Summary

Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt die Werkzeuge vor, die für die Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen zur Verfügung stehen.

Abstract

Die Entschlüsselung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen in einem makromolekularen Komplex ist entscheidend für das Verständnis des molekularen Mechanismus, der zugrunde liegenden biologischen Prozesse und der Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren hat sich die kryogene Probenelektronenmikroskopie (KryoEM) zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, um die Strukturen von Makromolekülen zu bestimmen und die Art der Ligandenbindung mit nahezu atomarer Auflösung zu untersuchen. Die Identifizierung und Modellierung von Nicht-Protein-Molekülen in KryoEM-Karten ist aufgrund der anisotropen Auflösung über das interessierende Molekül und des inhärenten Rauschens in den Daten oft eine Herausforderung. In diesem Artikel werden die Leser mit verschiedenen Softwares und Methoden vertraut gemacht, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zur Modellerstellung und zur Verfeinerung atomarer Koordinaten unter Verwendung ausgewählter Makromoleküle verwendet werden. Eine der einfachsten Möglichkeiten, das Vorhandensein eines Liganden zu identifizieren, wie am Enzym Enolase dargestellt, besteht darin, die beiden Karten zu subtrahieren, die mit und ohne Liganden erhalten wurden. Die zusätzliche Dichte des Liganden wird wahrscheinlich auch bei einem höheren Schwellenwert in der Differenzkarte hervorstechen. Es gibt Fälle, wie im Fall des metabotrope Glutamatrezeptors mGlu5 gezeigt, in denen solche einfachen Differenzkarten nicht erstellt werden können. Die kürzlich vorgestellte Methode zur Ableitung der Fo-Fc-Omit-Map kann als Werkzeug zur Validierung und Demonstration des Vorhandenseins des Liganden dienen. Schließlich wird am Beispiel der gut untersuchten β-Galactosidase der Effekt der Auflösung auf die Modellierung der Liganden und Lösungsmittelmoleküle in KryoEM-Karten analysiert und ein Ausblick darauf gegeben, wie KryoEM in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Introduction

Zellen erfüllen ihre Funktionen, indem sie unzählige chemische Reaktionen gleichzeitig und unabhängig voneinander durchführen, die jeweils akribisch reguliert werden, um ihr Überleben und ihre Anpassungsfähigkeit als Reaktion auf Umwelteinflüsse zu gewährleisten. Dies wird durch die molekulare Erkennung erreicht, die es Biomolekülen, insbesondere Proteinen, ermöglicht, mit anderen Makromolekülen sowie kleinen Molekülen oder Liganden transiente oder stabile Komplexe zu bilden1. Daher sind Protein-Liganden-Wechselwirkungen grundlegend für alle Prozesse in der Biologie, einschließlich der Regulation der Proteinexpression und -aktivität, der Erkennung von Substraten und Cofaktoren durch Enzyme sowie der Art und Weise, wie Zellen Signale wahrnehmen und weiterleiten 1,2. Ein besseres Verständnis der kinetischen, thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften des Protein-Liganden-Komplexes enthüllt die molekularen Grundlagen der Ligandeninteraktion und erleichtert auch ein rationales Wirkstoffdesign, indem die Wirkstoffinteraktion und Spezifität optimiert werden. Ein wirtschaftlicher und schnellerer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkung ist die Verwendung von molekularem Docking, einer computergestützten Methode, die virtuell eine Vielzahl kleiner Moleküle durchleuchtet und den Bindungsmodus und die Affinität dieser Liganden zu Zielproteinen vorhersagt3. Experimentelle Beweise aus hochauflösenden Strukturen, die durch Röntgenbeugung (XRD), Kernspinresonanz (NMR) oder Elektronenkryomikroskopie (KryoEM) bestimmt wurden, liefern jedoch den wesentlichen Beweis für solche Vorhersagen und helfen bei der Entwicklung neuerer und wirksamerer Aktivatoren oder Inhibitoren für ein bestimmtes Ziel. In diesem Artikel wird die Abkürzung “KryoEM” verwendet, da die Technik allgemein genannt wird. Es gibt jedoch eine anhaltende Debatte über die Wahl der richtigen Nomenklatur, und kürzlich wurde der Begriff Kryo-Gen-Probe Electron Microscopy (KryoEM) vorgeschlagen, um anzuzeigen, dass die Probe bei kryogener Temperatur ist und mit Elektronen abgebildetwird 4. In ähnlicher Weise wurden die von der KryoEM abgeleiteten Karten als Elektronenpotential, elektrostatisches Potential oder Coulomb-Potential bezeichnet, und der Einfachheit halber verwenden wir hier die KryoEM-Karten 5,6,7,8,9,10.

Obwohl die XRD die Goldstandardtechnik bei der hochauflösenden Strukturbestimmung von Protein-Liganden-Komplexen war, hat die KryoEM nach der Auflösungsrevolution11 an Dynamik gewonnen, wie der Anstieg der Coulomb-Potentialkarten oder KryoEM-Karten zeigt, die in den letzten Jahren in der Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 hinterlegt wurden14. Aufgrund von Fortschritten in der Probenvorbereitung, der Bildgebung und den Datenverarbeitungsmethoden stieg die Anzahl der Proteindatenbanken (PDB)14 mit KryoEM zwischen 2010 und 2020 von 0,7 % auf 17 %, wobei etwa 50 % der im Jahr 2020 gemeldeten Strukturen mit einer Auflösung von 3,5 Å oder besser bestimmt wurden15,16. Die KryoEM wurde von der Strukturbiologie, einschließlich der pharmazeutischen Industrie, schnell übernommen, da sie die Untersuchung flexibler und nichtkristalliner biologischer Makromoleküle, insbesondere von Membranproteinen und Multiproteinkomplexen, mit nahezu atomarer Auflösung ermöglicht, den Prozess der Kristallisation überwindet und gut beugende Kristalle erhält, die für die hochauflösende Strukturbestimmung durch XRD erforderlich sind.

