Summary

Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

Abstract

CRAF est un effecteur primaire des GTPases RAS et joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS. De plus, CRAF est un point chaud pour les mutations germinales, qui causent la RASopathie développementale, le syndrome de Noonan. Toutes les kinases RAF contiennent de multiples sites de liaison dépendants de la phosphorylation pour les protéines régulatrices 14-3-3. La liaison différentielle de 14-3-3 à ces sites joue un rôle essentiel dans la formation de dimères RAF actifs au niveau de la membrane plasmique dans des conditions de signalisation et dans le maintien de l’auto-inhibition de RAF dans des conditions de repos. Comprendre comment ces interactions sont régulées et comment elles peuvent être modulées est essentiel pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent la fonction RAF. Ici, je décris un test basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Plus précisément, ce test mesure les interactions de CRAF fusionné à un donneur de nano luciférase et de 14-3-3 fusionné à un accepteur de marqueurs Halo, où l’interaction de RAF et 14-3-3 entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur et la génération du signal BRET. Le protocole montre en outre que ce signal peut être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 à chacun de ses sites d’amarrage RAF de haute affinité. Ce protocole décrit les procédures d’ensemencement, de transfection et de replacage des cellules, ainsi que des instructions détaillées pour lire les émissions BRET, effectuer l’analyse des données et confirmer les niveaux d’expression des protéines. De plus, des exemples de résultats d’analyse, ainsi que des étapes d’optimisation et de dépannage, sont fournis.

Introduction

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RASopathie, le syndrome de Noonan 6,7. La compréhension de la régulation de la CRAF est essentielle pour développer des approches thérapeutiques efficaces qui ciblent sa fonction dans les cellules.

Toutes les kinases RAF peuvent être divisées en deux domaines fonctionnels, un domaine catalytique C-terminal (CAT) et un domaine régulateur N-terminal (REG), qui contrôle son activité (Figure 1A)8. Le domaine REG englobe le domaine de liaison RAS (RBD), le domaine riche en cystéine (CRD) et une région riche en sérine/thréonine (riche en S/T). Notamment, la région riche en S/T contient le site N’, qui se lie à 14-3-3 de manière dépendante de la phosphorylation (S259 dans CRAF ; Graphique 1A) 8. Le domaine CAT englobe le domaine kinase, ainsi qu’un deuxième site d’amarrage 14-3-3 de haute affinité, appelé site C'(S621 en CRAF ; Graphique 1A) 8. La liaison différentielle des protéines dimériques 14-3-3 aux sites N’et C’, ainsi que le CRD, jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition de RAF 9,10,11,12,13. Dans des conditions normales de signalisation, l’activation de RAF est initiée par son recrutement dans la membrane plasmique par RAS, ce qui lui permet de former des dimères actifs, dont l’hétérodimère BRAF-CRAF est la forme active prédominante14,15. Les analyses biochimiques avec BRAF et CRAF, ainsi que les structures de microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM) des BRAF dimériques, indiquent qu’un dimère 14-3-3 stabilise les dimères RAF actifs en se liant simultanément au site C’des deux protomères RAF (Figure 1B)9,13,16,17. À l’inverse, des études ont montré que dans des conditions de repos, RAF adopte une confirmation cytosolique, auto-inhibée, où le domaine REG se lie au domaine CAT et inhibe son activité 12,18,19,20. Cet état fermé est stabilisé par un dimère 14-3-3 lié au CRD et au site N’dans le domaine REG et au site C’dans le domaine CAT (Figure 1B)10,13,21. Dans BRAF, ce modèle est soutenu par les structures Cryo-EM récentes de monomères BRAF auto-inhibés et par nos études biochimiques précédentes 10,12,13,21,22. Cependant, alors qu’il est démontré que le 14-3-3 joue un rôle inhibiteur dans la régulation23 de la CRA, un état auto-inhibé de type BRAF peut jouer un rôle moindre dans la régulation12 de la CRAC ; par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes par lesquels les protéines 14-3-3 régulent l’activité de CRAF. La régulation des kinases RAF médiée par 14-3-3 nécessite une pléthore d’événements de phosphorylation et de désphosphorylation RAF, la liaison à diverses protéines régulatrices et des interactions avec la membrane plasmique8. Par conséquent, il est essentiel que les interactions 14-3-3-RAF soient mesurées dans des conditions physiologiquement pertinentes et en présence d’une bicouche lipidique intacte.

