Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

Las quinasas RAF (ARAF, BRAF y CRAF) son los efectores directos de las GTPasas RAS y los miembros iniciadores de la cascada de quinasas RAF-MEK-ERK pro-proliferativa/pro-supervivencia. Estudios recientes han demostrado que la expresión de CRAF desempeña un papel clave en la tumorigénesis de varios cánceres impulsados por KRAS, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el adenocarcinoma ductal de páncreas 1,2,3,4,5. Además, las mutaciones de la línea germinal en CRAF causan una forma particularmente grave de la RASopatía (síndrome de Noonan) ^6,7. Comprender la regulación del CRAF es fundamental para desarrollar enfoques terapéuticos exitosos que se dirijan a su función en las células.

Todas las quinasas RAF se pueden dividir en dos dominios funcionales, un dominio catalítico C-terminal (CAT) y un dominio regulador N-terminal (REG), que controla su actividad (Figura 1A)⁸. El dominio REG abarca el dominio de unión RAS (RBD), el dominio rico en cisteína (CRD) y una región rica en serina/treonina (rica en S/T). En particular, la región rica en S/T contiene el sitio N’, que se une a 14-3-3 de una manera dependiente de la fosforilación (S259 en CRAF; Figura 1A) ⁸. El dominio CAT abarca el dominio quinasa, junto con un segundo sitio de acoplamiento 14-3-3 de alta afinidad, denominado sitio C’ (S621 en CRAF; Figura 1A) ⁸. La unión diferencial de las proteínas diméricas 14-3-3 a los sitios N’ y C’, junto con la CRD, desempeña un papel crítico tanto en la activación como en la inhibición de RAF 9,10,11,12,13. En condiciones normales de señalización, la activación de RAF se inicia mediante su reclutamiento a la membrana plasmática por RAS, lo que le permite formar dímeros activos, de los cuales el heterodímero BRAF-CRAF es la forma activa predominante^14,15. Los ensayos bioquímicos con BRAF y CRAF, junto con estructuras de microscopía electrónica criogénica (Cryo-EM) de BRAF dimérico, indican que un dímero 14-3-3 estabiliza los dímeros activos de RAF al unirse simultáneamente al sitio C’ de ambos protómeros de RAF (Figura 1B)9,13,16,17. Por el contrario, los estudios han demostrado que, en condiciones de reposo, la RAF adopta una confirmación citosólica autoinhibida, donde el dominio REG se une al dominio CAT e inhibe su actividad 12,18,19,20. Este estado cerrado se estabiliza mediante un dímero 14-3-3 unido al sitio CRD y N’ en el dominio REG y al sitio C’ en el dominio CAT (Figura 1B)10,13,21. En BRAF, este modelo está respaldado por estructuras Cryo-EM recientes de monómeros BRAF autoinhibidos y por nuestros estudios bioquímicos previos 10,12,13,21,22. Sin embargo, mientras que se ha demostrado que el 14-3-3 desempeña un papel inhibidor en la regulación²³ del CRAF, un estado autoinhibido similar al BRAF puede desempeñar un papel menor en la regulación¹² del CRAF; por lo tanto, se requieren más estudios para aclarar los mecanismos por los cuales las proteínas 14-3-3 regulan la actividad de CRAF. La regulación mediada por 14-3-3 de las quinasas RAF requiere una gran cantidad de eventos de fosforilación y desfosforilación de RAF, la unión a varias proteínas reguladoras e interacciones con la membrana plasmática⁸. Por lo tanto, es fundamental que las interacciones de 14-3-3-RAF se midan en condiciones fisiológicamente relevantes y en presencia de una bicapa lipídica intacta.

Para abordar este problema, se utilizó la tecnología NanoBRET (en adelante denominada N-BRET; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles del kit) para desarrollar un ensayo basado en la proximidad para medir las interacciones de CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas (Figura 1C). Este sistema basado en BRET mide las interacciones de dos proteínas de interés (POI), donde una proteína se marca con un donante de nanoluciferasa (Nano) y la otra con una etiqueta Halo, para su marcaje con el ligando aceptor de energía Halo618^22,24. La interacción de las proteínas de interés da como resultado la transferencia de energía del donante al aceptor, que a su vez genera la señal BRET (Figura 1C). La proteína donante Nano extremadamente brillante (emisión (em) 460 nm) y el ligando Halo618 (em 618 nm) proporcionan una mayor separación espectral y sensibilidad que el BRET convencional, lo que lo convierte en una plataforma ideal para estudiar interacciones más débiles y detectar cambios sutiles en la unión²⁴. De hecho, previamente desarrollamos un ensayo basado en N-BRET para medir las interacciones autoinhibitorias de los dominios RAF REG y CAT, que fue esencial para la caracterización de un panel de mutaciones de RASopathy en el BRAF CRD y demostró la importancia crítica de este dominio para mantener la autoinhibición y prevenir la activación constitutiva de BRAF¹².

El ensayo descrito aquí mide las interacciones de CRAF, fusionado con una etiqueta Nano N-terminal (Nano-CRAF), y la isoforma zeta de 14-3-3 fusionada con la etiqueta Halo C-terminal (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Demostramos que las interacciones de Nano-CRAF con 14-3-3ζ-Halo generan una señal BRET robusta, que a su vez puede ser interrumpida por mutaciones que impiden la unión de 14-3-3 al sitio N’ (S259A) y/o al sitio C’ (S621A). El siguiente protocolo proporciona pasos detallados para realizar, optimizar y solucionar problemas de este ensayo.