1. Modellierung von Phosphoenolpyruvat (PEP) in Enolase aus Mycobacterium tuberculosis Identifizierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte des PEP-Enolase-KomplexesLaden Sie die ungeschärften Halbkarten (emd_30988_additional_1.map und emd_30988_additional_2.map) von Apo-Enolase aus den zusätzlichen Daten in EMDB herunter (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie ChimeraX (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Halbkarten von apo-enolase, indem Sie in der Symbolleiste auf Öffnen klicken und die Dateinamen auswählen. Geben Sie vop add #1 #2 in die Befehlszeile ein, um die beiden halben Maps zu kombinieren und die unscharfe Apo-Enolase-Karte zu erhalten.HINWEIS: #1 und #2 bezeichnen die beiden halben Karten für das apo-enolasische Enzym, wie in Schritt 1.1.1 erwähnt. Benennen Sie die kombinierte Map (ChimeraX-Map-ID: #3) um, indem Sie rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map eingeben. Färbt die Karte in der Modellgruppe grau ein. Die Karte zeigt, dass Enolase in der Lösung mit D4-Symmetrie oktamer ist. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 mit den folgenden Halbzuordnungen emd_30989_additional_1.map (Zuordnungs-ID: 4) und emd_30989_additional_2.map (Zuordnungs-ID: 5), um PEP-enolase-unsharpened-map (Zuordnungs-ID: #6) zu erhalten. Um eine Differenzkarte zu berechnen, passen Sie zunächst die beiden Maps (PEP-enolase und apo-enolase unsharpened maps aus Schritt 1.1.3 und Schritt 1.1.4) aneinander aneinander, indem Sie in ChimeraX im Map-Panel (Symbolleiste) auf Fit (map in map) klicken.HINWEIS: Zwischen den beiden Maps wird keine Normalisierung durchgeführt. In einigen Fällen kann eine Normalisierung erforderlich sein, um die Karten auf denselben Maßstab zu bringen. Subtrahieren Sie die PEP-enolase-Karte von der apo-enolase-Map, indem Sie vop subtract #6 #3 in die Befehlszeile eingeben.HINWEIS: #6 = PEP-enolasische ungeschärfte Karte, #3 = Apo-enolase ungeschärfte Karte. Färbe die subtrahierte Karte (Karten-ID:7) grün ein, was die positive Dichte angibt (gemäß der Konvention in der Röntgenkristallographie)39. Laden Sie die Koordinaten von M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) aus der Protein Data Bank (PDB) herunter, klicken Sie in der Symbolleiste auf Öffnen und wählen Sie den Dateinamen aus. Benennen Sie das Modell in 7e4x.pdb um, indem Sie rename #8 Apo_enolase.pdb in die Befehlszeile eingeben. #8 bezeichnet die Apo_enolase.pdb in ChimeraX. Wählen Sie das Modell in der Modellgruppe aus. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Rechte Maus. Klicken Sie auf Molekül verschieben, um das Modell in der Nähe der PEP-Enolase-Karte (#6) zu positionieren und das Modell in Bezug auf die Karte auszurichten. Passen Sie dieses Modell in die PEP-enolase-unsharpened-map ein, indem Sie fit #8 in #6 in der Befehlszeile eingeben. Hier ist die Karte mit 6 und das Modell mit 8 nummeriert.HINWEIS: In einigen Fällen reicht die lokale Anpassung in ChimeraX möglicherweise nicht aus, um das Modell auszurichten. In diesen Fällen kann ein zusätzlicher Schritt der globalen Anpassung (DockinMap, siehe Materialtabelle) in Phenix durchgeführt werden. Speichern Sie das angepasste Modell, indem Sie save Apo-enolase.pdb #8 in die Befehlszeile eingeben. Modellierung und Verfeinerung von PEP in der B-Faktor geschärften KryoEM-Karte des PEP-Enolase-KomplexesÖffnen Sie “coot” (siehe Materialtabelle) vom Terminal aus, indem Sie ./Coot & eingeben. Zeigen Sie “Apo-enolase.pdb” an, indem Sie auf Datei klicken > Koordinaten Apo-enolase.pdb öffnen. Die Koordinatendatei wird durch Bindungen (Farbe nach Atom) dargestellt. Laden Sie die PEP-gebundene Enolase sharpened map