نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد

تنجز الخلايا وظائفها من خلال إجراء تفاعلات كيميائية لا حصر لها في وقت واحد وبشكل مستقل ، كل منها منظم بدقة لضمان بقائها وقدرتها على التكيف استجابة للإشارات البيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعرف الجزيئي ، والذي يمكن الجزيئات الحيوية ، وخاصة البروتينات ، من تكوين مجمعات عابرة أو مستقرة مع جزيئات كبيرة أخرى وكذلك جزيئات صغيرة أو روابط¹. وبالتالي ، فإن تفاعلات البروتين والليجند أساسية لجميع العمليات في علم الأحياء ، والتي تشمل تنظيم تعبير البروتين ونشاطه ، والتعرف على الركائز والعوامل المساعدة بواسطة الإنزيمات ، وكذلك كيفية إدراك الخلايا لإشارات ^1,2 وترحيلها. يكشف الفهم الأفضل للخصائص الحركية والديناميكية الحرارية والهيكلية لمركب البروتين والليجند عن الأساس الجزيئي لتفاعل الليجند ويسهل أيضا التصميم العقلاني للدواء من خلال تحسين التفاعل الدوائي والنوعية. يتمثل النهج الاقتصادي والأسرع لدراسة تفاعل البروتين والليجند في استخدام الالتحام الجزيئي ، وهي طريقة حسابية تفحص فعليا مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وتتنبأ بوضع الارتباط وتقارب هذه الروابط لاستهداف^{البروتينات 3}. ومع ذلك ، فإن الأدلة التجريبية من الهياكل عالية الدقة التي يحددها حيود الأشعة السينية (XRD) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) توفر الدليل الأساسي لمثل هذه التنبؤات وتساعد في تطوير منشطات أو مثبطات أحدث وأكثر فعالية لهدف معين. تستخدم هذه المقالة الاختصار “cryoEM” كما يشار إلى التقنية عادة. ومع ذلك ، هناك نقاش مستمر حول اختيار التسمية الصحيحة ، ومؤخرا ، تم اقتراح مصطلحcryo genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) للإشارة إلى أن العينة في درجة حرارة مبردة ويتم تصويرها بالإلكترونات⁴. وبالمثل ، فإن الخرائط المشتقة من cryoEM تسمى جهد الإلكترون أو الجهد الكهروستاتيكي أو جهد كولوم ، وللتبسيط ، نستخدم هنا خرائط cryoEM^{5،6،7،8،9،10}.

على الرغم من أن XRD كانت التقنية القياسية الذهبية في تحديد البنية عالية الدقة لمجمعات البروتين ، إلا أن cryoEM بعد ثورة^{الدقة 11} اكتسبت زخما ، كما يتضح من زيادة خرائط Coulomb المحتملة أو خرائط cryoEM المودعة في قاعدة بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) ^12,13 على مدى السنوات القليلة^{الماضية 14}. نظرا للتقدم في إعداد العينات والتصوير وطرق معالجة البيانات ، زاد عدد ترسبات بنك بيانات البروتين (PDB) ¹⁴ التي تستخدم cryoEM من 0.7٪ إلى 17٪ بين عامي 2010 و 2020 ، مع تحديد ما يقرب من 50٪ من الهياكل المبلغ عنها في عام 2020 بدقة 3.5 Å أو أفضل^15,16. تم اعتماد CryoEM بسرعة من قبل مجتمع البيولوجيا الهيكلية ، بما في ذلك صناعة الأدوية ، لأنه يسمح بدراسة الجزيئات البيولوجية الكبيرة المرنة وغير البلورية ، وخاصة البروتينات الغشائية والمجمعات متعددة البروتينات ، بدقة شبه ذرية ، والتغلب على عملية التبلور والحصول على بلورات حيود جيدة المطلوبة لتحديد بنية عالية الدقة بواسطة XRD.

تعد النمذجة الدقيقة لليجند في خريطة cryoEM أمرا بالغ الأهمية ، لأنها بمثابة مخطط لمجمع البروتين والليجند على المستوى الجزيئي. هناك العديد من أدوات بناء الرباط الآلية المستخدمة في علم البلورات بالأشعة السينية والتي تعتمد على شكل وطوبولوجيا كثافة الربيطة من أجل ملاءمة أو بناء الربيطة في كثافة الإلكترون^{17،18،19،20}. ومع ذلك ، إذا كانت الدقة أقل من 3 Å ، فإن هذه الأساليب تميل إلى إنتاج نتائج أقل استحسانا لأن السمات الطوبولوجية التي تعتمد عليها للاعتراف والبناء تصبح أقل تحديدا. في كثير من الحالات ، أثبتت هذه الطرق عدم فعاليتها في نمذجة الروابط بدقة في خرائط cryoEM ، حيث تم تحديد هذه الخرائط في نطاق الدقة المنخفضة إلى المتوسطة ، عادة بين 3.5 Å-5 Ź⁷.