Eine genaue Modellierung des Liganden in der KryoEM-Karte ist von größter Bedeutung, da er als Bauplan des Protein-Liganden-Komplexes auf molekularer Ebene dient. Es gibt mehrere automatisierte Ligandenbildungswerkzeuge, die in der Röntgenkristallographie verwendet werden und von der Form und Topologie der Ligandendichte abhängen, um den Liganden in die Elektronendichte 17,18,19,20 einzupassen oder aufzubauen. Wenn die Auflösung jedoch kleiner als 3 Å ist, führen diese Ansätze tendenziell zu weniger wünschenswerten Ergebnissen, da die topologischen Merkmale, von denen sie für die Erkennung und Erstellung abhängen, weniger definiert sind. In vielen Fällen haben sich diese Methoden als unwirksam erwiesen, wenn es darum geht, Liganden genau in KryoEM-Karten zu modellieren, da diese Karten im niedrigen bis mittleren Auflösungsbereich bestimmt wurden, typischerweise zwischen 3,5 Å und 5 Å17.

Der erste Schritt bei der 3D-Strukturbestimmung eines Protein-Liganden-Komplexes durch KryoEM besteht entweder darin, den Liganden mit dem Protein zu co-reinigen (wenn der Ligand eine hohe Bindungsaffinität zum Protein aufweist) oder die Inkubation der Proteinlösung mit dem Liganden für eine bestimmte Zeit vor der Gittervorbereitung. Anschließend wird ein kleines Probenvolumen auf ein plasmagereinigtes, löchriges TEM-Gitter aufgebracht, gefolgt von einem Schockfrosten in flüssigem Ethan und schließlich einer Bildgebung mit einem Kryo-TEM. Die 2D-Projektionsbilder von Hunderttausenden bis Millionen einzelner Teilchen werden gemittelt, um eine 3-dimensionale (3D) Coulomb-Potentialkarte des Makromoleküls zu rekonstruieren. Die Identifizierung und Modellierung von Liganden und Lösungsmittelmolekülen in diesen Karten stellt in vielen Fällen eine große Herausforderung dar, da die anisotrope Auflösung über die gesamte Karte (d. h. die Auflösung ist im gesamten Makromolekül nicht einheitlich), die Flexibilität in der Region, in der der Ligand gebunden ist, und das Rauschen in den Daten zu beachten ist. Viele der Modellierungs-, Verfeinerungs- und Visualisierungswerkzeuge, die für die XRD entwickelt wurden, werden nun für den Einsatz in der KryoEM für die gleichen Zwecke angepasst 18,19,20,21. In diesem Artikel wird ein Überblick über verschiedene Methoden und Software gegeben, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zum Aufbau von Modellen und zur Verfeinerung der aus der KryoEM abgeleiteten Koordinaten verwendet werden. Es wurde ein Schritt-für-Schritt-Protokoll erstellt, um die Prozesse bei der Modellierung von Liganden unter Verwendung spezifischer Protein-Liganden-Komplexe mit unterschiedlicher Auflösung und Komplexität zu veranschaulichen.

Der erste Schritt bei der Modellierung von Liganden in KryoEM-Karten umfasst die Identifizierung der Ligandendichte (Nicht-Protein) in der Karte. Wenn die Ligandenbindung keine Konformationsänderung im Protein induziert, dann hebt die Berechnung einer einfachen Differenzkarte zwischen dem Protein-Liganden-Komplex und dem Apo-Protein im Wesentlichen die Regionen mit zusätzlicher Dichte hervor, was auf das Vorhandensein des Liganden hindeutet. Solche Unterschiede können sofort beobachtet werden, da nur zwei Karten benötigt werden, und sogar Zwischenkarten während des Prozesses der 3D-Verfeinerung können verwendet werden, um zu überprüfen, ob der Ligand vorhanden ist. Wenn die Auflösung hoch genug ist (<3,0 Å), kann die Differenzkarte auch Einblicke in die Position von Wassermolekülen sowie von Ionen geben, die mit dem Liganden und den Proteinresten interagieren.

In Ermangelung der Apo-Protein-Karte ist es nun möglich, Servalcat22 zu verwenden, das als eigenständiges Tool verfügbar ist und im Rahmen der Refmac-Verfeinerung auch in die CCP-EM-Software-Suite 23,24 und in CCP4 8.0 Release25,26 integriert wurde. Servalcat ermöglicht die Berechnung einer FSC-gewichteten Differenzkarte (Fo-Fc) unter Verwendung der ungeschärften Halbkarten und des Apoproteinmodells als Eingabe. Die Fo-Fc-Auslassungskarte stellt die Diskrepanz zwischen der experimentellen Karte (Fo) und der vom Modell abgeleiteten Karte (Fc) dar. In Ermangelung eines Liganden im Modell deutet eine positive Dichte in einer Fo-Fc-Karte, die sich mit der experimentellen EM-Karte überschneidet, typischerweise auf das Vorhandensein des Liganden hin. Hier wird davon ausgegangen, dass die Proteinkette gut in die Karte eingepasst ist, und die verbleibende positive Dichte gibt an, wo sich der Ligand befindet. Es ist jedoch wichtig, akribisch zu untersuchen, ob die positive Dichte auf Modellierungsungenauigkeiten zurückzuführen ist, wie z. B. das falsche Rotamer einer Proteinseitenkette.

Der zweite Schritt besteht darin, aus den verfügbaren chemischen Informationen eine kartesische Koordinatendatei des Liganden mit wohldefinierter Geometrie zu erhalten oder zu erstellen. Standardliganden (z. B. ATP und NADP+), die bereits in der CCP4-Monomerbibliothek verfügbar sind, können zur Verfeinerung verwendet werden, indem die Koordinaten- und Geometriedateien über ihren Monomer-Zugangscode abgerufen werden. Für unbekannte oder nicht standardmäßige Liganden stehen jedoch verschiedene Werkzeuge zur Verfügung, um die Geometriedateien zu erstellen. Einige der Beispiele sind der eLBOW27 – (Electronic Ligand Builder and Optimization Workbench) in Phenix28, Lidia – ein eingebautes Tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32 – ein Modul von Glide innerhalb der Schrödinger-Suite. Die Ligandenkoordinatendatei wird dann in die Dichte eingepasst, wobei sowohl die experimentelle KryoEM-Karte als auch die Differenzkarte in Coot verwendet werden. Darauf folgt die Realraumverfeinerung in Phenix28 bzw. die reziproke Verfeinerung in Refmac33. Voraussetzung ist eine Linux-Workstation oder ein Laptop, der mit einer guten Grafikkarte und der oben genannten Software ausgestattet ist. Die meisten dieser Programme sind in verschiedenen Suiten enthalten. CCP-EM24 und Phenix28 sind für akademische Benutzer frei verfügbar und enthalten eine Vielzahl von Tools, die in diesem Artikel verwendet werden, darunter Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine usw. In ähnlicher Weise bieten Chimera37 und ChimeraX38 kostenlose Lizenzen für akademische Benutzer.

