقد الماضي ، لا يزال الفهم الملموس للفيزيولوجيا المرضية الأساسية بعيد المنال13. علاوة على ذلك ، اعتبارا من اليوم ، يوجد علاج محدود قائم على الأدلة13. من الضروري تحسين فهم الآليات المشاركة في HFpEF القلبي الأيضي. في السابق ، تم تقديم نموذج فأر فرط شحميات الدم الذي يحاكي HFpEF مع عدم وجود مرض الكلى المزمن (CKD) ولا ارتفاع ضغط الدم الناجم عن LDLR OE القلبي وحقن p4079.
كشفت النتائج أن الجمع بين LDLR OE القلبي وفرط شحميات الدم يؤدي إلى خلل وظيفي انبساطي ، وعدم انتظام ضربات القلب ، وتضخم البطين الأيسر (LV) ، وعدم تحمل التمارين الرياضية ، وتراكم الدهون في القلب ، والتليف في الفئران بعد أربعة أسابيع ، كما نشر سابقا9. كما لوحظت زيادة في امتصاص الكوليسترول الضار في القلوب والكبد والعضلات الهيكلية وانخفاض الدهون الثلاثية في قلوب وكبد هذه الفئران9. تكمن ميزة هذه الطريقة في سرعتها للتحقيق في مسارات متلازمة القلب والأوعية الدموية ، والتي ليست مفهومة جيدا مقارنة بنماذج الفئران HFpEF فرط شحميات الدم الأخرى ، مثل النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) الذي يتطلب ما يصل إلى 16 و 20 أسبوعا لتطوير14. يستغرق هذا النموذج أربعة أسابيع لتطوير ويحاكي التشوهات الأيضية لدى البشر. لذلك ، فإن استنساخ هذا النموذج أمر ضروري.
لا بد من ضمان الإعداد والإدارة الشاملين ل AAV9-cTnT-LDLR و P-407. تعتمد قابلية تكرار هذا النموذج بشكل كبير على الحسابات الدقيقة لتركيزات وجرعات P-407 و AAV9-cTnT- LDLR ، بالإضافة إلى قياسات الوزن. نفس القدر من الأهمية هي الاستعدادات الحل وتقنيات الحقن في الوريد وداخل الصفاق المناسبة. قد تؤدي الانحرافات في هذه التقنيات إلى تغييرات كبيرة ونتائج غير مرغوب فيها.
على الرغم من فعالية وكفاءة هذا النموذج ، توجد العديد من القيود. هناك حاجة إلى تدريب صارم لأداء الحقن في الوريد وداخل الصفاق. بالإضافة إلى ذلك ، هناك خطر محتمل من المراضة والوفيات المرتبطة بالحقن الوريدي والمتكرر داخل الصفاق. قد تنتج إصابات ذيل الفأر عند إجراء الحقن في الوريد ، في حين قد يحدث ثقب cecal مع الحقن داخل الصفاق ، مما يؤدي إلى التهاب الصفاق15. عادة ما تكون هذه الإصابات بسبب تقنيات غير صحيحة وقد تؤدي إلى فقدان الموضوعات التجريبية والعلاج. لذلك ، من الضروري إجراء تدريب مكثف قبل تنفيذ هذه الإجراءات. قيد آخر هو تركيز هذا النموذج على سلالة 129J. ينبع الأساس المنطقي وراء اختيار سلالة 129J من الدراسات الأولية التي أسفرت عن خلل وظيفي انبساطي أسرع ونتائج HFpEF في هذه السلالة مقارنة بالفئران C57BL / 6 التي درسناها في البداية في تحقيقات غير منشورة.