herunter, d.h. emd_30989.map von EMDB. Zeigen Sie dasselbe an, indem Sie auf Datei klicken > Karte öffnen > emd_30989.map . Stellen Sie den Schwellenwert auf 7,00 σ ein, indem Sie mit der mittleren Maustaste scrollen. Suchen Sie nach nicht modellierten Blobs, indem Sie auf > Nicht modellierten Blobs überprüfen > auf Blobs suchen klicken. Lokalisieren Sie die nicht modellierte Ligandendichte in der Nähe der Reste des aktiven Zentrums, Ser 42, Lys-386 und Arg-364 des Enolasemodells. Holen Sie sich die PEP-Monomer-Modelldatei aus der Coot-Monomer-Bibliothek, indem Sie auf Datei > Get Monomer klicken und PEP als 3-Buchstaben-Code eingeben. Verschieben Sie das PEP-Molekül auf die Dichte, indem Sie die Option Drehen/Verschieben- Zone/Kette/Molekül im Menü der Seitenleiste verwenden. Verwenden Sie die Realspace-Verfeinerung in Coot, um das PEP-Molekül in die Dichte einzupassen, indem Sie im Menü der Seitenleiste auf Real Space Refine Zone klicken. Führen Sie den angepassten Liganden mit der Apo-enolase.pdb zusammen, indem Sie die Option merge molecule auf der Registerkarte “Bearbeiten ” verwenden. Speichern Sie das Modell unter dem Namen PEP-Enolase.pdb.HINWEIS: Man kann auch die Option Ligand> Jiggle-Fit Ligand verwenden, um den Liganden ebenfalls anzupassen. Um Liganden zu den restlichen Monomeren in der Koordinatendatei hinzuzufügen, klicken Sie auf Berechnen > NCS-Tools > NCS-Liganden. Ein separates Fenster mit dem Namen “NCS-bezogene Liganden suchen” wird angezeigt. Wählen Sie für die Option Protein mit NCS die Koordinatendatei Apo-enolase.pdb und die Ketten-ID A als NCS-Masterkette aus.Wählen Sie für das Molekül, das den Liganden enthält, die Datei Apo-enolase.pdb als Koordinatendatei und die Ketten-ID, J und die Restnummer 1 bis 1 aus. Klicken Sie auf Kandidatenstellen suchen. Es erscheint ein Fenster mit dem Namen “Angepasste Liganden” mit einer Liste der Kandidatenpositionen. Bewerten Sie die Passung, indem Sie auf die einzelnen Kandidatenliganden klicken, und analysieren Sie die Anpassung visuell.HINWEIS: In Servalcat/Refmac kann nur ein Monomermodell bereitgestellt werden, und die bei der Rekonstruktion verwendete Symmetrie kann angegeben werden, um ein erweitertes Modell zu erhalten. Eine zusätzliche Dichte für die Lösungsmittelmoleküle wurde auch in der Nähe des Liganden beobachtet. Hochauflösende Kristallstrukturen von Enolase aus verschiedenen Homologen deuten auf das Vorhandensein von zwei Mg2+ Ionen40,41 hin, die wahrscheinlich die negative Ladung des Reaktionszwischenprodukts stabilisieren. Modellieren Sie zwei Mg2+-Ionen in der Dichte des aktiven Zentrums, indem Sie auf Atom platzieren am Zeiger klicken und MG aus der Liste Zeigeratomtyp auswählen.HINWEIS: Die Bindungsgeometrie und der Abstand können als Leitfaden für die Auswahl des Metallions verwendet werden. Im Fall von Mg2+ , das an Sauerstoffatome in Proteinresten gebunden ist, variiert der Bindungsabstand zwischen 2,1 Å und 2,4 Å bei einer oktaedrischen Geometrie. Bei Karten mit niedriger Auflösung ist die Koordinationssphäre jedoch oft unvollständig, und auch die Entfernung kann aufgrund von Einschränkungen in der Auflösung variieren. Schritt 1.2.8 wird wiederholt, um die Mg2+ -Ionen in die symmetriebezogenen Monomere aufzunehmen. Speichern Sie das Modell, indem Sie auf Datei > Koordinaten speichern > > Dateinamen auswählen klicken und Enolase+PEP+Mg.pdb eingeben. Öffnen Sie die Phenix-GUI (siehe Materialtabelle). Führen Sie einen realen Speichereinschränkungsauftrag mit Enolase+PEP+Mg.pdb und emd_30989.map als Eingabemodell bzw. Karte unter Verwendung von Standardparametern aus. Dieser Schritt wird iterativ mit Coot durchgeführt, um eine gute Anpassung des