Protocol

1. Modellierung von Phosphoenolpyruvat (PEP) in Enolase aus Mycobacterium tuberculosis Identifizierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte des PEP-Enolase-KomplexesLaden Sie die ungeschärften Halbkarten (emd_30988_additional_1.map und emd_30988_additional_2.map) von Apo-Enolase aus den zusätzlichen Daten in EMDB herunter (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie ChimeraX (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Halbkarten von apo-enolase, indem Sie in der Symbolleiste auf Öffnen klicken und die Dateinamen auswählen. Geben Sie vop add #1 #2 in die Befehlszeile ein, um die beiden halben Maps zu kombinieren und die unscharfe Apo-Enolase-Karte zu erhalten.HINWEIS: #1 und #2 bezeichnen die beiden halben Karten für das apo-enolasische Enzym, wie in Schritt 1.1.1 erwähnt. Benennen Sie die kombinierte Map (ChimeraX-Map-ID: #3) um, indem Sie rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map eingeben. Färbt die Karte in der Modellgruppe grau ein. Die Karte zeigt, dass Enolase in der Lösung mit D4-Symmetrie oktamer ist. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 mit den folgenden Halbzuordnungen emd_30989_additional_1.map (Zuordnungs-ID: 4) und emd_30989_additional_2.map (Zuordnungs-ID: 5), um PEP-enolase-unsharpened-map (Zuordnungs-ID: #6) zu erhalten. Um eine Differenzkarte zu berechnen, passen Sie zunächst die beiden Maps (PEP-enolase und apo-enolase unsharpened maps aus Schritt 1.1.3 und Schritt 1.1.4) aneinander aneinander, indem Sie in ChimeraX im Map-Panel (Symbolleiste) auf Fit (map in map) klicken.HINWEIS: Zwischen den beiden Maps wird keine Normalisierung durchgeführt. In einigen Fällen kann eine Normalisierung erforderlich sein, um die Karten auf denselben Maßstab zu bringen. Subtrahieren Sie die PEP-enolase-Karte von der apo-enolase-Map, indem Sie vop subtract #6 #3 in die Befehlszeile eingeben.HINWEIS: #6 = PEP-enolasische ungeschärfte Karte, #3 = Apo-enolase ungeschärfte Karte. Färbe die subtrahierte Karte (Karten-ID:7) grün ein, was die positive Dichte angibt (gemäß der Konvention in der Röntgenkristallographie)39. Laden Sie die Koordinaten von M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) aus der Protein Data Bank (PDB) herunter, klicken Sie in der Symbolleiste auf Öffnen und wählen Sie den Dateinamen aus. Benennen Sie das Modell in 7e4x.pdb um, indem Sie rename #8 Apo_enolase.pdb in die Befehlszeile eingeben. #8 bezeichnet die Apo_enolase.pdb in ChimeraX. Wählen Sie das Modell in der Modellgruppe aus. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Rechte Maus. Klicken Sie auf Molekül verschieben, um das Modell in der Nähe der PEP-Enolase-Karte (#6) zu positionieren und das Modell in Bezug auf die Karte auszurichten. Passen Sie dieses Modell in die PEP-enolase-unsharpened-map ein, indem Sie fit #8 in #6 in der Befehlszeile eingeben. Hier ist die Karte mit 6 und das Modell mit 8 nummeriert.HINWEIS: In einigen Fällen reicht die lokale Anpassung in ChimeraX möglicherweise nicht aus, um das Modell auszurichten. In diesen Fällen kann ein zusätzlicher Schritt der globalen Anpassung (DockinMap, siehe Materialtabelle) in Phenix durchgeführt werden. Speichern Sie das angepasste Modell, indem Sie save Apo-enolase.pdb #8 in die Befehlszeile eingeben. Modellierung und Verfeinerung von PEP in der B-Faktor geschärften KryoEM-Karte des PEP-Enolase-KomplexesÖffnen Sie “coot” (siehe Materialtabelle) vom Terminal aus, indem Sie ./Coot & eingeben. Zeigen Sie “Apo-enolase.pdb” an, indem Sie auf Datei klicken > Koordinaten Apo-enolase.pdb öffnen. Die Koordinatendatei wird durch Bindungen (Farbe nach Atom) dargestellt. Laden Sie die PEP-gebundene Enolase sharpened map herunter, d.h. emd_30989.map von EMDB. Zeigen Sie dasselbe an, indem Sie auf Datei klicken > Karte öffnen > emd_30989.map . Stellen Sie den Schwellenwert auf 7,00 σ ein, indem Sie mit der mittleren Maustaste scrollen. Suchen Sie nach nicht modellierten Blobs, indem Sie auf > Nicht modellierten Blobs überprüfen > auf Blobs suchen klicken. Lokalisieren Sie die nicht modellierte Ligandendichte in der Nähe der Reste des aktiven Zentrums, Ser 42, Lys-386 und Arg-364 des Enolasemodells. Holen Sie sich die PEP-Monomer-Modelldatei aus der Coot-Monomer-Bibliothek, indem Sie auf Datei > Get Monomer klicken und PEP als 3-Buchstaben-Code eingeben. Verschieben Sie das PEP-Molekül auf die Dichte, indem Sie die Option Drehen/Verschieben- Zone/Kette/Molekül im Menü der Seitenleiste verwenden. Verwenden Sie die Realspace-Verfeinerung in Coot, um das PEP-Molekül in die Dichte einzupassen, indem Sie im Menü der Seitenleiste auf Real Space Refine Zone klicken. Führen Sie den angepassten Liganden mit der Apo-enolase.pdb zusammen, indem Sie die Option merge molecule auf der Registerkarte “Bearbeiten ” verwenden. Speichern Sie das Modell unter dem Namen PEP-Enolase.pdb.HINWEIS: Man kann auch die Option Ligand> Jiggle-Fit Ligand verwenden, um den Liganden ebenfalls anzupassen. Um Liganden zu den restlichen Monomeren in der Koordinatendatei hinzuzufügen, klicken Sie auf Berechnen > NCS-Tools > NCS-Liganden. Ein separates Fenster mit dem Namen “NCS-bezogene Liganden suchen” wird angezeigt. Wählen Sie für die Option Protein mit NCS die Koordinatendatei Apo-enolase.pdb und die Ketten-ID A als NCS-Masterkette aus.Wählen Sie für das Molekül, das den Liganden enthält, die Datei Apo-enolase.pdb als Koordinatendatei und die Ketten-ID, J und die Restnummer 1 bis 1 aus. Klicken Sie auf Kandidatenstellen suchen. Es erscheint ein Fenster mit dem Namen “Angepasste Liganden” mit einer Liste der Kandidatenpositionen. Bewerten Sie die Passung, indem Sie auf die einzelnen Kandidatenliganden klicken, und analysieren Sie die Anpassung visuell.HINWEIS: In Servalcat/Refmac kann nur ein Monomermodell bereitgestellt werden, und die bei der Rekonstruktion verwendete Symmetrie kann angegeben werden, um ein erweitertes Modell zu erhalten. Eine zusätzliche Dichte für die Lösungsmittelmoleküle wurde auch