Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Hücreler, sayısız kimyasal reaksiyonu aynı anda ve bağımsız olarak gerçekleştirerek işlevlerini yerine getirirler, her biri çevresel ipuçlarına yanıt olarak hayatta kalmalarını ve uyum sağlamalarını sağlamak için titizlikle düzenlenir. Bu, biyomoleküllerin, özellikle proteinlerin, diğer makromoleküllerin yanı sıra küçük moleküller veya ligandlar ile geçici veya kararlı kompleksler oluşturmasını sağlayan moleküler tanıma ile elde edilir¹. Bu nedenle, protein-ligand etkileşimleri, protein ekspresyonunun ve aktivitesinin düzenlenmesini, substratların ve kofaktörlerin enzimler tarafından tanınmasını ve ayrıca hücrelerin sinyalleri nasıl algıladığını ve ilettiğini^içeren biyolojideki tüm süreçler için temeldir ^1,2. Protein-ligand kompleksinin kinetik, termodinamik ve yapısal özelliklerinin daha iyi anlaşılması, ligand etkileşiminin moleküler temelini ortaya çıkarır ve ayrıca ilaç etkileşimini ve özgüllüğünü optimize ederek rasyonel ilaç tasarımını kolaylaştırır. Protein-ligand etkileşimini incelemek için ekonomik ve daha hızlı bir yaklaşım, çok çeşitli küçük molekülleri sanal olarak tarayan ve bu ligandların hedef proteinlere bağlanma modunu ve afinitesini tahmin eden bir hesaplama yöntemi olan moleküler yerleştirmeyi kullanmaktır³. Bununla birlikte, X-ışını Kırınımı (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya elektron kriyomikroskopisi (cryoEM) ile belirlenen yüksek çözünürlüklü yapılardan elde edilen deneysel kanıtlar, bu tür tahminler için temel kanıtı sağlar ve belirli bir hedef için daha yeni ve daha etkili aktivatörlerin veya inhibitörlerin geliştirilmesine yardımcı olur. Bu makale, tekniğe yaygın olarak atıfta bulunulduğu için ‘cryoEM’ kısaltmasını kullanır. Bununla birlikte, doğru isimlendirmenin seçilmesi konusunda devam eden bir tartışma vardır ve son zamanlarda, numunenin kriyojenik sıcaklıkta olduğunu ve elektronlarla^{görüntülendiğini} belirtmek için kriyojeniknumune Elektron Mikroskopisi (cryoEM) terimi önerilmiştir. Benzer şekilde, cryoEM’den türetilen haritalar elektron potansiyeli, elektrostatik potansiyel veya Coulomb potansiyeli olarak adlandırılmıştır ve basitlik için burada cryoEM haritaları 5,6,7,8,9,10 kullanıyoruz.

XRD, protein-ligand komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapı tayininde altın standart teknik olmasına rağmen, son birkaç yılda Elektron Mikroskobu Veritabanında (EMDB)^12,13 biriken Coulomb potansiyel haritalarının veya kriyoEM haritalarının dalgalanmasıyla gösterildiği gibi, çözünürlük devrimi^{sonrası 11} kriyoEM ivme kazanmıştır¹⁴. Numune hazırlama, görüntüleme ve veri işleme yöntemlerindeki ilerlemeler sayesinde, kriyoEM kullanan Protein Veri Bankası (PDB)¹⁴ birikimlerinin sayısı 2010 ve 2020 yılları arasında %0,7’den %17’ye yükselmiştir ve 2020’de rapor edilen yapıların yaklaşık %50’si 3,5 şveya daha iyi çözünürlükte belirlenmiştir^15,16. CryoEM, farmasötik endüstrisi de dahil olmak üzere yapısal biyoloji topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir, çünkü esnek ve kristal olmayan biyolojik makromoleküllerin, özellikle membran proteinlerinin ve çoklu protein komplekslerinin, atoma yakın çözünürlükte çalışılmasına izin verir, kristalleşme sürecinin üstesinden gelir ve XRD ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için gerekli olan iyi kırınım kristalleri elde eder.

CryoEM haritasındaki ligandın doğru modellenmesi, moleküler düzeyde protein-ligand kompleksinin bir planı olarak hizmet ettiği için çok önemlidir. X-ışını kristalografisinde kullanılan, ligandı elektron yoğunluğu ^{17,18,19,20’ye} sığdırmak veya inşa etmek için ligand yoğunluğunun şekline ve topolojisine bağlı olan birkaç otomatik ligand oluşturma aracı vardır. Bununla birlikte, çözünürlük 3 Å’den düşükse, bu yaklaşımlar daha az arzu edilen sonuçlar üretme eğilimindedir, çünkü tanıma ve oluşturma için bağlı oldukları topolojik özellikler daha az tanımlanmış hale gelir. Birçok durumda, bu haritalar düşük-orta çözünürlük aralığında, tipik olarak 3.5 Å-5 Ź⁷ arasında belirlendiğinden, bu yöntemlerin ligandları cryoEM haritalarına doğru bir şekilde modellemede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır.

