駆出率を維持した高脂血症誘発性心不全のマウスモデル

動物プロトコルは、マイアミ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所(NIH)のガイドライン(IACUCプロトコル23-103-AD03)に準拠しています。本研究では、129Jをバックグラウンドにした野生型(WT)マウスを市販の供給源から入手し( Table of Materials参照)、自社で飼育した。すべてのマウスは129Jの背景で同腹仔でした。実験には、オスマウスとメスマウスの両方が含まれていました。LDLR/P-407 HFpEFマウスは、AAV9-cTnT-LDLRを1週目に単回投与し、p407を隔週で4週間投与することで樹立されました。 1. AAV9-cTnT-LDLRの調製と投与 注:AAV9-cTNT-hLDLRプラスミド( 材料表を参照)は、完全なヒトLDLRタンパク質(2664bp)をコードしています(図1)。 AAV-LDLRウイルスベクター調製動物の数に基づいて、AAV9ストックバイアルを氷上で20分間解凍し、次にAAV粒子をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈して、100μLで1 x 1012 ベクターゲノム/マウスの濃度を取得します。 ウイルス溶液を1mLシリンジ上の28〜30Gの針に入れます。針に気泡が入り込まないように注意してください。 静脈内(i.v.)尾静脈注射の手順酸素を0.5 L / minまでオンにし、イソフルラン麻酔システムを4%〜5%に設定します。マウスを誘導チャンバーに ~2 分間置き、動物が反応しなくなるまで待ちます。 動物をマウステールイルミネーター拘束具(例:.、Braintree Scientific、Inc.(マサチューセッツ州ブレインツリー))に置き、動物を横に寝かせます。.イソフルラン麻酔を2%〜3%に使用してメンテナンスします。注:拘束装置による加熱は、マウスの尾静脈の拡張を引き起こし、したがって、注入を大幅に容易にします。 尾側静脈を特定します。ガーゼパッドを使用して消毒剤で注射領域を清掃します。 尻尾の端を持って伸ばし、静脈が見えるまで指でマウスの尻尾をマッサージします。針を低い角度(10〜15度の角度)で挿入し、希釈したAAV100μLを尾静脈に注入します(図2A)。 針を引き抜き、出血が止まるまですぐに指で圧力をかけます。マウスを元のケージに戻します。 2. P-407の調製と投与 P-407の準備P-407 薬剤( 材料表を参照)を DPBS で希釈し、ドラフト内で最終濃度 100 mg/mL まで溶液を調製します。溶液をローテーターで4°Cで一晩冷蔵して、P-40710の溶解を促進します。 隔週の腹腔内(i.p.)注射手順I.P.注射の初日に各マウスの体重を量ります。式1 g / kgを使用して、重量とプレフィルシリンジに従って各マウスの適切な用量を計算します。 ヒュームフードの下で、頭と体を下向きに傾けた状態でマウスを手動で拘束し、内臓を頭蓋の位置に戻します。この技術により、近傍の重要な構造物の穿刺を回避できます。 腹部の下腹部、正中線の外側にある左腹膜腔を特定します。消毒剤でサイトを清掃します。 45度以下の角度で、針を腹腔に挿入します(図2B)。シリンジを吸引して、適切に挿入されるようにします。 吸引時に血液または組織が存在する場合は、針を引き出し、シリンジが透明になるまで手順2.2.2〜2.2.4を繰り返します。.針を適切な鋭利物容器に廃棄し、マウスを元のケージに戻します。 3.心エコー検査の評価 準備イメージングの前日または数時間前に、マウスの胸部と上腹部に脱毛クリームを塗布します。2分後に濡れたガーゼでクリームを取り除きます。 0.8 L / minの流量で2.5%〜3.0%のイソフルランでマウスを麻酔し、1%〜1.5%のイソフルランで維持します。次に、マウスを仰臥位の適切なプラットフォームに固定し、前足を導電性ゲルで電極パッドに置き、鼻と口をノーズコーンで覆って、イソフルランによる継続的な麻酔を確保します。 胸骨傍長軸ビューマウスを仰向けにして、プラットフォームの右側を45度傾けます。 次に、トランスデューサープローブをレールシステムに斜めに位置合わせし、右上肢から左腹部まで時計回りに30〜40度傾けて、Bモード画像を取得して保存します。 超音波解析ソフトウェア( 材料の表を参照)を使用してBモード画像を解析し、駆出率を取得します(図3A)。 胸骨傍短軸ビューレールシステムのトランスデューサープローブを時計回りに90度回転させて、BモードとMモードの画像を取得して保存します。 アピカルビュープラットフォームの左上隅を下向きに右に傾けます。トランスデューサーを動物の右肩に向けます。 Bモードとカラードップラーモードで僧帽弁を視覚化します。パルス波(PW)ドップラーおよび組織ドップラー画像の取得と保存5. 超音波解析ソフトウェアを使用してPWドップラー画像と組織ドップラー画像を解析し、IVRT、E/E’、およびE / Aを取得します(図3B-E)。 4. 圧力-体積(PV)ループデータ記録 研究の終了時に血行動態分析を実施して、前述の手順11,12に従って、左心室(LV)の収縮期および拡張期機能を評価します。まず、マウスにイソフルラン(3-5%、誘導チャンバー)を誘導します。 麻酔作用が始まったら、動物を手術台に移し、イソフルラン(1〜3%、フェイスマスク)で麻酔を維持します。 首の上の皮膚に小さな切開を行い、気管内挿管(口から)を可能にします。 げっ歯類の人工呼吸器 (例: マイクロ ベント モデル 848、ハーバード装置) を使用して、酸素とイソフルランの混合物で動物を換気します (例: マイクロ ベント モデル 848、ハーバード装置) 容量を ~0.15-0.2 mL に設定し、呼吸数を 120-170 呼吸/分に設定します。 温度制御された手術台を使用して、手術中±1°C~37°Cから1°Cの体温を監視します。 左内頸静脈を露出させ、30Gの針でカニューレを挿入して、輸液サポート投与を行います。 正中腹側頸部の部位の皮膚を切り取り、頸動脈を露出させます。右頸動脈の遠位部分を閉塞した後、動脈に小さな切り込みを入れて、マイクロチップの圧力容量(PV)カテーテル( 材料の表を参照)を左心室に導入できるようにします(クローズドチェストアプローチ)。 定常状態および下大静脈閉塞中のPVループを記録します。 実験の最後に、承認されたAVMA法(例:イソフルランとそれに続く子宮頸部脱臼)を使用して、動物を(深い麻酔下で)人道的に安楽死させます。 LabChartソフトウェア( 材料の表を参照)を使用してPVデータを分析し、心エコー測定を使用して体積を校正します。