in der Nähe des Liganden beobachtet. Hochauflösende Kristallstrukturen von Enolase aus verschiedenen Homologen deuten auf das Vorhandensein von zwei Mg2+ Ionen40,41 hin, die wahrscheinlich die negative Ladung des Reaktionszwischenprodukts stabilisieren. Modellieren Sie zwei Mg2+-Ionen in der Dichte des aktiven Zentrums, indem Sie auf Atom platzieren am Zeiger klicken und MG aus der Liste Zeigeratomtyp auswählen.HINWEIS: Die Bindungsgeometrie und der Abstand können als Leitfaden für die Auswahl des Metallions verwendet werden. Im Fall von Mg2+ , das an Sauerstoffatome in Proteinresten gebunden ist, variiert der Bindungsabstand zwischen 2,1 Å und 2,4 Å bei einer oktaedrischen Geometrie. Bei Karten mit niedriger Auflösung ist die Koordinationssphäre jedoch oft unvollständig, und auch die Entfernung kann aufgrund von Einschränkungen in der Auflösung variieren. Schritt 1.2.8 wird wiederholt, um die Mg2+ -Ionen in die symmetriebezogenen Monomere aufzunehmen. Speichern Sie das Modell, indem Sie auf Datei > Koordinaten speichern > > Dateinamen auswählen klicken und Enolase+PEP+Mg.pdb eingeben. Öffnen Sie die Phenix-GUI (siehe Materialtabelle). Führen Sie einen realen Speichereinschränkungsauftrag mit Enolase+PEP+Mg.pdb und emd_30989.map als Eingabemodell bzw. Karte unter Verwendung von Standardparametern aus. Dieser Schritt wird iterativ mit Coot durchgeführt, um eine gute Anpassung des Kartenmodells und eine gute Geometrie zu erreichen.HINWEIS: Die unscharfe Differenzkarte wird verwendet, um das Vorhandensein eines Liganden zu demonstrieren, z. B. in einer Abbildung. Zu Modellierungszwecken wurde die geschärfte Karte mit dem B-Faktor verwendet, die empfohlen wird. Die geschärfte Karte mit dem B-Faktor kann auch zur Berechnung der Differenzkarte zu Demonstrationszwecken verwendet werden, im Gegensatz zur ungeschärften Karte. Wenn die Auflösung jedoch in dem Bereich, in dem der Ligand gebunden ist, niedriger ist, zeigt der einzelne B-Faktor, der zum Schärfen der gesamten Karte verwendet wird, die Ligandendichte möglicherweise nicht deutlich an. Visualisierung und Figurengenerierung des modellierten LigandenÖffnen Sie das verfeinerte Enolase+PEP+Mg-Modell aus dem endgültigen Phenix-Verfeinerungsauftrag in PyMOL42 (siehe Materialtabelle), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen. Laden Sie die emd-30989.map (PEP-bound sharpened map), indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und den Dateinamen auswählen. Benennen Sie die Map in PEP-sharpened um, indem Sie auf Aktionen > Umbenennen gegen das emd_30989 Objekt klicken und PEP-sharpened eingeben.HINWEIS: In den meisten Fällen, z. B. in enolase, werden die Maps beim Öffnen in pymol normalisiert, da die Option zum Normalisieren von Maps in pymol standardmäßig aktiviert ist. Da KryoEM-Karten auf einem größeren Kasten zentriert sind, umfasst die Normalisierung alles in dem Kasten. So kann die Normalisierung vor dem Öffnen in pymol ausgeschaltet werden. Wählen Sie die Liganden aus, indem Sie auf Anzeige > Sequenz klicken. Geben Sie isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste. Färben Sie das mesh_ligand blau, indem Sie auf das letzte Feld C neben dem mesh_ligand Objekt klicken. Zeigen Sie die Reste des aktiven Zentrums, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 und Lys-386, die mit PEP und Mg2+ in der Stick- bzw. Kugeldarstellung und dem Enzym Enolase in der Karikaturdarstellung interagieren. Raytrace, indem Sie ray 3600, 3600 eingeben, um Bilder in Publikationsqualität zu generieren und als PNG-Datei zu speichern, indem Sie auf Datei > Speichern klicken und PEP.png als Dateinamen auswählen. 2. Modellierung von Liganden im metabotrope Glutamatrezeptor mGlu5 Identifizierung und Modellierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte von Agonisten und antagonistengebundenem mGlu5Laden Sie die beiden Halbkarten zusammen mit den entsprechenden Koordinatendateien für jeden der Agonisten gebundenen (EMD-31536, 7fd8.pdb) und der antagonistisch gebundenen (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5-Komplexe herunter. Öffnen Sie ChimeraXÖffnen Sie die Koordinatendatei 7fd8.pdb, indem Sie auf Öffnen klicken und 7fd8.pdb auswählen. Geben Sie delete ligand in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste. Verwenden Sie auf ähnliche Weise den Befehl delete/B , um die Kette B zu löschen.HINWEIS: Liganden und Ketten können gelöscht werden, indem Sie das Dropdown-Menü oben mit Auswählen und Aktionen > Atome/Bindungen > Löschen verwenden. Speichern Sie die unligandierte PDB, indem Sie Folgendes in die Befehlszeile eingeben: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 bezeichnet die Modell-ID. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.1 bis 2.1.2.4 für 7fd9.pdb. Öffnen Sie CCP-EM. Erstellen Sie ein neues Projekt mit dem Namen mGlu5 und geben Sie das Projektverzeichnis und den Benutzernamen an.Öffnen Sie Relion über die Optionen auf der linken Seite.Gehen Sie zur Registerkarte Maskenerstellung . Geben Sie eine der Halbkarten für EMD-31536 als Eingang an.HINWEIS: Relion akzeptiert Maps mit .mrc als Suffix, und die EMD-Maps haben das Suffix .map. Die Map-Dateien können in ChimeraX zur Überprüfung geöffnet und im .mrc-Format gespeichert werden. Geben Sie auf der Registerkarte “Maske ” die Pixelgröße auf 0,89 Å und den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,007 an. Führen Sie den Auftrag mit dem Alias 31536 (oder einem anderen Namen, der leicht zu verfolgen ist) aus. Erstellen Sie auf ähnliche Weise eine Maske für die halbe Karte EMD – 31537. Öffnen Sie das Programm Refmac Servalcat über die Optionen im linken Bereich in CCPEM.Geben Sie den Namen als mGlu5_agonist an. Importieren Sie die 7fd8_noligand_chainA .pdb-Datei, wie im Modellabschnitt 2.1.2.4 beschrieben. Geben Sie die Position der beiden halben Maps und der entsprechenden Maske an, die in Relion erstellt wurde. Geben Sie die Auflösung mit 3,8 Å an. Gehen Sie zu den Verfeinerungseinstellungen > Strikte