Kartenmodells und eine gute Geometrie zu erreichen.HINWEIS: Die unscharfe Differenzkarte wird verwendet, um das Vorhandensein eines Liganden zu demonstrieren, z. B. in einer Abbildung. Zu Modellierungszwecken wurde die geschärfte Karte mit dem B-Faktor verwendet, die empfohlen wird. Die geschärfte Karte mit dem B-Faktor kann auch zur Berechnung der Differenzkarte zu Demonstrationszwecken verwendet werden, im Gegensatz zur ungeschärften Karte. Wenn die Auflösung jedoch in dem Bereich, in dem der Ligand gebunden ist, niedriger ist, zeigt der einzelne B-Faktor, der zum Schärfen der gesamten Karte verwendet wird, die Ligandendichte möglicherweise nicht deutlich an. Visualisierung und Figurengenerierung des modellierten LigandenÖffnen Sie das verfeinerte Enolase+PEP+Mg-Modell aus dem endgültigen Phenix-Verfeinerungsauftrag in PyMOL42 (siehe Materialtabelle), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen. Laden Sie die emd-30989.map (PEP-bound sharpened map), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen. Benennen Sie die Map in PEP-sharpened um, indem Sie auf Aktionen > Umbenennen gegen das emd_30989 Objekt klicken und PEP-sharpened eingeben.HINWEIS: In den meisten Fällen, z. B. in enolase, werden die Maps beim Öffnen in pymol normalisiert, da die Option zum Normalisieren von Maps in pymol standardmäßig aktiviert ist. Da KryoEM-Karten auf einem größeren Kasten zentriert sind, umfasst die Normalisierung alles in dem Kasten. So kann die Normalisierung vor dem Öffnen in pymol ausgeschaltet werden. Wählen Sie die Liganden aus, indem Sie auf Anzeige > Sequenz klicken. Geben Sie isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste. Färben Sie das mesh_ligand blau, indem Sie auf das letzte Feld C neben dem mesh_ligand Objekt klicken. Zeigen Sie die Reste des aktiven Zentrums, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 und Lys-386, die mit PEP und Mg2+ in der Stick- bzw. Kugeldarstellung und dem Enzym Enolase in der Karikaturdarstellung interagieren. Raytrace, indem Sie ray 3600, 3600 eingeben, um Bilder in Publikationsqualität zu generieren und als PNG-Datei zu speichern, indem Sie auf Datei > Speichern klicken und PEP.png als Dateinamen auswählen. 2. Modellierung von Liganden im metabotrope Glutamatrezeptor mGlu5 Identifizierung und Modellierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte von Agonisten und antagonistengebundenem mGlu5Laden Sie die beiden Halbkarten zusammen mit den entsprechenden Koordinatendateien für jeden der Agonisten gebundenen (EMD-31536, 7fd8.pdb) und der antagonistisch gebundenen (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-Komplexe herunter. Öffnen Sie ChimeraXÖffnen Sie die Koordinatendatei 7fd8.pdb, indem Sie auf Öffnen klicken und 7fd8.pdb auswählen. Geben Sie delete ligand in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste. Verwenden Sie auf ähnliche Weise den Befehl delete/B , um die Kette B zu löschen.HINWEIS: Liganden und Ketten können gelöscht werden, indem Sie das Dropdown-Menü oben mit Auswählen und Aktionen > Atome/Bindungen > Löschen verwenden. Speichern Sie die unligandierte PDB, indem Sie Folgendes in die Befehlszeile eingeben: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 bezeichnet die Modell-ID. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.1 bis 2.1.2.4 für 7fd9.pdb. Öffnen Sie CCP-EM. Erstellen Sie ein neues Projekt mit dem Namen mGlu5 und geben Sie das Projektverzeichnis und den Benutzernamen an.