Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках

RAF-киназы (ARAF, BRAF и CRAF) являются прямыми эффекторами ГТФаз RAS и инициирующими членами каскада киназ RAF-MEK-ERK, способствующего пролиферации/выживанию. Недавние исследования показали, что экспрессия CRAF играет ключевую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS, включая немелкоклеточный рак легкого и протоковую аденокарциному поджелудочной железы 1,2,3,4,5. Кроме того, мутации зародышевой линии CRAF вызывают особенно тяжелую форму РАСопатии – синдром^{Нунан 6,7}. Понимание регуляции CRAF имеет решающее значение для разработки успешных терапевтических подходов, направленных на его функцию в клетках.

Все RAF-киназы можно разделить на два функциональных домена: С-концевой каталитический (CAT) домен и N-концевой регуляторный домен (REG), который контролирует его активность (рис. 1A^). Домен REG включает в себя RAS связывающий домен (RBD), цистеин-богатый домен (CRD) и серин/треонин-богатую область (S/T-rich). Примечательно, что S/T-богатая область содержит N’-сайт, который связывается с 14-3-3 фосфорилированием-зависимым образом (S259 в CRAF; Рисунок 1А) ⁸. Домен CAT включает в себя домен киназы вместе со вторым высокоаффинным сайтом стыковки 14-3-3, называемым сайтом C’ (S621 в CRAF; Рисунок 1А) ⁸. Дифференциальное связывание димерных белков 14-3-3 с сайтами N’ и C’, наряду с CRD, играет решающую роль как в активации, так и в ингибировании RAF 9,10,11,12,13. В нормальных сигнальных условиях активация RAF инициируется его привлечением к плазматической мембране RAS, что позволяет ему образовывать активные димеры, из которых гетеродимер BRAF-CRAF является преобладающей активной формой ^14,15. Биохимические анализы с использованием BRAF и CRAF, наряду с криогенной электронной микроскопией (Cryo-EM) структур димерных BRAF, показывают, что димер 14-3-3 стабилизирует активные димеры RAF, связываясь одновременно с C’-сайтом обоих протомеров RAF (рис. 1B)9,13,16,17. И наоборот, исследования показали, что в условиях покоя RAF принимает цитозольное, аутоингибированное подтверждение, когда домен REG связывается с доменом CAT и ингибирует его активность 12,18,19,20. Это закрытое состояние стабилизируется димером 14-3-3, связанным с CRD и N’ сайтом в домене REG и с сайтом C’ в домене CAT (рис. 1B)10,13,21. В BRAF эта модель подтверждается недавними крио-ЭМ структурами аутоингибированных мономеров BRAF и нашими предыдущими биохимическими исследованиями 10,12,13,21,22. Однако, в то время как показано, что 14-3-3 играет ингибирующую роль в регуляции²³ CRAF, аутоингибированное состояние, подобное BRAF, может играть меньшую роль в регуляции¹² CRAF; поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения механизмов, с помощью которых белки 14-3-3 регулируют активность CRAF. 14-3-3-опосредованная регуляция RAF-киназ требует множества событий фосфорилирования и дефосфорилирования RAF, связывания с различными регуляторными белками и взаимодействия с плазматической мембраной^. Поэтому крайне важно, чтобы взаимодействия 14-3-3-RAF измерялись в физиологически значимых условиях и в присутствии интактного липидного бислоя.

Для решения этой проблемы была использована технология NanoBRET (далее именуемая N-BRET; подробную информацию о наборе см. в Таблице материалов) для разработки анализа на основе близости для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках (рис. 1C). Эта система на основе БРЭТ измеряет взаимодействия двух представляющих интерес белков (POI), где один белок помечен донором нанолюциферазы (Nano), а другой — меткой Halo, для мечения лигандом^22,24 акцептора энергии Halo618. Взаимодействие представляющих интерес белков приводит к передаче энергии от донора к акцептору, который, в свою очередь, генерирует сигнал BRET (рис. 1C). Чрезвычайно яркий донорский белок Nano (излучение (em) 460 нм) и лиганд Halo618 (em 618 нм) обеспечивают большее спектральное разделение и чувствительность по сравнению с обычным BRET, что делает его идеальной платформой для изучения более слабых взаимодействий и обнаружения тонких изменений в связывании²⁴. Действительно, ранее мы разработали анализ на основе N-BRET для измерения аутоингибиторных взаимодействий доменов RAF REG и CAT, что было важно для характеристики панели мутаций RASopathy в BRAF CRD и продемонстрировало критическую важность этого домена для поддержания аутоингибирования и предотвращения конститутивной активации BRAF¹².

Описанный здесь анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитого с N-концевой Nano-меткой (Nano-CRAF), и дзета-изоформы 14-3-3, слитой с C-концевой Halo меткой (14-3-3ζ-Halo; Рисунок 1С). Мы показываем, что взаимодействие Nano-CRAF с 14-3-3ζ-Halo генерирует устойчивый сигнал BRET, который, в свою очередь, может быть нарушен мутациями, препятствующими связыванию 14-3-3 с сайтом N’ (S259A) и/или сайтом C’ (S621A). В следующем протоколе подробно описаны инструкции по выполнению, оптимизации и устранению неполадок этого анализа.