Symmetrie und geben Sie C2 als Relion-Punktgruppensymmetrie an. Starten Sie das Programm, indem Sie die Starttaste oben drücken. Sobald der Job abgeschlossen ist, öffnen Sie das Ergebnis in Coot (Option oben im Ergebnisbereich verfügbar). Dadurch wird standardmäßig eine diffmap.mtz in Coot angezeigt, wobei die Farben Rot und Grün negative bzw. positive Dichten anzeigen.Gehen Sie im Darstellungsmanager > Eigenschaften der Differenzkarte mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT und ändern Sie die Konturebene auf 4,0 (absoluter Wert).HINWEIS: Die Wahl des Schwellenwerts hängt von der Karte und der Auflösung ab. Blenden Sie die Map mit der Bezeichnung FWT PHWT und das Molekül mit der Bezeichnung refined.pdb aus. Bewegen Sie die Karte mit der Maus, um die positive Dichte (grün) zu visualisieren und den größeren Blob in die Mitte zu bringen. Gehen Sie zu Datei > Monomer abrufen, geben Sie QUS ein und drücken Sie die Eingabetaste. Gehen Sie zu Berechnen > Modellierung > Starrkörper-Fit-Moleküls und doppelklicken Sie auf das QUS-Monomer , um das Molekül so anzupassen, dass es in die Fo-Fc-Dichte passt. Verwenden Sie die Option Molekül zusammenführen auf der Registerkarte Bearbeiten , um das QUS-Molekül zur Koordinatendatei refined.pdb hinzuzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4.3 bis 2.1.4.6, um den Liganden mit dem Monomercode NAG und CHS in den kleineren Blob in der extrazellulären bzw. an den oberen Rand der Transmembrandomäne einzupassen. Speichern Sie die Koordinate als refined_ligands.pdb.HINWEIS: Die Auflösung der Transmembran (TM)-Domäne ist geringer und wird daher hier nicht diskutiert. Verfeinerung der ligandierten Struktur von mGlu5Öffnen Sie CCPEM , klonen Sie den vorherigen Verfeinerungsauftrag (Schritt 2.1.3.2) und führen Sie ihn mit der Datei refined_ligands.pdb und der Sharpened Map (emd. 31536.mrc) als Eingabe unter Verwendung von Standardparametern und C2-Symmetrie.HINWEIS: Wenn das Programm den Liganden nicht erkennt, müssen die CIF-Dateien bereitgestellt werden. Diese CIF-Dateien können von der PDB heruntergeladen oder mit verschiedenen Programmen erzeugt werden (siehe Schritt 3.1.1 für Details). Visualisierung und Figurengenerierung in PyMOLÖffnen Sie das Modell refined_expanded.pdb aus dem neuesten Refmac-Einschränkungsauftrag in PyMOL. Gehen Sie zu Datei > Öffnen und navigieren Sie zum Refmac-Auftragsverzeichnis, um die Datei diffmap_normalised_fofc.mrc (Differenzzuordnung zum Servalcat-Auftrag in Schritt 2.1.3.2) zu laden.HINWEIS: Wenn die Dateien mit der Erweiterung .mrc beim Surfen nicht sichtbar sind, ändern Sie den Dateityp in Alle Dateien und durchsuchen Sie sie. Wählen Sie die Liganden über die Anzeige > Sequenz aus. Gehen Sie zur Schaltfläche Aktionen und benennen Sie die Auswahl in Liganden um. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.HINWEIS: Die Maschenweite kann angepasst werden. Hier wird eine Maschenweite von 0,2 verwendet, die mit dem folgenden Befehl eingestellt wird: set mesh_width=0,2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der Monomere und gehen Sie zu Kette > Farbe, um die Farbe jedes Monomers anzugeben. Färben Sie den Liganden und das Netz mit dem letzten Feld mit der Bezeichnung c in den Objekten Ligand und mesh_ligands ein. Das mGlu 5-Rezeptor-Dimer ist in einer Cartoon-Darstellung dargestellt, und die Monomere sind in Blaugrün und Weizen gefärbt. Die Liganden werden im Stick dargestellt, und das Netz, das die Liganden konturiert, ist grün gefärbt. Verwenden Sie die Aktionen > Option Ausrichten/Zentrieren/Zoomen gegen die Objekte und passen Sie sie manuell an, um das Netz klar und deutlich zu visualisieren. Wählen Sie die nahe gelegenen Reste aus, die mit dem Liganden interagieren könnten, z. B. Tyr64, Trp100 für QUS, und zeigen Sie bei Bedarf ihre Seitenkette oder Hauptkette oder beide als Stick-Darstellung an. Raytrace, um hochauflösende Bilder zu generieren und als PNG-Datei zu speichern.HINWEIS: Die obigen Schritte werden für die antagonistengebundene Karte EMD-31537 und die entsprechende Koordinatendatei PDB-7fd9 wiederholt. 3. Modellierung des Inhibitors, des Desoxygalacto-Nojirimycins (DGN) und der Lösungsmittelmoleküle in einer hochauflösenden, geschärften Karte der β-Galactosidase Identifizierung des Liganden DGN anhand der Halbkarten aus der KryoEMErstellung eines unbekannten Ligandenwörterbuchs für die Modellierung [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]HINWEIS: Die Deoxygalacto-nojirimycin-Wörterbuchdatei ist in der CCP4-Monomerbibliothek als DGJ (3-Buchstaben-Liganden-ID) enthalten. Nichtsdestotrotz wird es hier als neuer und unbekannter Ligand betrachtet, um den Prozess der Generierung von Wörterbuchdateien für unbekannte Liganden zu veranschaulichen, DGN wird als 3-Buchstaben-Code verwendet.Öffnen Sie die Zusammenfassung der Verbindung für Deoxygalacto-nojirimycin (DGN) auf der PubChem-Webseite, und kopieren Sie die Zeichenfolge für die Verbindung Deoxygalacto-nojirimycin. Öffnen Sie Phenix > Liganden > eLBOW. Geben Sie die Zeichenfolge “smiles” als Eingabe an. Geben Sie eine geeignete Methode zur Optimierung des Ligandenaufbaus an. Hier kommt eine einfache Optimierung zum Einsatz. Fügen Sie die Zeichenfolge “Chemical Smiles” in den Abschnitt “Ligandendefinition” ein. Geben Sie eine Stellenbezeichnung, ein Präfix für die Ausgabedatei und eine Liganden-ID entsprechend an, und drücken Sie auf Ausführen.HINWEIS: Die Ausgabe des Auftrags enthält eine Koordinatendatei (DGN.pdb) und eine Wörterbuchdatei (DGN.cif). Jligand29 kann auch verwendet werden, um die cif-Datei zu erstellen. Laden Sie die β-Galactosidase-Koordinatendatei (6tsh.pdb) aus der PDB herunter und entfernen Sie die Koordinaten für die Proteinketten (B, C, D), Liganden, DGN und andere Lösungsmittelmoleküle, indem Sie einen Texteditor verwenden oder die Option zum Löschen von Kette/Zone in Coot verwenden. Speichern Sie die Koordinatendatei als apo-betaGal_chainA.pdb.HINWEIS: ChimeraX oder Pymol können