クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

細胞は、無数の化学反応を同時に独立して行うことでその機能を達成し、それぞれが環境の合図に応答して生存と適応性を確保するために細心の注意を払って制御されています。これは分子認識によって達成され、生体分子、特にタンパク質が他の高分子や小分子、またはリガンドと一過性または安定な複合体を形成することを可能にします¹。したがって、タンパク質-リガンド相互作用は、タンパク質の発現と活性の調節、酵素による基質と補因子の認識、細胞がシグナルを知覚して中継する方法など、生物学のすべてのプロセスの基本です^1,2。タンパク質-リガンド複合体の速度論的、熱力学的、および構造的特性をよりよく理解することで、リガンド相互作用の分子基盤が明らかになり、薬物相互作用と特異性を最適化することで合理的な薬物設計が容易になります。タンパク質-リガンド相互作用を研究するための経済的で迅速なアプローチは、多様な低分子を仮想的にスクリーニングし、これらのリガンドの標的タンパク質への結合モードと親和性を予測する計算方法である分子ドッキングを使用することです³。しかし、X線回折(XRD)、核磁気共鳴(NMR)、またはクライオ電子顕微鏡(クライオEM)によって決定された高分解能構造からの実験的証拠は、そのような予測に不可欠な証拠を提供し、特定のターゲットに対するより新しくより効果的な活性化因子または阻害剤の開発に役立ちます。この記事では、この手法が一般的に呼ばれているように、「cryoEM」という略語を使用しています。しかし、正しい命名法の選択については議論が続いており、最近では、サンプルが極低温にあり、電子で画像化されていることを示すために、cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)という用語が提案^{されています4。}同様に、クライオ電子顕微鏡から導出されたマップは、電子ポテンシャル、静電ポテンシャル、またはクーロンポテンシャルと呼ばれてきましたが、ここでは簡単にするために、クライオ電子顕微鏡マップ5,6,7,8,9,10を使用します。

XRDは、タンパク質-リガンド複合体の高分解能構造決定におけるゴールドスタンダード技術でしたが、過去数年間で電子顕微鏡データベース(EMDB)^12,13に蓄積されたクーロン電位マップまたはクライオEMマップが急増したことが示すように、分解能革命後の¹¹クライオEMは勢いを増しています¹⁴。サンプル調製、イメージング、およびデータ処理方法の進歩により、クライオ電子顕微鏡を使用したタンパク質データバンク(PDB)¹⁴の堆積数は、2010年から2020年の間に0.7%から17%に増加し、2020年に報告された構造の約50%が3.5 Å以上の分解能で決定されました^15,16。CryoEMは、柔軟な非結晶性の生体高分子、特に膜タンパク質や多タンパク質複合体を原子に近い分解能で研究し、結晶化のプロセスを克服し、XRDによる高分解能構造決定に必要な十分に回折する結晶を得ることができるため、製薬業界を含む構造生物学コミュニティで急速に採用されています。

クライオ電子顕微鏡マップにおけるリガンドの正確なモデリングは、分子レベルでのタンパク質-リガンド複合体の設計図として機能するため、最も重要です。X線結晶構造解析で使用されるいくつかの自動化された配位子構築ツールは、配位子を電子密度^17,18,19,20に適合または構築するために、配位子密度の形状とトポロジーに依存します。それにもかかわらず、解像度が 3 Å より低い場合、これらのアプローチは、認識と構築のために依存するトポロジカルな特徴が定義されなくなるため、望ましくない結果を生み出す傾向があります。多くの場合、これらの方法は、リガンドをクライオ電子顕微鏡マップに正確にモデル化するのに効果的ではないことが証明されています。これは、これらのマップが低から中程度の分解能の範囲(通常は3.5 Å-5 Ź⁷)で決定されているためです。

