Моделирование лигандов в карты, полученные с помощью электронной криомикроскопии

Клетки выполняют свои функции, осуществляя бесчисленные химические реакции одновременно и независимо, каждая из которых тщательно регулируется, чтобы обеспечить их выживание и приспособляемость в ответ на сигналы окружающей среды. Это достигается за счет молекулярного распознавания, которое позволяет биомолекулам, особенно белкам, образовывать переходные или стабильные комплексы с другими макромолекулами, а также с малыми молекулами или лигандами^. Таким образом, белок-лигандные взаимодействия являются фундаментальными для всех процессов в биологии, которые включают регуляцию экспрессии и активности белков, распознавание субстратов и кофакторов ферментами, а также то, как клетки воспринимают и ретранслируют^{сигналы.} Лучшее понимание кинетических, термодинамических и структурных свойств комплекса белок-лиганд раскрывает молекулярную основу лигандного взаимодействия, а также способствует рациональному дизайну лекарств за счет оптимизации лекарственного взаимодействия и специфичности. Экономичным и быстрым подходом к изучению взаимодействия белка и лиганда является использование молекулярного докинга, который представляет собой вычислительный метод, который виртуально экранирует широкий спектр малых молекул и предсказывает способ связывания и аффинность этих лигандов к белкам-мишеням. Тем не менее, экспериментальные данные о структурах с высоким разрешением, определенных с помощью рентгеновской дифракции (XRD), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или электронной криомикроскопии (криоЭМ), обеспечивают существенное доказательство таких предсказаний и помогают в разработке новых и более эффективных активаторов или ингибиторов для данной мишени. В этой статье используется аббревиатура «cryoEM», как обычно называют эту технику. Тем не менее, в настоящее время ведутся споры о выборе правильной номенклатуры, и в последнее время был предложен термин криогенныйобразец Electron Microscopy (cryoEM) для обозначения того, что образец находится при криогенной температуре и визуализирован электронами⁴. Точно так же отображения, полученные с помощью криоЭМ, называются электронным потенциалом, электростатическим потенциалом или кулоновским потенциалом, и для простоты здесь мы используем криоЭМ карты 5,6,7,8,9,10.

Несмотря на то, что дифрактометрия является золотым стандартом в определении структуры белков-лигандных комплексов с высоким разрешением, криоЭМ после революции^{разрешения 11} набирает обороты, о чем свидетельствует всплеск карт кулоновского потенциала или карт криоЭМ, депонированных в базе данных электронной микроскопии (EMDB^{) за} последние несколько^лет14. Благодаря достижениям в области подготовки образцов, визуализации и обработки данных, количество отложений в Банке данных о белках (PDB)¹⁴ с использованием криоЭМ увеличилось с 0,7% до 17% в период с 2010 по 2020 год, при этом примерно 50% зарегистрированных структур в 2020 году были определены с разрешением 3,5 Å или выше^15,16. CryoEM быстро получила распространение в сообществе структурной биологии, в том числе в фармацевтической промышленности, поскольку она позволяет изучать гибкие и некристаллические биологические макромолекулы, особенно мембранные белки и мультибелковые комплексы, с околоатомным разрешением, преодолевая процесс кристаллизации и получая хорошо дифрагирующие кристаллы, необходимые для определения структуры с высоким разрешением с помощью XRD.

Точное моделирование лиганда на карте криоЭМ имеет первостепенное значение, поскольку он служит схемой комплекса белок-лиганд на молекулярном уровне. Существует несколько автоматизированных инструментов для построения лигандов, используемых в рентгеновской кристаллографии, которые зависят от формы и топологии плотности лиганда, чтобы вписать или построить лиганд в электронную плотность 17,18,19,20. Тем не менее, если разрешение меньше 3 Å, эти подходы, как правило, приводят к менее желательным результатам, поскольку топологические особенности, от которых они зависят при распознавании и построении, становятся менее определенными. Во многих случаях эти методы оказались неэффективными в точном моделировании лигандов в криоЭМ-карты, поскольку эти карты были определены в диапазоне низкого и среднего разрешения, обычно от 3,5 Å до 5 Ź⁷.