auch verwendet werden, um das Liganden-/Lösungsmittelmolekül zu entfernen. Laden Sie die halben Karten (emd_10563_half_map_1.map und emd_10563_half_map_2.map) aus zusätzlichen Daten des EMD-10563-Eintrags aus der EMDB herunter. Öffnen Sie CCPEM und verwenden Sie Relion , um die Maske für die Karte bei einem Schwellenwert von 0,01 zu erstellen (wie in den Schritten 2.1.3.1.1 bis 2.1.3.1.4 beschrieben). Führen Sie Servalcat (innerhalb der CCPEM-Suite, wie in Schritt 2 beschrieben) mit den in Schritt 3.1.3 erhaltenen Halbzuordnungen und dem Apo-Modell in Schritt 3.1.2 und der D2-Symmetrie aus.HINWEIS: Das Modell muss an einer der halben oder vollständigen Karten ausgerichtet werden, um die Ligandendichte zu lokalisieren. Dies kann erreicht werden, indem das Modell mit ChimeraX in die Karte eingepasst und dann die Koordinaten relativ zur Halbkarte gespeichert werden. In diesem Beispiel haben halbe Maps und die primäre Map in EMDB unterschiedliche Boxgrößen/Gitternetze, und das Modell muss in der halben Map platziert werden. Öffne das Blässhuhn.Öffnen Sie DGN.cif für das Ligandenwörterbuch, wie es in Schritt 3.1.1 mit Phenix eLBOW generiert wurde. Gehen Sie dazu zu Datei > CIF-Wörterbuch importieren und durchsuchen Sie das eLBOW-Job-Verzeichnis. Öffnen Sie die Protein- und Ligandenkoordinatendateien, apo-betaGal_chainA.pdb aus Schritt 3.1.2 bzw. DGN.pdb aus Schritt 3.1.6. Öffnen Sie automatisch die Datei diffmap.mtz aus dem Servalcat-Auftrag (Schritt 3.1.5), und visualisieren Sie die Map mit der Bezeichnung DELFWT PHDELWT in Coot. Konturieren Sie das Map bei einem Schwellenwert von ~ 4 absolutem Wert.HINWEIS: Es ist wichtig, die Zuordnungsstatistiken zu überprüfen, indem Sie die Kopfzeile map.mrc eingeben oder Werkzeuge in Chimera verwenden. Alle notwendigen Informationen über die Pixelgröße, die Boxgröße, die minimale, mittlere und maximale Dichte sowie die Effektivabweichung von der mittleren Dichte können abgerufen werden. Es ist wichtig, die Pixelgröße und die Boxgröße der KryoEM-Karten zu überprüfen. Die 3D-Karte stellt das Protein-Liganden-Kartenvolumen in einem Gitter von 3D-Voxeln dar. In jedem Voxel wird der Elektronenpotentialwert oder die Wahrscheinlichkeit, das Elektron an diesem Ort zu finden, gespeichert. Wenn ein bestimmter Schwellenwert ausgewählt wird, werden die Voxel, deren Dichte niedriger als der angegebene Wert ist, auf Null gesetzt. Dies trägt dazu bei, das experimentelle Rauschen in der Karte zu minimieren und die Kartenmerkmale besser zu visualisieren43. Daher sollte die Karte an einem Schwellenwert konturiert werden, bei dem die Kartenmerkmale gut sichtbar sind und das Rauschen in der Karte minimal ist. Gehen Sie zu Ligand > Liganden suchen. Wählen Sie im neuen Fenster, das angezeigt wird, den Liganden, die Differenzkarte und das Modell apo-betaGal_chainA.pdb aus. Belassen Sie die Standardeinstellungen für die anderen Optionen und klicken Sie auf Liganden suchen , um die Suche zu starten. Eine Liste der Top-Treffer, die die potenzielle Ligandendichte anzeigen, wird angezeigt, wobei in jeder der Dichten eine Kopie platziert wird. Überprüfen Sie manuell alle Treffer, bei denen der Ligand platziert wurde. Behalten Sie die wahrscheinlichsten Treffer bei und entfernen Sie die mehrdeutigen.HINWEIS: Der Unterschied in der Kartendichte bei einem hohen Schwellenwert deutet eindeutig auf das Vorhandensein des Liganden im aktiven Zentrum hin. Modellierung des Liganden DGN und der LösungsmittelmoleküleFühren Sie eine reale Raumverfeinerung in Coot durch, um den Liganden (DGN.pdb) in die Differenzdichtekarte einzupassen, und führen Sie dann die Ligandenkoordinaten mit der apo-betaGal_chainA.pdb zusammen, und speichern Sie sie als betaGal_chainA+ligand.pdb.HINWEIS: Die Liganden, die in Bereichen anderer Ketten platziert wurden, können entfernt werden und werden beim Speichern der zusammengeführten Koordinatendatei nicht zusammengeführt. Die Liganden in anderen Ketten können von NCS-Liganden erzeugt werden, wie in Beispiel 1, Schritt 1.2.8 gezeigt, oder in Refmac/Servalcat unter Verwendung der Symmetrieerweiterung. Führen Sie einen weiteren Servalcat-Auftrag wie oben (Schritt 3.1.5) mit betaGal_chainA+ligand.pdb als Eingabemodell und den Halbzuordnungen (aus Schritt 3.1.3) mit D2-Symmetrie aus. Die Differenzdichte (aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.2.2), die den modellierten Liganden umgibt, deutet auf das Vorhandensein der Lösungsmittelmoleküle hin, die mit dem Ligandenmolekül koordiniert sind. Die zentrale Dichte in der Nähe des Liganden scheint für Wassermoleküle zu groß zu sein. Basierend auf früheren biochemischen und strukturellen Daten, die auf das Vorhandensein von Mg2+ an dieser Position hinweisen, wird das Mg2+ -Ion hier modelliert, indem auf die Option Atom platzieren geklickt und das Atom als MG angegeben wird. Modellieren Sie Wassermoleküle in der Differenzdichte im aktiven Zentrum, die auf das Vorhandensein eines Lösungsmittelmoleküls hinweisen, indem Sie auf das Atom am Zeiger platzieren klicken und Wasser auswählen.HINWEIS: Coot hat auch die Möglichkeit, Wassermoleküle automatisch aufzunehmen. Da hier der Fokus nur auf dem aktiven Zentrum liegt, werden Wassermoleküle manuell zugegeben. Führen Sie die Koordinaten für Mg2+ und Wasser mit der Datei betaGal+ligand.pdb zusammen und speichern Sie sie als betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb. Führen Sie mit betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb eine Refmac-Verfeinerung in Servalcat mit D2-Symmetrie durch.HINWEIS: Die ausgegebene Differenzkarte aus diesem Job kann als Mittel zur Validierung dienen, um zu überprüfen, ob der Ligand genau modelliert wurde, da die Differenzkarte eine minimale verbleibende positive oder negative Dichte aufweisen sollte. Visualisierung und Figurengenerierung mit PyMOLHINWEIS: Die unten beschriebenen Schritte sind einige Beispiele für die Erstellung von Abbildungen unter Verwendung von Modellen und Karten, die zur Veranschaulichung des Vorhandenseins von Liganden und Lösungsmitteln verwendet werden können.