Öffnen Sie Relion über die Optionen auf der linken Seite.Gehen Sie zur Registerkarte Maskenerstellung . Geben Sie eine der Halbkarten für EMD-31536 als Eingang an.HINWEIS: Relion akzeptiert Maps mit .mrc als Suffix, und die EMD-Maps haben das Suffix .map. Die Map-Dateien können in ChimeraX zur Überprüfung geöffnet und im .mrc-Format gespeichert werden. Geben Sie auf der Registerkarte “Maske ” die Pixelgröße auf 0,89 Å und den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,007 an. Führen Sie den Auftrag mit dem Alias 31536 (oder einem anderen Namen, der leicht zu verfolgen ist) aus. Erstellen Sie auf ähnliche Weise eine Maske für die halbe Karte EMD – 31537. Öffnen Sie das Programm Refmac Servalcat über die Optionen im linken Bereich in CCPEM.Geben Sie den Namen als mGlu5_agonist an. Importieren Sie die 7fd8_noligand_chainA .pdb-Datei, wie im Modellabschnitt 2.1.2.4 beschrieben. Geben Sie die Position der beiden halben Maps und der entsprechenden Maske an, die in Relion erstellt wurde. Geben Sie die Auflösung mit 3,8 Å an. Gehen Sie zu den Verfeinerungseinstellungen > Strikte Symmetrie und geben Sie C2 als Relion-Punktgruppensymmetrie an. Starten Sie das Programm, indem Sie die Starttaste oben drücken. Sobald der Job abgeschlossen ist, öffnen Sie das Ergebnis in Coot (Option oben im Ergebnisbereich verfügbar). Dadurch wird standardmäßig eine diffmap.mtz in Coot angezeigt, wobei die Farben Rot und Grün negative bzw. positive Dichten anzeigen.Gehen Sie im Darstellungsmanager > Eigenschaften der Differenzkarte mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT und ändern Sie die Konturebene auf 4,0 (absoluter Wert).HINWEIS: Die Wahl des Schwellenwerts hängt von der Karte und der Auflösung ab. Blenden Sie die Map mit der Bezeichnung FWT PHWT und das Molekül mit der Bezeichnung refined.pdb aus. Bewegen Sie die Karte mit der Maus, um die positive Dichte (grün) zu visualisieren und den größeren Blob in die Mitte zu bringen. Gehen Sie zu Datei > Monomer abrufen, geben Sie QUS ein und drücken Sie die Eingabetaste. Gehen Sie zu Berechnen > Modellierung > Starrkörper-Fit-Moleküls und doppelklicken Sie auf das QUS-Monomer , um das Molekül so anzupassen, dass es in die Fo-Fc-Dichte passt. Verwenden Sie die Option Molekül zusammenführen auf der Registerkarte Bearbeiten , um das QUS-Molekül zur Koordinatendatei refined.pdb hinzuzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4.3 bis 2.1.4.6, um den Liganden mit dem Monomercode NAG und CHS in den kleineren Blob in der extrazellulären bzw. an den oberen Rand der Transmembrandomäne einzupassen. Speichern Sie die Koordinate als refined_ligands.pdb.HINWEIS: Die Auflösung der Transmembran (TM)-Domäne ist geringer und wird daher hier nicht diskutiert. Verfeinerung der ligandierten Struktur von mGlu5Öffnen Sie CCPEM , klonen Sie den vorherigen Verfeinerungsauftrag (Schritt 2.1.3.2) und führen Sie ihn mit der Datei refined_ligands.pdb und der Sharpened Map (emd. 31536.mrc) als Eingabe unter Verwendung von Standardparametern und C2-Symmetrie.HINWEIS: Wenn das Programm den Liganden nicht erkennt, müssen die CIF-Dateien bereitgestellt werden. Diese CIF-Dateien können von der PDB heruntergeladen oder mit verschiedenen Programmen erzeugt werden (siehe Schritt 3.1.1 für Details). Visualisierung und Figurengenerierung in PyMOLÖffnen Sie das Modell refined_expanded.pdb aus dem neuesten Refmac-Einschränkungsauftrag in PyMOL. Gehen Sie zu Datei > Öffnen und navigieren Sie zum Refmac-Auftragsverzeichnis, um die Datei diffmap_normalised_fofc.mrc (Differenzzuordnung zum Servalcat-Auftrag in Schritt 2.1.3.2) zu laden.HINWEIS: Wenn die Dateien mit der Erweiterung .mrc beim Surfen nicht sichtbar sind, ändern Sie den Dateityp in Alle Dateien und durchsuchen Sie sie. Wählen Sie die Liganden über die Anzeige > Sequenz aus. Gehen Sie zur Schaltfläche Aktionen und benennen Sie die Auswahl in Liganden um. