Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.
Abstract
CRAF הוא גורם משפיע עיקרי על RAS GTPases וממלא תפקיד קריטי בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS. בנוסף, CRAF הוא נקודה חמה למוטציות בקו הנבט, אשר הוכחו כגורמות לראסופתיה התפתחותית, תסמונת נונאן. כל הקינאזות של חיל האוויר המלכותי מכילות אתרי קישור מרובים תלויי זרחן עבור 14-3-3 חלבוני רגולציה. הקשירה הדיפרנציאלית של 14-3-3 לאתרים אלה ממלאת תפקיד חיוני ביצירת דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי בקרום הפלזמה בתנאי איתות ובשמירה על עיכוב עצמי של חיל האוויר המלכותי בתנאי שקט. הבנת האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות וכיצד ניתן לווסת אותן היא קריטית לזיהוי גישות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד חיל האוויר המלכותי. במאמר זה אני מתאר בדיקה מבוססת העברת אנרגיית תהודה ביולומינסנטית (BRET) למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. באופן ספציפי, בדיקה זו מודדת את האינטראקציות של CRAF שהתמזגו לתורם ננו לוציפראז ו-14-3-3 התמזגו למקבל תג Halo, כאשר האינטראקציה של RAF ו-14-3-3 גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל וליצירת אות RET. הפרוטוקול מראה עוד כי אות זה יכול להיות משובש על ידי מוטציות שהוכחו כמונעות קשירה של 14-3-3 לכל אחד מאתרי העגינה של חיל האוויר המלכותי בעל זיקה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר את הליכי הזריעה, ההדבקה והציפוי מחדש של התאים, יחד עם הוראות מפורטות לקריאת פליטות BRE, ביצוע ניתוח נתונים ואישור רמות ביטוי חלבונים. בנוסף, תוצאות בדיקה לדוגמה, יחד עם שלבי מיטוב ופתרון בעיות, מסופקים.
Introduction
קינאזות של חיל האוויר המלכותי (ARAF, BRAF ו-CRAF) הן המשפיעות הישירות של RAS GTPases והחברים היוזמים של מפל הקינאז RAF-MEK-ERK התומך בשגשוג/הישרדות. מחקרים אחרונים הראו כי ביטוי CRAF ממלא תפקיד מפתח בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS, כולל סרטן ריאות של תאים לא קטנים ואדנוקרצינומה של צינור הלבלב 1,2,3,4,5. יתר על כן, מוטציות CRAF נבט לגרום צורה חמורה במיוחד של RASopathy, תסמונת Noonan 6,7. הבנת ויסות CRAF היא קריטית לפיתוח גישות טיפוליות מוצלחות המכוונות לתפקודו בתאים.
ניתן לחלק את כל קינאזות חיל האוויר המלכותי לשני תחומים פונקציונליים, תחום C-terminal catalytic (CAT) ותחום N-terminal regulatory (REG), השולט בפעילותו (איור 1A)8. תחום REG כולל את תחום הקישור RAS (RBD), תחום עשיר בציסטאין (CRD) ואזור עשיר בסרין/תראונין (עשיר ב-S/T). יש לציין כי האזור העשיר ב-S/T מכיל את אתר N’, הנקשר ל-14-3-3 באופן תלוי זרחן (S259 ב-CRAF; איור 1A) 8. תחום CAT כולל את תחום הקינאז, יחד עם אתר עגינה נוסף בעל זיקה גבוהה 14-3-3, המכונה אתר C (S621 ב-CRAF; איור 1A) 8. הקישור הדיפרנציאלי של חלבונים דימריים 14-3-3 לאתרי N’ ו-C’, יחד עם CRD, ממלא תפקידים קריטיים הן בהפעלת חיל האוויר המלכותי והן בעיכוב 9,10,11,12,13. בתנאי איתות רגילים, הפעלת RAF מתחילה על ידי גיוסו לקרום הפלזמה על ידי RAS, מה שמאפשר לו ליצור דימרים פעילים, כאשר ההטרודימר BRAF-CRAF הוא הצורה הפעילה השלטת14,15. בדיקות ביוכימיות עם BRAF ו-CRAF, יחד עם מבנים של מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (Cryo-EM) של BRAF דימרי, מצביעים על כך שדימר 14-3-3 מייצב דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי על-ידי קשירה בו זמנית לאתר C של שני הפרוטומרים של חיל האוויר המלכותי (איור 1B)9,13,16,17. לעומת זאת, מחקרים הראו כי בתנאים שקטים, RAF מאמץ אישור ציטוסולי, מעוכב עצמי, שבו תחום REG נקשר לתחום CAT ומעכב את פעילותו 12,18,19,20. מצב סגור זה מיוצב על-ידי דימר 14-3-3 הקשור לאתר CRD ו-N’ בתחום REG ולאתר C בתחום CAT (איור 1B)10,13,21. ב- BRAF, מודל זה נתמך על ידי מבני Cryo-EM עדכניים של מונומרים BRAF מעוכבים עצמיים ועל ידי המחקרים הביוכימיים הקודמים שלנו 10,12,13,21,22. עם זאת, בעוד 14-3-3 הוכח כממלא תפקיד מעכב בתקנה23 של CRAF, מצב מעכב עצמי דמוי BRAF עשוי לשחק תפקיד קטן יותר בתקנה12 של CRAF; לכן נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם 14-3-3 חלבונים מווסתים את פעילות CRAF. הוויסות בתיווך 14-3-3 של קינאזות RAF דורש שפע של אירועי זרחן ודה-זרחן של חיל האוויר המלכותי, קשירה לחלבוני בקרה שונים ואינטראקציות עם קרום הפלזמה8. לכן, קריטי שאינטראקציות 14-3-3-RAF יימדדו בתנאים פיזיולוגיים רלוונטיים ובנוכחות דו-שכבה שומנית שלמה.