クライオ電子顕微鏡によるタンパク質-リガンド複合体の3D構造決定の最初のステップは、リガンドをタンパク質と共精製するか(リガンドがタンパク質に対して高い結合親和性を持つ場合)、またはグリッド調製前にタンパク質溶液をリガンドと特定の期間インキュベートすることです。その後、少量のサンプルをプラズマ洗浄した穴質TEMグリッド上に配置し、続いて液体エタン中で瞬間凍結し、最終的にクライオTEMでイメージングします。数十万から数百万の個々の粒子からの2D投影画像を平均化して、高分子の3次元(3D)クーロン電位マップを再構築します。これらのマップでリガンドと溶媒分子を同定し、モデル化することは、マップ全体の異方性分解能(すなわち、高分子間で分解能が均一ではない)、リガンドが結合している領域の柔軟性、およびデータ内のノイズのために、多くの場合、大きな課題を提起します。XRD用に開発されたモデリング、改良、および視覚化ツールの多くは、現在、同じ目的でクライオEMでの使用に適応されています18,19,20,21。この記事では、リガンドの同定、モデルの構築、クライオEMから得られる座標の改良に現在使用されているさまざまな方法とソフトウェアの概要を示します。特定のタンパク質-リガンド複合体を用いたリガンドのモデリングに関与するプロセスを、さまざまな分解能と複雑さで説明するための段階的なプロトコルが提供されています。

クライオ電子顕微鏡マップでリガンドをモデル化する最初のステップは、マップ内のリガンド密度(非タンパク質)の同定です。リガンド結合がタンパク質の立体配座変化を誘発しない場合、タンパク質-リガンド複合体とアポタンパク質との間の単純な差分マップを計算すると、本質的に余分な密度の領域が強調表示され、リガンドの存在が示唆されます。このような違いは、2つのマップが必要なだけなのですぐに観察でき、3Dリファインメントのプロセス中の中間マップでも、リガンドが存在するかどうかを確認するために使用できます。さらに、分解能が十分に高い(<3.0 Å)場合、差分マップは、水分子の位置や、リガンドおよびタンパク質残基と相互作用するイオンに関する洞察も提供できます。

アポタンパク質マップがない場合、Servalcat²²を使用することが可能になり、これはスタンドアロンツールとして利用可能であり、Refmacリファインメントの一部としてCCP-EMソフトウェアスイート^23,24に統合され、CCP4 8.0リリース^25,26でも統合されています。Servalcatは、シャープ化されていないハーフマップとアポタンパク質モデルを入力として使用して、FSC加重差(Fo-Fc)マップの計算を可能にします。Fo-Fc 省略マップは、実験マップ(Fo)とモデルから導出されたマップ(Fc)との間の不均衡を表します。モデルにリガンドがない場合、Fo-Fcマップの正の密度が実験EMマップと重なると、通常、リガンドの存在を示唆します。ここでの仮定は、タンパク質鎖がマップによく適合しており、残りの正の密度がリガンドの位置を示すことです。ただし、正の密度がモデリングの不正確さ(タンパク質側鎖の回転子が間違っているなど)に起因するかどうかを細心の注意を払って調べることが重要です。

2番目のステップでは、利用可能な化学情報から明確に定義された形状を持つリガンドのデカルト座標ファイルを取得または作成します。CCP4モノマーライブラリにすでに含まれている標準配位子(ATPやNADP⁺など)は、モノマーアクセッションコードを介して座標ファイルとジオメトリファイルを取得することで、リファインに使用できます。ただし、不明または非標準の配位子については、ジオメトリファイルを作成するためのさまざまなツールを使用できます。例としては、Phenix²⁸のeLBOW²⁷(電子リガンドビルダーおよび最適化ワークベンチ)、Coot²⁹の組み込みツールであるLidia、JLigand/ACEDRG^30,31、CCP-EM^23,24、Schrodingerスイート内のGlideのLigprep^32-aモジュールなどがあります。次に、リガンド座標ファイルは、実験的なクライオ電子顕微鏡マップとCootの差分マップの両方によって導かれて、密度に適合します。これに続いて、Phenix²⁸ での実空間の改良、または Refmac³³ での相互改良が行われます。Linuxワークステーション、または優れたグラフィックカードと上記のソフトウェアを搭載したラップトップが必要です。これらのプログラムのほとんどは、さまざまなスイートに含まれています。CCP-EM²⁴ と Phenix²⁸ は、アカデミック ユーザーが無料で利用でき、Coot、Refmac5 ^33,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine など、この記事で使用されているさまざまなツールが含まれています。同様に、Chimera³⁷ と ChimeraX³⁸ は、アカデミック ユーザーに無料ライセンスを提供します。