تتضمن الخطوة الأولى في تحديد بنية 3D لمركب البروتين والليجند بواسطة cryoEM إما التنقية المشتركة لليجند مع البروتين (عندما يكون لليجند تقارب ارتباط عالي بالبروتين) أو احتضان محلول البروتين مع الربيطة لمدة محددة قبل إعداد الشبكة. بعد ذلك ، يتم وضع حجم عينة صغير على شبكة TEM هولي تنظيفها بالبلازما ، يليها تجميد فلاش في الإيثان السائل والتصوير في النهاية باستخدام cryo-TEM. يتم حساب متوسط صور الإسقاط 2D من مئات الآلاف إلى الملايين من الجسيمات الفردية لإعادة بناء خريطة إمكانات كولوم ثلاثية الأبعاد (3D) للجزيء الكبير. يشكل تحديد ونمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في هذه الخرائط تحديات كبيرة في كثير من الحالات بسبب دقة الخواص عبر الخريطة (أي أن الدقة ليست موحدة عبر الجزيء الكبير) ، والمرونة في المنطقة التي يرتبط فيها الربيطة ، والضوضاء في البيانات. يتم الآن تكييف العديد من أدوات النمذجة والتحسين والتصور التي تم تطويرها ل XRD للاستخدام في cryoEM لنفس الأغراض^{18،19،20،21}. في هذه المقالة ، يتم تقديم نظرة عامة على الأساليب والبرامج المختلفة المستخدمة حاليا لتحديد الروابط وبناء النماذج وتحسين الإحداثيات المشتقة من cryoEM. تم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح العمليات التي تنطوي عليها نمذجة الروابط باستخدام معقدات بروتين ليجند محددة بدقة وتعقيد متفاوتين.

تتضمن الخطوة الأولى في نمذجة الروابط في خرائط cryoEM تحديد كثافة الربيطة (غير البروتينية) في الخريطة. إذا كان ارتباط الربيطة لا يحدث أي تغيير مطابق في البروتين ، فإن حساب خريطة فرق بسيطة بين مركب البروتين والليجند وبروتين apo يسلط الضوء بشكل أساسي على مناطق الكثافة الإضافية ، مما يشير إلى وجود الرباط. يمكن ملاحظة هذه الاختلافات على الفور ، لأنها تتطلب خريطتين فقط ، وحتى الخرائط الوسيطة أثناء عملية تحسين 3D يمكن استخدامها للتحقق مما إذا كان الرباط موجودا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الدقة عالية بما يكفي (<3.0 Å) ، فيمكن أن توفر خريطة الفرق أيضا نظرة ثاقبة لموقع جزيئات الماء وكذلك الأيونات التي تتفاعل مع الرباط وبقايا البروتين.

في غياب خريطة apo-protein ، أصبح من الممكن الآن استخدام Servalcat²² ، والذي يتوفر كأداة قائمة بذاتها وتم دمجه أيضا في مجموعة برامج CCP-EM^23,24 كجزء من تحسين Refmac وفي إصدار CCP4 8.0^25,26. يسمح Servalcat بحساب خريطة الفرق المرجح FSC (Fo-Fc) باستخدام الخرائط النصفية غير الحادة ونموذج apoprotein كمدخلات. تمثل خريطة حذف Fo-Fc التباين بين الخريطة التجريبية (Fo) والخريطة المشتقة من النموذج (Fc). في حالة عدم وجود ليجند في النموذج ، فإن الكثافة الموجبة في خريطة Fo-Fc التي تتداخل مع خريطة EM التجريبية تشير عادة إلى وجود الرباط. الافتراض هنا هو أن سلسلة البروتين مثبتة جيدا في الخريطة ، وتشير الكثافة الموجبة المتبقية إلى موقع الرباط. ومع ذلك ، من المهم أن نفحص بدقة ما إذا كانت الكثافة الإيجابية تنبع من عدم دقة النمذجة ، مثل الدوار الخاطئ لسلسلة جانبية للبروتين.

تتضمن الخطوة الثانية الحصول على أو إنشاء ملف إحداثي ديكارتي لليجند بهندسة محددة جيدا من المعلومات الكيميائية المتاحة. يمكن استخدام الروابط القياسية (على سبيل المثال ، ATP و NADP ⁺) المتوفرة بالفعل في مكتبة مونومر CCP4 للتحسين عن طريق استرداد ملفات الإحداثيات والهندسة عبر رمز انضمام المونومر الخاص بها. ومع ذلك ، بالنسبة للروابط غير المعروفة أو غير القياسية ، تتوفر أدوات مختلفة لإنشاء ملفات الهندسة. تتضمن بعض الأمثلة eLBOW²⁷ – (منشئ الرباط الإلكتروني ومنضدة عمل التحسين) في Phenix²⁸ ، Lidia – أداة مدمجة في Coot²⁹ ، JLigand / ACEDRG^30,31 ، CCP-EM^23,24 ، Ligprep^32-وحدة من Glide داخل مجموعة Schrodinger. ثم يتم تركيب ملف إحداثيات الرباط في الكثافة ، مسترشدا بكل من خريطة cryoEM التجريبية وخريطة الفرق في Coot. ويتبع ذلك تحسين الفضاء الحقيقي في فينيكس²⁸ أو التحسين المتبادل في Refmac³³. مطلوب محطة عمل Linux أو كمبيوتر محمول مزود ببطاقة رسومات جيدة والبرامج المذكورة أعلاه. يتم تضمين معظم هذه البرامج في أجنحة مختلفة. CCP-EM²⁴ و Phenix²⁸ متاحان مجانا للمستخدمين الأكاديميين ويتضمنان مجموعة متنوعة من الأدوات المستخدمة في هذه المقالة ، بما في ذلك Coot و Refmac5^33،34،^35،36 و Servalcat و phenix.real_space_refine وما إلى ذلك. وبالمثل ، توفر Chimera³⁷ و ChimeraX³⁸ تراخيص مجانية للمستخدمين الأكاديميين.