כדי לטפל בבעיה זו, נעשה שימוש בטכנולוגיית NanoBRET (מכאן ואילך המכונה N-BRET; ראו טבלת חומרים לפירוט הערכה) כדי לפתח בדיקה מבוססת קרבה למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים (איור 1C). מערכת מבוססת BRET זו מודדת את האינטראקציות של שני חלבונים בעלי עניין (POI), כאשר חלבון אחד מתויג עם תורם ננולוציפראז (ננו) והשני עם תג Halo, לצורך תיוג עם ליגנד מקבל האנרגיה Halo61822,24. אינטראקציה בין החלבונים המעניינים גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל, שבתורה מייצרת את אות ה-BRET (איור 1C). חלבון תורם ננו בהיר במיוחד (פליטה (em) 460 ננומטר) וליגנד Halo618 (em 618 ננומטר) מספקים הפרדה ספקטרלית ורגישות רבה יותר מאשר BTRE קונבנציונאלי, מה שהופך אותו לפלטפורמה אידיאלית לחקר אינטראקציות חלשות יותר וזיהוי שינויים עדינים בקשירה24. ואכן, פיתחנו בעבר בדיקה מבוססת N-BRET למדידת אינטראקציות אוטואינהיביטוריות של תחומי RAF REG ו- CAT, שהייתה חיונית לאפיון פאנל של מוטציות RASopathy ב- BRAF CRD והדגמנו את החשיבות הקריטית של תחום זה לשמירה על עיכוב עצמי ומניעת הפעלה מכוננת של BRAF12.
הבדיקה המתוארת כאן מודדת את האינטראקציות של CRAF, המאוחה לתג ננו N-terminal (Nano-CRAF), ואת איזופורם הזטה של 14-3-3 המאוחה לתג Halo מסוף C (14-3-3ζ-Halo; איור 1C). אנו מראים כי האינטראקציות של ננו-CRAF עם 14-3-3ζ-Halo מייצרות אות BRET חזק, אשר בתורו יכול להיות משובש על ידי מוטציות המונעות קישור 14-3-3 לאתר N’ (S259A) ו / או לאתר C (S621A). הפרוטוקול הבא מספק שלבים מפורטים לביצוע, מיטוב ופתרון בעיות בבדיקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים הראו כי 14-3-3 חלבונים ממלאים תפקידים קריטיים הן בהפעלה והן בעיכוב של קינאזות RAF. הבנת האופן שבו אירועים קושרים אלה מוסדרים וההשפעות של אפנון אינטראקציות אלה על איתות RAF ואונקוגנזה מונעת על ידי חיל האוויר המלכותי עשויה לחשוף פגיעויות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד CRAF. עם זאת, מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן בחלקו במימון פדרלי מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת מספר הפרויקט ZIA BC 010329.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
References
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
- Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
- Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
- Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
- Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
- Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
- Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
- Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
- Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
- Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
- Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
- Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
- Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
- Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
- Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
- Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
- Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
- Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
- Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
- Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
- Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
- Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
- Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).