بغض النظر عن هذه القيود ، سيسمح هذا النموذج بإجراء تحقيقات أسرع في الآليات الأساسية التي ينطوي عليها HFpEF وخيارات العلاج الفعالة المحتملة. أدت الدراسات السابقة إلى تطوير نموذج فسيولوجي مرضي ل HFPEF الناجم عن القلب والأوعية الدموية HFpEF الناجم عن HFD و N[w]-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME) على مدى 5-15أسبوعا 13. ومع ذلك ، نظرا للزيادة المطردة في انتشار HFpEF ، هناك حاجة ملحة لمزيد من الفهم للفيزيولوجيا المرضية ل HFpEF القلبي وتطوير علاج فعال. هذا النموذج الفئران من القلب LDLR OE وفرط شحميات الدم الناجم عن p407 هو وسيلة سريعة ومجدية لتحفيز HFpEF القلبية الأيضية للمساعي البحثية المستقبلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر برنامج موارد العلاج الجيني Penncore و NHLBI (GTRP) لتمويل توليد الفيروس المرتبط ب Adeno المستخدم في هذا المشروع. تم تمويل هذا البحث من خلال منح من المعهد الوطني للصحة (NIH) (1R01HL140468) ومعهد ميامي لأبحاث القلب إلى LS. حصلت MW على جائزة ملحق التنوع من المعاهد الوطنية للصحة من 2020 – 2022 (R01HL140468- 03S1). يتم تمويل JH من قبل 1R01 HL13735 و 1R01 HL107110 و 5UM1 HL113460 و 1R01 HL134558 و 5R01 CA136387 (من المعاهد الوطنية للصحة) و W81XWH-19-PRMRPCTA (من وزارة الدفاع) ومؤسسات عائلة Starr و Lipson و Soffer.
Materials
| Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR) | U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP) | Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp). | |
| Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400 | (VisualSonics, Toronto, ON, Canada) | Vevo 2100 or 3100 | |
| Isoflurane | Akorn Animal Health, Inc. | NDC: 59399-106-01 | |
| LabChart software | ADInstruments | Pro version 8.1.5 | |
| Poloxamer 407 | Sigma-Aldrich | 16758 | |
| PV catheter | Millar Instrument | PVR 1035 | |
| Ultrasound analysis software | Vevo Lab | ||
| Wild-type (WT) mice on 129J background | Jackson Laboratory |
References
- Roger, V. L. Epidemiology of heart failure: A contemporary perspective. Circ Res. 128 (10), 1421-1434 (2021).
- Kosiborod, M. N., et al. Design and baseline characteristics of step-HFpEF program evaluating semaglutide in patients with obesity hfpef phenotype. JACC Heart Fail. 11 (8), 1000-1010 (2023).
- Borlaug, B. A. Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction. Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).
- Badrov, M. B., Mak, S., Floras, J. S. Cardiovascular autonomic disturbances in heart failure with preserved ejection fraction. Can J Cardiol. 37 (4), 609-620 (2021).
- Wu, C. K., et al. Myocardial adipose deposition and the development of heart failure with preserved ejection fraction. Eur J Heart Fail. 22 (3), 445-454 (2020).
- Hahn, V. S., et al. Myocardial gene expression signatures in human heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. 143 (2), 120-134 (2021).
- Korolenko, T. A., et al. Early-stage atherosclerosis in poloxamer 407-induced hyperlipidemic mice: Pathological features and changes in the lipid composition of serum lipoprotein fractions and subfractions. Lipids Health Dis. 15, 16 (2016).
- Patel, M., et al. Osteopontin and ldlr are upregulated in hearts of sudden cardiac death victims with heart failure with preserved ejection fraction and diabetes mellitus. Front Cardiovasc Med. 7, 610282 (2020).
- Williams, M., et al. Mouse model of heart failure with preserved ejection fraction driven by hyperlipidemia and enhanced cardiac low-density lipoprotein receptor expression. J Am Heart Assoc. 11 (17), e027216 (2022).
- Colly, A., Marquette, C., Courtial, E. J. Poloxamer/poly(ethylene glycol) self-healing hydrogel for high-precision freeform reversible embedding of suspended hydrogel. Langmuir. 37 (14), 4154-4162 (2021).
- Kanashiro-Takeuchi, R. M., et al. Efficacy of a growth hormone-releasing hormone agonist in a murine model of cardiometabolic heart failure with preserved ejection fraction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 324 (6), H739-H750 (2023).
- Dulce, R. A., et al. Synthetic growth hormone-releasing hormone agonist ameliorates the myocardial pathophysiology characteristic of heart failure with preserved ejection fraction. Cardiovasc Res. 118 (18), 3586-3601 (2023).
- Borlaug, B. A., et al. Obesity and heart failure with preserved ejection fraction: New insights and pathophysiological targets. Cardiovasc Res. 118 (18), 3434-3450 (2023).
- Noll, N. A., Lal, H., Merryman, W. D. Mouse models of heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Am J Pathol. 190 (8), 1596-1608 (2020).
- Guarnieri, M. Considering the risks and safety of intraperitoneal injections. Lab Anim (NY). 45 (4), 131 (2016).