Pour résoudre ce problème, la technologie NanoBRET (ci-après appelée N-BRET ; voir le tableau des matériaux pour les détails du kit) a été utilisée pour développer un test basé sur la proximité permettant de mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes (Figure 1C). Ce système basé sur BRET mesure les interactions de deux protéines d’intérêt (POI), où une protéine est marquée avec un donneur de nanoluciférase (Nano) et l’autre avec un marqueur Halo, pour le marquage avec le ligand accepteur d’énergie Halo61822,24. L’interaction des protéines d’intérêt entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur, qui à son tour génère le signal BRET (Figure 1C). La protéine donneuse Nano extrêmement brillante (émission (em) 460 nm) et le ligand Halo618 (em 618 nm) offrent une séparation spectrale et une sensibilité supérieures à celles de BRET conventionnelles, ce qui en fait une plate-forme idéale pour étudier les interactions plus faibles et détecter les changements subtils de liaison24. En effet, nous avons précédemment développé un test basé sur N-BRET pour mesurer les interactions auto-inhibitrices des domaines RAF REG et CAT, ce qui a été essentiel pour la caractérisation d’un panel de mutations RASopathy dans le CRD BRAF et a démontré l’importance critique de ce domaine pour maintenir l’autoinhibition et prévenir l’activation constitutive de BRAF12.

Le test décrit ici mesure les interactions de CRAF, fusionné à une étiquette Nano N-terminale (Nano-CRAF), et de l’isoforme zêta de 14-3-3 fusionnée à l’étiquette Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo ; Figure 1C). Nous montrons que les interactions de Nano-CRAF avec 14-3-3ζ-Halo génèrent un signal BRET robuste, qui peut à son tour être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 au site N'(S259A) et/ou au site C'(S621A). Le protocole suivant fournit des étapes détaillées pour effectuer, optimiser et dépanner ce test.

Protocol

REMARQUE : Ce test est effectué dans des cellules de 293FT. Une lignée épithéliale bien caractérisée et facilement transfectable dérivée de cellules rénales embryonnaires humaines. Une seule boîte de culture confluente de 10 cm de ces cellules fournit généralement suffisamment de cellules pour ensemencer 20 puits de plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les étapes 1 à 3 doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique. <p class="jove_title"…

Representative Results

Lorsqu’elle est effectuée comme décrit dans ce protocole (Figure 2), l’interaction de Nano-CRAFWT et de 14-3-3ζ-Halo devrait produire des rapports BRET corrigés de 50-60 mBU (Figure 3A ; Tableau supplémentaire 1). CRAF contient deux sites d’amarrage 14-3-3 dépendants de la phosphorylation, le site N’et le site C'(Figure 1)8. Par conséquent, les contrôles appropriés…

Discussion

Des études antérieures ont montré que les protéines 14-3-3 jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition des kinases RAF. Comprendre comment ces événements de liaison sont régulés et les effets de la modulation de ces interactions sur la signalisation RAF et l’oncogenèse induite par RAF pourrait révéler de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques qui ciblent la fonction CRAF. Cependant, le cycle d’activation de Raf est soutenu par une pléthore de protéines associées, de modifications…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été financé en partie par des fonds fédéraux du National Cancer Institute, National Institutes of Health, sous le numéro de projet ZIA BC 010329.

Materials

Antibodies 
HaloTag® mouse monoclonal antibody Promega G9211  Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody R&D Systems MAB10026 Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)  Santa Crus Biotechnology sc-7267 Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody Amersham NA931-1ML  Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9 Roche/Sigma 6365809001
NanoBRET™ kit  Promega N1661  NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate 
DPBS, without Ca++ and Mg++  Quality Biologicals  114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Life Technologies 25300120
DMEM cell culture media Life Technologies 11995073 High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)   Life Technologies 25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)  Life Technologies   15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media  Gibco 31985062 For cell transfection 
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red Gibco 11058021 For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). 
Invitrogen Trypan Blue Stain  Thermo Scientific  T10282 
NP40 lysis buffer  N/A N/A 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer N/A N/A 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. 
Cell lines 
293FT cells (human) Thermo Scientific  R70007 
DNA vectors 
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant  N/A N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/A N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader PerkinElmer 2104 2104-0010  600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter  Thermo Scientific AMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor  Thermo Scientific   4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)  GraphPad  www.graphpad.com
Other 
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips  Thermo Scientific  94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile  Thomas Scientific 1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ PerkinElmer 6007680 White, polystyrene, tissue culture treated 
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228

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Cite This Article
Spencer-Smith, R. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells. J. Vis. Exp. (205), e66436, doi:10.3791/66436 (2024).

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