Summary

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Abstract

Kornea, gözü kaplayan şeffaf bir dokudur ve net görüş için çok önemlidir. Vücutta en çok innerve edilen dokudur. Bu innervasyon, göze duyu ve trofik fonksiyon sağlar ve kornea bütünlüğünün korunmasına katkıda bulunur. Bu innervasyonun patolojik bozulması nörotrofik keratit olarak adlandırılır. Bu, göz yaralanması, ameliyat veya hastalık ile tetiklenebilir. Bu çalışmada, klinikte genel olarak karşılaşılan üç tip vakayı özetleyecek şekilde innervasyona hasar vermek için üç farklı protokol öneriyoruz.

İlk yöntem, oftalmik bir çapak ile epitelin aşındırılmasından ibarettir. Bu, epitel tabakasının, serbest sinir uçlarının ve subbazal pleksusun klinikte yapılan fotorefraktif keratektomi ameliyatına benzer bir şekilde çıkarılmasını içerir. İkinci yöntem, epitelin bütünlüğünü koruyarak, biyopsi zımbası ile periferde kesitlere ayırarak innervasyonu hedefler. Bu yöntem, lameller keratoplastinin ilk adımlarına benzer ve innervasyonun dejenerasyonuna ve ardından merkezi korneadaki aksonların yeniden büyümesine yol açar. Son yöntem, floresan sinir liflerinin koterizasyon bölgesini spesifik olarak lokalize eden bir multifoton mikroskobu kullanarak transgenik bir fare modelinin innervasyonuna zarar verir. Bu yöntem, UV ışığına aşırı maruz kalma olan fotokeratit ile aynı hasarı verir.

Bu çalışmada kornea innervasyonunun fizyopatolojisini, özellikle aksonların dejenerasyonu ve rejenerasyonunu araştırmak için farklı seçenekler tanımlanmıştır. Rejenerasyonu teşvik etmek, epitel kusurları ve hatta korneanın delinmesi gibi komplikasyonlardan kaçınmak için çok önemlidir. Önerilen modeller, sinir rejenerasyonunu artıran ve hastalığın ilerlemesini sınırlayan yeni farmakolojik moleküllerin veya gen terapisinin test edilmesine yardımcı olabilir.

Introduction

Gözün saydam yüzeyi olan kornea, epitel, stroma ve endotel olmak üzere üç ayrı katmandan oluşur. Bu organ vücuttaki en yüksek innervasyon yoğunluğuna sahiptir ve esas olarak trigeminal ganglionun oftalmik dalından kaynaklanan duyusal liflerden (Aδ ve C tipleri) oluşur. Duyusal lifler, stromanın ortasında korneanın çevresine, yüzeyi kaplamak için dallanan büyük demetler şeklinde nüfuz eder. Daha sonra Bowmann’ın zarını delmek için çatallanırlar ve korneanın merkezinde bir girdap oluşumuyla kolayca tanınabilen subbazal pleksusu oluştururlar. Bu lifler epitelin dış yüzeyinde serbest sinir uçları olarak sonlanır. Termal, mekanik ve kimyasal uyaranları iletebilir ve epitel homeostazıiçin gerekli olan trofik faktörleri serbest bırakabilirler 1,2. Nörotrofik keratit (NK), kornea duyu innervasyonunu etkileyen dejeneratif bir hastalıktır. Bu nadir hastalık, korneanın daha düşük gözyaşı üretimi ve zayıf iyileşme özellikleri ile sonuçlanan kornea duyarlılığının azalması veya kaybından kaynaklanır3. NK, hastaların epitel kusurlarından muzdarip olduğu evre 1’den, stromal erime ve/veya kornea perforasyonunun meydana geldiği evre 3’ekadar iyi tanımlanmış üç aşamadan geçer 4.

Klinik olarak, bu hastalığın kökenleri çeşitli olabilir. Hastalar gözün fiziksel yaralanması, ameliyat veya diyabetgibi kronik hastalıklar nedeniyle kornea innervasyonunu kaybedebilir 5,6. Bugüne kadar, NK patogenez süreci tam olarak anlaşılamamıştır ve bu görmeyi tehdit eden durum için terapötik seçenekler çok sınırlıdır. Bu nedenle, bu liflerin rejenerasyonunun arkasındaki mekanizmaları daha iyi anlamak ve potansiyel olarak onları teşvik etmek için epitel kusurlarının özelliklerinin daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Burada, farelerde NK’yi indükleyen birkaç kornea hasarı modeli öneriyoruz.

İlk model, korneanın epitel tabakasının oküler çapak ile aşınmasıdır. Bu model esas olarak kemirgenler ve balıklar gibi farklı hayvanlardaepitelin yenilenmesi bağlamında incelenmiştir 7,8,9 ve kornea iyileşmesini destekleyen molekülleri test etmekiçin 10,11. Fizyolojik olarak epitel hücrelerinin yarayı kapatması 2-3 gün sürer. Bununla birlikte, innervasyonun fizyolojik paterni, aşınmadan kurtulmak için dört haftadan fazla sürer12,13. Ameliyat sırasında oküler çapak, subbazal pleksus ve liflerin serbest sinir uçlarını içeren korneanın epitel tabakasını çıkarır. Bu prosedür, göz kırma kusurlarını düzeltmek için fotorefraktif keratektomi (PRK) olan hastalarla klinik olarak karşılaştırılabilir. Prosedür, kornea epitelinin çıkarılması ve ardından stromanın bir lazerle yeniden şekillendirilmesindenoluşur 14. Hastalar bu tür bir ameliyattan sonra kornea sinir yoğunluğunun 2 yıl boyunca azalması ve ameliyattan sonra 3 aydan bir yıla kadar hassasiyette azalma gibi çeşitli yan etkiler yaşayabilirler15. Ameliyatın kornea mikroçevresinin kırılganlığına neden olduğu göz önüne alındığında, bu model bu yan etkilerin araştırılmasına ve daha hızlı reinnervasyonu teşvik edecek terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olabilir, böylece söz konusu yan etkileri azaltabilir.