Öffnen Sie die refined_expanded.pdb aus dem letzten Servalcat-Auftrag (Schritt 3.2.6) mit dem modellierten Liganden und Lösungsmittel. Wählen Sie verschiedene Ketten separat aus, um sie magenta, gelb, grün und blaugrün zu färben, wie in Beispiel 2 beschrieben. Wechseln Sie zu > Sequenz anzeigen, treffen Sie eine separate Auswahl für die Wassermoleküle, Magnesium und DGN, und benennen Sie die Objekte in Wasser, MG bzw. DGN um. Zeigen Sie MG- und Wassermoleküle als Kugeln an, indem Sie die Objekte auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und > Kugel anzeigen. Zeigen Sie auf ähnliche Weise den Liganden in der Stick-Darstellung an und färben Sie die Liganden und Lösungsmittel entsprechend ein. In diesem Fall wurde der Ligand von einem Heteroatom gelb gefärbt, das Magnesiumion ist violett gefärbt und Wassermoleküle sind rot gefärbt. Wählen Sie DGN-, MG- und Wassermoleküle aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie es als Liganden. Öffnen Sie die Datei diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um. Geben Sie den folgenden Befehl ein: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.HINWEIS: Die Carve-Option von 2 Å wird um die Atome herum angewendet, und je nach Auflösung und Qualität der Maps können Werte von 3-5 verwendet werden. Darüber hinaus ist es ratsam, beim Öffnen von KryoEM-Karten in PyMOL normalize_ccp4_maps aus zu stellen. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (sofern zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern. Speichern Sie die Szene als .png Datei.HINWEIS: Die folgenden Schritte sind optional und beschreiben den Prozess zur Visualisierung (1) der Differenzdichte (Fo-Fc) für den nicht modellierten Liganden DGN, (2) der Dichte (Fo) des modellierten Liganden DGN sowie der Differenzdichte (Fo-Fc) für nicht modellierte Lösungsmittel und schließlich für (3) die Dichte (Fo) für den modellierten Liganden DGN und die Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum. Um das Vorhandensein des Liganden, DGN und der umgebenden Lösungsmittelmoleküle anhand der Differenzkarte zu demonstrieren, öffnen Sie diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem Servalcat-Job in Schritt 3.1.5. Benennen Sie die Zuordnungsdatei in unliganded_fofc.mrc um, indem Sie neben dem Zuordnungsobjekt auf Aktionen > Umbenennen klicken. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2. Um die Dichte des modellierten Liganden DGN und die umgebende nicht modellierte Lösungsmitteldichte zu demonstrieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc sowie die diffmap_normalised_fofc.mrc aus dem servalcat-Job in Schritt 3.2.2. Benennen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc in DGN_fo und die diffmap_normalised_fofc.mrc in DGN_unmodelled_solvents_fofc um. Wählen Sie MG und Wasser aus > Sequenz anzeigen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Aktionen > Kopieren in Objekt aus, und benennen Sie sie als Lösungsmittel. Geben Sie Folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.HINWEIS: Die mesh_DGN_fo zeigt die Dichte des Liganden an, und die mesh_solvent_fofc zeigt die Auslassungsdichte für MG und Wasser an. Um schließlich die modellierten Liganden sowie die umgebenden Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum zu visualisieren, öffnen Sie die diffmap_normalised_fo.mrc aus dem Servalcat-Auftrag in Schritt 3.2.6, und benennen Sie sie in ligand_fo.mrc um. Geben Sie folgendes in die Befehlszeile ein: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.HINWEIS: Hier haben wir diffmap_normalised_fo.mrc verwendet, aber die endgültige geschärfte Karte kann verwendet werden, um die Dichte der Liganden und die umgebenden Reste zu zeigen. Es empfiehlt sich, den verwendeten Map-Typ, die Werte für die Schärfung des B-Faktors, in der Abbildungslegende zu erwähnen. Die Netzbreite und die Kugelgröße können durch Eingabe der folgenden Befehle eingestellt werden: Legen Sie mesh_width=0,2 fest und setzen Sie sphere_scale=0,25 , um die Kugelgröße zu verkleinern. Färben Sie das FO-Netz blau und das FOFC-Netz grün. Verwenden Sie die Aktionen > Ausrichtungs-/Zoomoptionen und passen Sie sie manuell an, um die Liganden und nahe gelegene wechselwirkende Reste (wo zutreffend) zu visualisieren, wie in Schritt 2.3.7 gezeigt. Führen Sie Raytracing für diese Szenen durch, um hochauflösende Bilder mit dem Befehl ray 3600, 3600 zu speichern. Speichern Sie die einzelnen Szenen als .png Dateien. 4. Einfluss der Auflösung auf die Ligandenmodellierung in β-Galactosidase Öffnen Sie Terminal und gehen Sie in das Verzeichnis, das die beiden halben Maps enthält. Öffnen Sie die beiden Halbkarten (Schritt 3.1.3) im .map-Format in ChimeraX, visualisieren Sie sie und speichern Sie sie als emd10563_half1_1_unfil.mrc und emd10563_half2_1_unfil.mrc. Die in Schritt 3.1.4 erstellte Maske kann als Eingabe verwendet werden. Führen Sie einen PostProcessing-Job in Relion mit Halbzuordnungen und Masken aus den Schritten 4.2 bis 4.3 mit den Standardparametern aus. Wiederholen Sie Schritt 4.4, jetzt mit aktiviertem Skip FSC-Wiegen und Angabe eines Ad-hoc-Tiefpassfilters von 3 Å. Wiederholen Sie den Schritt 4.4 mit einem Ad-hoc-Tiefpassfilter von 3,5 Å. Öffnen Sie die Maps (postprocess.mrc) aus den Schritten 4.4 bis 4.6, filtern Sie mit unterschiedlichen Auflösungen, und die Modellkoordinate 6tsh.pdb (ausgerichtet an den Halbmaps in ChimeraX) aus Schritt 3.1.2 in PyMOL. Benennen Sie die verschiedenen Maps in 3.0, 3.5 und 2.3 um, je nach Auflösung.HINWEIS: Man kann die Tiefpassfilterung der Maps bestätigen, indem man sie in ChimeraX oder Coot visualisiert. Visualisieren Sie den Effekt der Auflösung auf die Dichte von Liganden- und Lösungsmittelmolekülen, indem Sie ein Netz von 2 Å um die Liganden- und Lösungsmittelmoleküle bei einem Schwellenwert von 6σ erstellen, wie in Schritt 3.3.6 beschrieben, mit Karten, die auf unterschiedliche Auflösungen gefiltert wurden.