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.HINWEIS: Die Maschenweite kann angepasst werden. Hier wird eine Maschenweite von 0,2 verwendet, die mit dem folgenden Befehl eingestellt wird: set mesh_width=0,2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der Monomere und gehen Sie zu Kette > Farbe, um die Farbe jedes Monomers anzugeben. Färben Sie den Liganden und das Netz mit dem letzten Feld mit der Bezeichnung c in den Objekten Ligand und mesh_ligands ein. Das mGlu 5-Rezeptor-Dimer ist in einer Cartoon-Darstellung dargestellt, und die Monomere sind in Blaugrün und Weizen gefärbt. Die Liganden werden im Stick dargestellt, und das Netz, das die Liganden konturiert, ist grün gefärbt. Verwenden Sie die Aktionen > Option Ausrichten/Zentrieren/Zoomen gegen die Objekte und passen Sie sie manuell an, um das Netz klar und deutlich zu visualisieren. Wählen Sie die nahe gelegenen Reste aus, die mit dem Liganden interagieren könnten, z. B. Tyr64, Trp100 für QUS, und zeigen Sie bei Bedarf ihre Seitenkette oder Hauptkette oder beide als Stick-Darstellung an. Raytrace, um hochauflösende Bilder zu generieren und als PNG-Datei zu speichern.HINWEIS: Die obigen Schritte werden für die antagonistengebundene Karte EMD-31537 und die entsprechende Koordinatendatei PDB-7fd9 wiederholt. 3. Modellierung des Inhibitors, des Desoxygalacto-Nojirimycins (DGN) und der Lösungsmittelmoleküle in einer hochauflösenden, geschärften Karte der β-Galactosidase Identifizierung des Liganden DGN anhand der Halbkarten aus der KryoEMErstellung eines unbekannten Ligandenwörterbuchs für die Modellierung [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]HINWEIS: Die Deoxygalacto-nojirimycin-Wörterbuchdatei ist in der CCP4-Monomerbibliothek als DGJ (3-Buchstaben-Liganden-ID) enthalten. Nichtsdestotrotz wird es hier als neuer und unbekannter Ligand betrachtet, um den Prozess der Generierung von Wörterbuchdateien für unbekannte Liganden zu veranschaulichen, DGN wird als 3-Buchstaben-Code verwendet.Öffnen Sie die Zusammenfassung der Verbindung für Deoxygalacto-nojirimycin (DGN) auf der PubChem-Webseite, und kopieren Sie die Zeichenfolge für die Verbindung Deoxygalacto-nojirimycin. Öffnen Sie Phenix > Liganden > eLBOW. Geben Sie die Zeichenfolge “smiles” als Eingabe an. Geben Sie eine geeignete Methode zur Optimierung des Ligandenaufbaus an. Hier kommt eine einfache Optimierung zum Einsatz. Fügen Sie die Zeichenfolge “Chemical Smiles” in den Abschnitt “Ligandendefinition” ein. Geben Sie eine Stellenbezeichnung, ein Präfix für die Ausgabedatei und eine Liganden-ID entsprechend an, und drücken Sie auf Ausführen.HINWEIS: Die Ausgabe des Auftrags enthält eine Koordinatendatei (DGN.pdb) und eine Wörterbuchdatei (DGN.cif). Jligand29 kann auch verwendet werden, um die cif-Datei zu erstellen. Laden Sie die β-Galactosidase-Koordinatendatei (6tsh.pdb) aus der PDB herunter und entfernen Sie die Koordinaten für die Proteinketten (B, C, D), Liganden, DGN und andere Lösungsmittelmoleküle, indem Sie einen Texteditor verwenden oder die Option zum Löschen von Kette/Zone in Coot verwenden. Speichern Sie die Koordinatendatei als apo-betaGal_chainA.pdb.HINWEIS: ChimeraX oder Pymol können auch verwendet werden, um das Liganden-/Lösungsmittelmolekül zu entfernen. Laden Sie die halben Karten (emd_10563_half_map_1.map und emd_10563_half_map_2.map) aus zusätzlichen Daten des EMD-10563-Eintrags aus der EMDB herunter. Öffnen Sie CCPEM und verwenden Sie Relion , um die Maske für die Karte bei einem Schwellenwert von 0,01 zu erstellen (wie in den Schritten 2.1.3.1.1 bis 2.1.3.1.4 beschrieben). Führen Sie Servalcat (innerhalb der CCPEM-Suite, wie in Schritt 2 beschrieben) mit den in Schritt 3.1.3 erhaltenen Halbzuordnungen und dem Apo-Modell in Schritt 3.1.2 und der D2-Symmetrie aus.HINWEIS: Das Modell muss an einer der halben oder vollständigen Karten ausgerichtet werden, um die Ligandendichte zu lokalisieren. Dies kann erreicht werden, indem das Modell mit ChimeraX in die Karte eingepasst und dann die Koordinaten relativ zur Halbkarte gespeichert werden. In diesem Beispiel haben halbe Maps und die primäre Map in EMDB unterschiedliche Boxgrößen/Gitternetze, und das Modell muss in der halben Map platziert werden. Öffne das Blässhuhn.