İkinci model, korneanın çevresindeki aksonların bir biyopsi zımbası ile kesilmesinden oluşur ve merkezi innervasyonun Wallerian dejenerasyonunu indükler 16. Klinik olarak, bu yöntem, cerrahın korneanın ön kalınlığının bir kısmını çıkarmak ve onu bir donör nakli ile değiştirmek için korneanın kısmi trefinasyonunu gerçekleştirdiği anterior lameller keratoplasti ile karşılaştırılabilir 17. Lameller keratoplastiyi takiben, hastalar kuru göz, kornea innervasyon kaybı ve greft reddi gibi bir dizi semptomdan muzdarip olabilir18. Kornea sinirleri üzerinde gerçekleştirilen bu aksotomi modeli, bir greftten sonra meydana gelen lif dejenerasyonu mekanizmaları ve ardından aksonların rejenerasyonu hakkında fikir verebilir.

Üçüncü yöntem ise kornea sinirlerine lazerle zarar verir. Anestezi uygulanmış hayvanların korneasında multifoton mikroskobu kullanılarak, reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu sonucunda optik alanda lokalize olan sinirlerin dejenerasyonu indüklenir, bu da DNA hasarına ve hücresel kavitasyonayol açar 19. Bu yöntem, ROS oluşumunu tetikleyen ve DNA hasarına yol açan doğal UV’ye (güneş yanığı) aşırı maruz kalmanın neden olduğu kornea fotohasarını özetler20. Kornea güneş yanığından muzdarip hastalar, epitel hücrelerinin bozulması kornea liflerinin ekstremitelerini tamamen mahrum bıraktığı için büyük acı yaşarlar.

Burada açıklanan üç yöntem, NK patogenez sürecinin ve akson rejenerasyonunun araştırılmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Kolayca tekrarlanabilir ve hassastırlar. Ayrıca, hayvanların hızlı bir şekilde iyileşmesini ve kolay izlenmesini sağlarlar.

Protocol

Tüm deneyler Ulusal Hayvan Deney Kurulu tarafından onaylandı. 1. Hazırlıklar Anestezi için anestezik bir ketamin-ksilazin çözeltisi hazırlayın. 200 μL ketamin (100 mg/mL) ve 125 μL ksilazin (20 mg/mL) 2.175 mL steril% 0.9 NaCl içinde seyrelterek 80 mg / kg’da ketamin ve 10 mg / kg’da ksilazin enjekte edin. 1.400 mL steril %0.9 NaCl’ye 100 μL 0.3 mg/mL buprenorfin ekleyerek analjezik çözelti olarak 0.02 mg/mL buprenorfin çözeltisi hazırlay…

Representative Results

Bu çalışma, farelerde kornea innervasyonuna zarar vermek için çeşitli protokoller önermektedir. Epitel iyileşmesinin fizyopatolojisini araştırmak için benzer protokoller kullanılmış olsa da, kornea innervasyon rejenerasyonunu araştırmak için yeni yöntemler uyarlamayı ve geliştirmeyi seçtik. İnnervasyonu gözlemlemek için iki teknik kullandık. İlk olarak, bir pan-nöronal antikor (BIII tubulin) ve çekirdekleri bir interkalatör kullanarak sinir liflerini boyamak için bir immünofloresan tekniği…

Discussion

Nörotrofik keratit, 10.000 kişiden 5’ini etkileyen nadir bir hastalık olarak kabul edilir. Bununla birlikte, kimyasal yanıklar gibi fiziksel bir yaralanma veya diyabet veya multipl skleroz gibi sendromlar nedeniyle NK’dan muzdarip kişiler bu istatistiklere dahil edilmemiştir3. Ayrıca, bu durum önemli ölçüde yetersiz teşhis edilmektedir22 ve hastalığın prevalansı hafife alınmaktadır. Hastaların görüşünü korumanın bir yolu olarak akson rejenerasyonunu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, transgenik fare hattı MAGIC-Markers’a erişim için Dr. Karine Loulier’e teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04, “Gelecek için yatırımlar”) tarafından desteklenen Fransa-BioImaging ulusal altyapısının bir üyesi olan RAM-Neuro hayvan çekirdek tesisine ve görüntüleme tesisi MRI’ye teşekkür eder. Bu araştırma ATIP-Avenir programı, Inserm, Région Occitanie, Montpellier Üniversitesi, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Rejeneratif Tıp, REP202110014140) ve Groupama Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium

References

  1. Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
  2. Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
  3. Dua, H. S., et al. Neurotrophic keratopathy. Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).
  4. Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. Neurotrophic keratitis. Eye. 17 (8), 989-995 (2003).
  5. Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
  6. Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , (2023).
  7. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  8. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
  9. Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
  10. Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
  11. Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
  12. Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
  13. He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
  14. Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
  15. Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
  16. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  17. Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. Lamellar corneal transplantation. Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).
  18. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
  19. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  20. Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
  23. Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
  24. Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
  25. Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
  26. Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. Lamellar keratoplasty techniques. Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).
  27. Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).

Play Video

Cite This Article
Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).

View Video