Representative Results

Beispiel 1Das Enzym Enolase aus M. tuberculosis katalysiert den vorletzten Schritt der Glykolyse und wandelt 2-Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat (PEP) um, das ein essentielles Zwischenprodukt für mehrere Stoffwechselwege ist44,45. Die KryoEM-Daten für die Apo-Enolase- und PEP-gebundenen Enolase-Proben wurden bei der gleichen Pixelgröße von 1,07 Å erhoben, und die Bildverarbeitung wurde mit Relion 3.146,47</…

Discussion

Die Verbesserungen in der Mikroskop-Hard- und -Software haben in den letzten Jahren zu einer Zunahme der Anzahl von KryoEM-Strukturen geführt. Obwohl die derzeit höchste Auflösung, die in der Einzelpartikel-KryoEM erreicht wird, bei 1,2 Å 57,58,59 liegt, wird der Großteil der Strukturen mit einer Auflösung von etwa 3-4 Å bestimmt. Die Modellierung von Liganden in Karten mit mittlerer bis niedriger Auflösung kann schwieri…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SJ ist Empfänger des PhD-Stipendiums von DAE-TIFR, und die Finanzierung wird anerkannt. KRV bedankt sich für den DBT B-Life-Zuschuss DBT/PR12422/MED/31/287/2014 und die Unterstützung des Ministeriums für Atomenergie der indischen Regierung unter der Projektidentifikationsnummer RTI4006.

Materials

CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE
Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

Referenzen

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  13. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  14. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  15. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  16. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  17. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  18. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  19. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  20. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  21. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  22. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  23. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  24. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  25. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  26. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  28. Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  29. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  30. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
  31. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  32. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  33. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  34. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  35. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  36. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  37. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  38. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  39. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemie. 62 (3), 735-746 (2023).
  40. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  41. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  42. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  43. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  44. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  45. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  46. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  47. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  48. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  49. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  50. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  51. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  52. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  53. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  54. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  55. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  56. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  57. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  58. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  59. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  60. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  61. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  62. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  63. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  64. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  65. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  66. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

View Video