Öffnen Sie DGN.cif für das Ligandenwörterbuch, wie es in Schritt 3.1.1 mit Phenix eLBOW generiert wurde. Gehen Sie dazu zu Datei > CIF-Wörterbuch importieren und durchsuchen Sie das eLBOW-Job-Verzeichnis. Öffnen Sie die Protein- und Ligandenkoordinatendateien, apo-betaGal_chainA.pdb aus Schritt 3.1.2 bzw. DGN.pdb aus Schritt 3.1.6. Öffnen Sie automatisch die Datei diffmap.mtz aus dem Servalcat-Auftrag (Schritt 3.1.5), und visualisieren Sie die Map mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT in Coot. Konturieren Sie das Map bei einem Schwellenwert von ~ 4 absolutem Wert.HINWEIS: Es ist wichtig, die Zuordnungsstatistiken zu überprüfen, indem Sie die Kopfzeile map.mrc eingeben oder Werkzeuge in Chimera verwenden. Alle notwendigen Informationen über die Pixelgröße, die Boxgröße, die minimale, mittlere und maximale Dichte sowie die Effektivabweichung von der mittleren Dichte können abgerufen werden. Es ist wichtig, die Pixelgröße und die Boxgröße der KryoEM-Karten zu überprüfen. Die 3D-Karte stellt das Protein-Liganden-Kartenvolumen in einem Gitter von 3D-Voxeln dar. In jedem Voxel wird der Elektronenpotentialwert oder die Wahrscheinlichkeit, das Elektron an diesem Ort zu finden, gespeichert. Wenn ein bestimmter Schwellenwert ausgewählt wird, werden die Voxel, deren Dichte niedriger als der angegebene Wert ist, auf Null gesetzt. Dies trägt dazu bei, das experimentelle Rauschen in der Karte zu minimieren und die Kartenmerkmale besser zu visualisieren43. Daher sollte die Karte an einem Schwellenwert konturiert werden, bei dem die Kartenmerkmale gut sichtbar sind und das Rauschen in der Karte minimal ist. Gehen Sie zu Ligand > Liganden suchen. Wählen Sie im neuen Fenster, das angezeigt wird, den Liganden, die Differenzkarte und das Modell apo-betaGal_chainA.pdb aus. Belassen Sie die Standardeinstellungen für die anderen Optionen und klicken Sie auf Liganden suchen , um die Suche zu starten. Eine Liste der Top-Treffer, die die potenzielle Ligandendichte anzeigen, wird angezeigt, wobei in jeder der Dichten eine Kopie platziert wird. Überprüfen Sie manuell alle Treffer, bei denen der Ligand platziert wurde. Behalten Sie die wahrscheinlichsten Treffer bei und entfernen Sie die mehrdeutigen.HINWEIS: Der Unterschied in der Kartendichte bei einem hohen Schwellenwert deutet eindeutig auf das Vorhandensein des Liganden im aktiven Zentrum hin. Modellierung des Liganden DGN und der LösungsmittelmoleküleFühren Sie eine reale Raumverfeinerung in Coot durch, um den Liganden (DGN.pdb) in die Differenzdichtekarte einzupassen, und führen Sie dann die Ligandenkoordinaten mit der apo-betaGal_chainA.pdb zusammen, und speichern Sie sie als betaGal_chainA+ligand.pdb.HINWEIS: Die Liganden, die in Bereichen anderer Ketten platziert wurden, können entfernt werden und werden beim Speichern der zusammengeführten Koordinatendatei nicht zusammengeführt. Die Liganden in anderen Ketten können von NCS-Liganden erzeugt werden, wie in Beispiel 1, Schritt 1.2.8 gezeigt, oder in Refmac/Servalcat unter Verwendung der Symmetrieerweiterung. Führen Sie einen weiteren Servalcat-Auftrag wie oben (Schritt 3.1.5) mit betaGal_chainA+ligand.pdb als Eingabemodell