Первый этап 3D-определения структуры комплекса белок-лиганд с помощью криоЭМ включает либо совместную очистку лиганда с белком (когда лиганд имеет высокое сродство связывания с белком), либо инкубацию белкового раствора с лигандом в течение определенного периода времени перед получением сетки. Затем небольшой объем образца помещают на очищенную плазмой дырчатую сетку ПЭМ, после чего следует мгновенная заморозка в жидком этане и, в конечном итоге, визуализация с помощью крио-ПЭМ. Двухмерные проекционные изображения от сотен тысяч до миллионов отдельных частиц усредняются для реконструкции трехмерной (3D) кулоновской карты потенциала макромолекулы. Идентификация и моделирование лигандов и молекул растворителей на этих картах во многих случаях сопряжены со значительными трудностями из-за анизотропного разрешения по всей карте (т.е. разрешение не равномерно по всей макромолекуле), гибкости в области, где связан лиганд, и шума в данных. Многие инструменты моделирования, доработки и визуализации, которые были разработаны для XRD, в настоящее время адаптируются для использования в криоЭМ для тех же целей 18,19,20,21. В этой статье представлен обзор различных методов и программного обеспечения, используемых в настоящее время для идентификации лигандов, построения моделей и уточнения координат, полученных с помощью криоЭМ. Был предоставлен пошаговый протокол, иллюстрирующий процессы, связанные с моделированием лигандов с использованием специфических комплексов белок-лиганд с различным разрешением и сложностью.

Первым шагом в моделировании лигандов в картах криоЭМ является идентификация плотности лиганда (небелкового) в карте. Если связывание лиганда не вызывает каких-либо конформационных изменений в белке, то расчет простой карты различий между комплексом белок-лиганд и апо-протеином по существу выделяет области повышенной плотности, предполагая присутствие лиганда. Такие различия можно заметить сразу, так как для этого просто требуется две карты, и даже промежуточные карты в процессе 3D-уточнения могут быть использованы для проверки наличия лиганда. Кроме того, если разрешение достаточно высокое (<3,0 Å), то карта различий также может дать представление о расположении молекул воды, а также ионов, взаимодействующих с лигандом и белковыми остатками.

В отсутствие карты апо-белка теперь можно использовать Servalcat²², который доступен в качестве отдельного инструмента, а также был интегрирован в программный пакет CCP-EM ^23,24 в рамках доработки Refmac и в CCP4 8.0 версии^25,26. Servalcat позволяет рассчитать карту взвешенной разности FSC (Fo-Fc) с использованием незаточенных полукарт и модели апопротеина в качестве входных данных. Отображение пропуска Fo-Fc представляет собой несоответствие между экспериментальным отображением (Fo) и отображением, полученным из модели (Fc). В отсутствие лиганда в модели положительная плотность в карте Fo-Fc, которая перекрывается с экспериментальной картой EM, обычно предполагает наличие лиганда. Здесь предполагается, что белковая цепь хорошо вписывается в карту, а оставшаяся положительная плотность указывает на местоположение лиганда. Тем не менее, важно тщательно изучить, является ли положительная плотность результатом неточностей моделирования, таких как неправильный ротамер боковой цепи белка.

Второй шаг включает в себя получение или создание файла декартовых координат лиганда с четко определенной геометрией на основе имеющейся химической информации. Стандартные лиганды (например, АТФ и НАДФ⁺), которые уже доступны в библиотеке мономеров CCP4, могут быть использованы для уточнения путем извлечения файлов координат и геометрии через их код присоединения мономера. Однако для неизвестных или нестандартных лигандов доступны различные инструменты для создания файлов геометрии. Некоторые из примеров включают eLBOW²⁷ – (электронный конструктор лигандов и верстак оптимизации) в Phenix²⁸, Lidia – встроенный инструмент в Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-a модуль Glide в составе пакета Schrodinger. Затем файл координат лиганда подгоняется по плотности, руководствуясь как экспериментальной криоЭМ-картой, так и разностной картой в Coot. За этим следует уточнение в реальном пространстве в Phenix²⁸ или взаимное уточнение в Refmac³³. Требуется рабочая станция Linux или ноутбук, оснащенный хорошей видеокартой и вышеупомянутым программным обеспечением. Большинство из этих программ включены в различные сюиты. CCP-EM²⁴ и Phenix²⁸ находятся в свободном доступе для академических пользователей и включают в себя различные инструменты, которые используются в этой статье, включая Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine и т.д. Аналогичным образом, Chimera³⁷ и ChimeraX³⁸ предоставляют бесплатные лицензии для академических пользователей.