Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen

RAF-kinasen (ARAF, BRAF en CRAF) zijn de directe effectoren van RAS GTPases en de initiërende leden van de pro-proliferatieve/pro-overleving RAF-MEK-ERK-kinasecascade. Recente studies hebben aangetoond dat CRAF-expressie een sleutelrol speelt bij het ontstaan van tumoren van verschillende KRAS-gedreven kankers, waaronder niet-kleincellige longkanker en ductaal adenocarcinoom^van de pancreas 1,2,3,4,5. Bovendien veroorzaken CRAF-mutaties in de kiembaan een bijzonder ernstige vorm van de RASopathie, het Noonan-syndroom ^6,7. Het begrijpen van CRAF-regulatie is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van succesvolle therapeutische benaderingen die gericht zijn op de functie ervan in cellen.

Alle RAF-kinasen kunnen worden onderverdeeld in twee functionele domeinen, een C-terminaal katalytisch (CAT) domein en een N-terminaal regulatief (REG) domein, dat de activiteit ervan regelt (Figuur 1A)⁸. Het REG-domein omvat het RAS-bindingsdomein (RBD), het cysteïnerijke domein (CRD) en een serine/threonine-rijk gebied (S/T-rijk). Met name het S/T-rijke gebied bevat de N’-site, die op een fosforyleringsafhankelijke manier bindt aan 14-3-3 (S259 in CRAF; Figuur 1A) ⁸. Het CAT-domein omvat het kinasedomein, samen met een tweede 14-3-3-dockingplaats met hoge affiniteit, de C’-site genoemd (S621 in CRAF; Figuur 1A) ⁸. De differentiële binding van dimeer 14-3-3-eiwitten aan de N’- en C’-plaatsen, samen met de CRD, speelt een cruciale rol bij zowel RAF-activering als -remming 9,10,11,12,13. Onder normale signaleringsomstandigheden wordt RAF-activering geïnitieerd door de rekrutering ervan naar het plasmamembraan door RAS, waardoor het actieve dimeren kan vormen, waarvan het BRAF-CRAF-heterodimeer de overheersende actieve vorm^{is 14,15}. Biochemische testen met BRAF en CRAF, samen met cryogene elektronenmicroscopie (Cryo-EM) structuren van dimeer BRAF, geven aan dat een 14-3-3 dimeer actieve RAF-dimeren stabiliseert door gelijktijdig te binden aan de C’-plaats van beide RAF-protomeren (Figuur 1B)^9,13,16,17. Omgekeerd hebben studies aangetoond dat RAF onder rustige omstandigheden een cytosolische, auto-geremde bevestiging aanneemt, waarbij het REG-domein bindt aan het CAT-domein en de activiteit ervan remt 12,18,19,20. Deze gesloten toestand wordt gestabiliseerd door een 14-3-3 dimeer dat gebonden is aan de CRD- en N’-site in het REG-domein en aan de C’-site in het CAT-domein (Figuur 1B)10,13,21. In BRAF wordt dit model ondersteund door recente Cryo-EM-structuren van auto-geremde BRAF-monomeren en door onze eerdere biochemische studies 10,12,13,21,22. Hoewel is aangetoond dat 14-3-3 een remmende rol speelt bij CRAF-regulatie²³, kan een BRAF-achtige auto-geremde toestand een mindere rol spelen bij CRAF-regulatie¹²; daarom zijn verdere studies nodig om de mechanismen te verduidelijken waarmee 14-3-3-eiwitten de CRAF-activiteit reguleren. De 14-3-3-gemedieerde regulatie van RAF-kinasen vereist een overvloed aan RAF-fosforylerings- en defosforyleringsgebeurtenissen, de binding aan verschillende regulerende eiwitten en interacties met het plasmamembraan⁸. Daarom is het van cruciaal belang dat 14-3-3-RAF-interacties worden gemeten onder fysiologisch relevante omstandigheden en in aanwezigheid van een intacte lipidedubbellaag.

Om dit probleem aan te pakken, werd NanoBRET (vanaf hier aangeduid als N-BRET; zie Tabel van Materialen voor kitdetails) technologie gebruikt om een nabijheidsgebaseerde test te ontwikkelen voor het meten van de interacties van CRAF met 14-3-3 eiwitten in levende cellen (Figuur 1C). Dit op BRET gebaseerde systeem meet de interacties van twee interessante eiwitten (POI), waarbij het ene eiwit wordt gelabeld met een nanoluciferase (Nano) donor en het andere met een Halo-tag, voor labeling met de Halo618-energieacceptorligand ^22,24. Interactie van de eiwitten van belang resulteert in energieoverdracht van donor naar acceptor, die op zijn beurt het BRET-signaal genereert (Figuur 1C). Het extreem heldere Nano-donoreiwit (emissie (em) 460 nm) en het Halo618-ligand (em 618 nm) zorgen voor een grotere spectrale scheiding en gevoeligheid ten opzichte van conventionele BRET, waardoor het een ideaal platform is voor het bestuderen van zwakkere interacties en het detecteren van subtiele veranderingen in binding²⁴. Inderdaad, we ontwikkelden eerder een op N-BRET gebaseerde test voor het meten van de autoremmende interacties van de RAF REG- en CAT-domeinen, die essentieel was voor de karakterisering van een panel van RASopathy-mutaties in de BRAF CRD en het cruciale belang van dit domein aantoonde voor het handhaven van auto-remming en het voorkomen van constitutieve BRAF-activering¹².

De hier beschreven test meet de interacties van CRAF, gefuseerd met een N-terminale Nano-tag (Nano-CRAF), en de zeta-isovorm van 14-3-3 gefuseerd met C-terminale Halo-tag (14-3-3ζ-Halo; Figuur 1C). We tonen aan dat de interacties van Nano-CRAF met 14-3-3ζ-Halo een robuust BRET-signaal genereert, dat op zijn beurt kan worden verstoord door mutaties die 14-3-3-binding aan de N’-site (S259A) en/of de C’-site (S621A) verhinderen. Het volgende protocol biedt gedetailleerde stappen voor het uitvoeren, optimaliseren en oplossen van problemen met deze test.