CryoEM ile bir protein-ligand kompleksinin 3D yapı tayinindeki ilk adım, ligandın protein ile birlikte saflaştırılmasını (ligandın proteine yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunda) veya protein çözeltisinin ızgara hazırlığından önce belirli bir süre ligand ile inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, plazma ile temizlenmiş delikli bir TEM ızgarasına küçük bir numune hacmi yerleştirilir, ardından sıvı etan içinde hızlı dondurma ve son olarak bir kriyo-TEM ile görüntüleme yapılır. Yüz binlerce ila milyonlarca bireysel parçacıktan gelen 2D projeksiyon görüntülerinin ortalaması, makromolekülün 3 boyutlu (3D) Coulomb potansiyel haritasını yeniden oluşturmak için alınır. Bu haritalardaki ligandların ve çözücü moleküllerinin tanımlanması ve modellenmesi, harita boyunca anizotropik çözünürlük (yani, çözünürlük makromolekül boyunca aynı değildir), ligandın bağlı olduğu bölgedeki esneklik ve verilerdeki gürültü nedeniyle birçok durumda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. XRD için geliştirilen modelleme, iyileştirme ve görselleştirme araçlarının çoğu şimdi aynı amaçlar için cryoEM’de kullanılmak üzere uyarlanmaktadır 18,19,20,21. Bu makalede, ligandları tanımlamak, modeller oluşturmak ve cryoEM’den türetilen koordinatları iyileştirmek için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlere ve yazılımlara genel bir bakış sunulmaktadır. Değişen çözünürlük ve karmaşıklığa sahip spesifik protein-ligand kompleksleri kullanılarak ligandların modellenmesinde yer alan süreçleri göstermek için adım adım bir protokol sağlanmıştır.

CryoEM haritalarında ligandların modellenmesindeki ilk adım, haritadaki ligand yoğunluğunun (protein olmayan) tanımlanmasını içerir. Ligand bağlanması proteinde herhangi bir konformasyonel değişikliğe neden olmazsa, protein-ligand kompleksi ile apo-protein arasındaki basit bir fark haritasının hesaplanması, ligandın varlığını düşündüren ekstra yoğunluk bölgelerini esasen vurgular. Bu tür farklılıklar hemen gözlemlenebilir, çünkü sadece iki harita gerektirir ve hatta ligandın mevcut olup olmadığını kontrol etmek için 3D iyileştirme işlemi sırasında ara haritalar bile kullanılabilir. Ek olarak, çözünürlük yeterince yüksekse (<3.0 Å), fark haritası, su moleküllerinin yanı sıra ligand ve protein kalıntıları ile etkileşime giren iyonların konumu hakkında da bilgi sağlayabilir.

Apo-protein haritasının yokluğunda^{, bağımsız} bir araç olarak mevcut olan ve ayrıca Refmac iyileştirmesinin bir parçası olarak CCP-EM yazılım paketi 23,24’e ve CCP4 8.0 sürüm 25,26’ya entegre edilmiş olan Servalcat^22’yi kullanmak artık mümkün. Servalcat, keskinleştirilmemiş yarım haritaları ve apoprotein modelini girdi olarak kullanarak bir FSC ağırlıklı fark (Fo-Fc) haritasının hesaplanmasına izin verir. Fo-Fc atlama haritası, deneysel harita (Fo) ile modelden türetilen harita (Fc) arasındaki eşitsizliği temsil eder. Modelde bir ligandın yokluğunda, deneysel EM haritasıyla örtüşen bir Fo-Fc haritasındaki pozitif bir yoğunluk tipik olarak ligandın varlığını gösterir. Buradaki varsayım, protein zincirinin haritaya iyi bir şekilde oturduğu ve kalan pozitif yoğunluğun ligandın yerini gösterdiğidir. Bununla birlikte, pozitif yoğunluğun, bir protein yan zincirinin yanlış döndürücüsü gibi modelleme hatalarından kaynaklanıp kaynaklanmadığını titizlikle incelemek önemlidir.

İkinci adım, mevcut kimyasal bilgilerden iyi tanımlanmış geometriye sahip ligandın kartezyen koordinat dosyasının elde edilmesini veya oluşturulmasını içerir. CCP4 monomer kütüphanesinde zaten mevcut olan standart ligandlar (örneğin, ATP ve NADP⁺), koordinat ve geometri dosyalarını monomer erişim kodları aracılığıyla alarak iyileştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bilinmeyen veya standart olmayan ligandlar için, geometri dosyalarını oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Örneklerden bazıları arasında Phenix^28’deki eLBOW²⁷ – (elektronik ligand oluşturucu ve optimizasyon tezgahı), Lidia – Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Schrödinger paketi içindeki Glide’ın Ligprep^32-a modülünde yerleşik bir araç bulunmaktadır. Ligand koordinat dosyası daha sonra hem deneysel cryoEM haritası hem de Coot’taki fark haritası tarafından yönlendirilen yoğunluğa yerleştirilir. Bunu, Phoenix^28’de gerçek alan iyileştirmesi veya Refmac^33’te karşılıklı iyileştirme takip eder. İyi bir grafik kartı ve yukarıda belirtilen yazılımla donatılmış bir Linux iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar gereklidir. Bu programların çoğu çeşitli süitlere dahil edilmiştir. CCP-EM²⁴ ve Phenix²⁸, akademik kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir ve Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, vb. dahil olmak üzere bu makalede kullanılan çeşitli araçları içerir. Benzer şekilde, Chimera³⁷ ve ChimeraX³⁸ akademik kullanıcılara ücretsiz lisanslar sağlar.