und den Halbzuordnungen (aus Schritt 3.1.3) mit D2-Symmetrie aus. Die Differenzdichte (aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.2.2), die den modellierten Liganden umgibt, deutet auf das Vorhandensein der Lösungsmittelmoleküle hin, die mit dem Ligandenmolekül koordiniert sind. Die zentrale Dichte in der Nähe des Liganden scheint für Wassermoleküle zu groß zu sein. Basierend auf früheren biochemischen und strukturellen Daten, die auf das Vorhandensein von Mg2+ an dieser Position hinweisen, wird das Mg2+ -Ion hier modelliert, indem auf die Option Atom platzieren geklickt und das Atom als MG angegeben wird. Modellieren Sie Wassermoleküle in der Differenzdichte im aktiven Zentrum, die auf das Vorhandensein eines Lösungsmittelmoleküls hinweisen, indem Sie auf das Atom am Zeiger platzieren klicken und Wasser auswählen.HINWEIS: Coot hat auch die Möglichkeit, Wassermoleküle automatisch aufzunehmen. Da hier der Fokus nur auf dem aktiven Zentrum liegt, werden Wassermoleküle manuell zugegeben. Führen Sie die Koordinaten für Mg2+ und Wasser mit der Datei betaGal+ligand.pdb zusammen und speichern Sie sie als betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb. Führen Sie mit betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb eine Refmac-Verfeinerung in Servalcat mit D2-Symmetrie durch.HINWEIS: Die ausgegebene Differenzkarte aus diesem Job kann als Mittel zur Validierung dienen, um zu überprüfen, ob der Ligand genau modelliert wurde, da die Differenzkarte eine minimale verbleibende positive oder negative Dichte aufweisen sollte. Visualisierung und Figurengenerierung mit PyMOLHINWEIS: Die unten beschriebenen Schritte sind einige Beispiele für die Erstellung von Abbildungen unter Verwendung von Modellen und Karten, die zur Veranschaulichung des Vorhandenseins von Liganden und Lösungsmitteln verwendet werden können.Öffnen Sie die refined_expanded.pdb aus dem letzten Servalcat-Auftrag (Schritt 3.2.6) mit dem modellierten Liganden und Lösungsmittel. Wählen Sie verschiedene Ketten separat aus, um sie magenta, gelb, grün und blaugrün zu färben, wie in Beispiel 2 beschrieben. Wechseln Sie zu > Sequenz anzeigen, treffen Sie eine separate Auswahl für die Wassermoleküle, Magnesium und DGN, und benennen Sie die Objekte in Wasser, MG bzw. DGN um. Zeigen Sie MG- und Wassermoleküle als Kugeln an, indem Sie die Objekte auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und > Kugel anzeigen. Zeigen Sie auf ähnliche Weise den Liganden in der Stick-Darstellung an und färben Sie die Liganden und Lösungsmittel entsprechend ein. In diesem Fall wurde der Ligand von einem Heteroatom gelb gefärbt, das Magnesiumion ist violett gefärbt und Wassermoleküle sind rot gefärbt. Wählen Sie DGN-, MG- und Wassermoleküle aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie es als Liganden. Öffnen Sie die Datei diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um. Geben Sie den folgenden Befehl ein: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.HINWEIS: Die Carve-Option von 2 Å wird um die Atome herum angewendet, und je nach Auflösung und Qualität der Maps können Werte von 3-5 verwendet werden. Darüber hinaus ist es ratsam, beim Öffnen von KryoEM-Karten in PyMOL normalize_ccp4_maps aus zu stellen. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (sofern zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern. Speichern Sie die Szene als .png Datei.HINWEIS: Die folgenden Schritte sind optional und beschreiben den Prozess zur Visualisierung (1) der Differenzdichte (Fo-Fc) für den nicht modellierten Liganden DGN, (2) der Dichte (Fo) des modellierten Liganden DGN sowie der Differenzdichte (Fo-Fc) für nicht modellierte Lösungsmittel und schließlich für (3) die Dichte (Fo) für den modellierten Liganden DGN und die Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum. Um das Vorhandensein des Liganden, DGN und der umgebenden Lösungsmittelmoleküle anhand der Differenzkarte zu demonstrieren, öffnen Sie diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.1.5. Benennen Sie die Zuordnungsdatei in unliganded_fofc.mrc um, indem Sie neben dem Zuordnungsobjekt auf Aktionen > Umbenennen klicken. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2. Um die Dichte des modellierten Liganden DGN und die umgebende nicht modellierte Lösungsmitteldichte zu demonstrieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc sowie die diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem servalcat-Job in Schritt 3.2.2. Benennen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc in DGN_fo und die diffmap_normalised_fofc.mrc in DGN_unmodelled_solvents_fofc um. Wählen Sie MG und Wasser aus > Sequenz anzeigen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie sie als Lösungsmittel. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.HINWEIS: Die mesh_DGN_fo zeigt die Dichte des Liganden an, und die mesh_solvent_fofc zeigt die Auslassungsdichte für MG und Wasser an. Um schließlich die modellierten Liganden sowie die umgebenden Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum zu visualisieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um. Geben Sie folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.HINWEIS: Hier haben wir diffmap_normalised_fo.mrc verwendet, aber die endgültige geschärfte Karte kann verwendet werden, um die Dichte der Liganden und die umgebenden Reste zu zeigen. Es empfiehlt sich, den verwendeten Map-Typ, die Werte für die Schärfung des B-Faktors, in der Abbildungslegende zu erwähnen. Die Netzbreite und die Kugelgröße können durch Eingabe der folgenden Befehle eingestellt werden: Legen Sie mesh_width=0,2 fest und setzen Sie sphere_scale=0,25 , um die Kugelgröße zu verkleinern. Färben Sie das FO-Netz blau und das FOFC-Netz grün. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (wo zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern. Speichern Sie die einzelnen Szenen als .png Dateien. 4. Einfluss der Auflösung auf die Ligandenmodellierung in β-Galactosidase Öffnen Sie Terminal und gehen Sie in das Verzeichnis, das die beiden halben Maps enthält. Öffnen Sie die beiden Halbkarten (Schritt 3.1.3) im .map-Format in ChimeraX, visualisieren Sie sie und speichern Sie sie als emd10563_half1_1_unfil.mrc und emd10563_half2_1_unfil.mrc. Die in Schritt 3.1.4 erstellte Maske kann als Eingabe verwendet werden. Führen Sie einen PostProcessing-Job in Relion mit Halbzuordnungen und Masken aus den Schritten 4.2 bis 4.3 mit den Standardparametern aus. Wiederholen Sie Schritt 4.4, jetzt mit aktiviertem Skip FSC-Wiegen und Angabe eines Ad-hoc-Tiefpassfilters von 3 Å. Wiederholen Sie den Schritt 4.4 mit einem Ad-hoc-Tiefpassfilter von 3,5 Å. Öffnen Sie die Maps (postprocess.mrc) aus den Schritten 4.4 bis 4.6, filtern Sie mit unterschiedlichen Auflösungen, und die Modellkoordinate 6tsh.pdb (ausgerichtet an den Halbmaps in ChimeraX) aus Schritt 3.1.2 in PyMOL. Benennen Sie die verschiedenen Maps in 3.0, 3.5 und 2.3 um, je nach Auflösung.HINWEIS: Man kann die Tiefpassfilterung der Maps bestätigen, indem man sie in ChimeraX oder Coot visualisiert. Visualisieren Sie den Effekt der Auflösung auf die Dichte von Liganden- und Lösungsmittelmolekülen, indem Sie ein Netz von 2 Å um die Liganden- und Lösungsmittelmoleküle bei einem Schwellenwert von 6σ erstellen, wie in Schritt 3.3.6 beschrieben, mit Karten, die auf unterschiedliche Auflösungen gefiltert wurden.