Summary

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

Abstract

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.

השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.

מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

Introduction

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיסאפיתל 1,2. Neurotrophic keratitis (NK) היא מחלה ניוונית המשפיעה על עצבוב חושי הקרנית. מחלה נדירה זו נובעת מירידה או אובדן רגישות בקרנית הגורמת לייצור דמעות נמוך יותר ולתכונות ריפוי לקויות של הקרנית3. NK מתקדם דרך שלושה שלבים המתוארים היטב, משלב 1 שבו חולים סובלים ממומים אפיתליאליים, לשלב 3 שבו סטרומה נמסה ו / או ניקוב הקרנית להתרחש4.

מבחינה קלינית, מקורותיה של מחלה זו יכולים להיות מגוונים. חולים יכולים לאבד עצבוב הקרנית לאחר פגיעה פיזית בעין, ניתוח, או באמצעות מחלות כרוניות, כגון סוכרת 5,6. עד כה, תהליך הפתוגנזה של NK נותר מובן היטב, והאפשרויות הטיפוליות למצב מסכן ראייה זה מוגבלות מאוד. לכן, יש צורך בהבנה טובה יותר של המאפיינים של פגמים אפיתליאליים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים מאחורי התחדשות סיבים אלה ולקדם אותם. כאן, אנו מציעים מספר מודלים של פגיעה בקרנית הגורמת NK בעכברים.

המודל הראשון הוא שחיקה של שכבת האפיתל של הקרנית עם בור העין. מודל זה נחקר בעיקר בהקשר של התחדשות האפיתל בבעלי חיים שונים, כגון מכרסמים ודגים 7,8,9, וכדי לבדוק מולקולות המקדמות ריפוי קרנית10,11. מבחינה פיזיולוגית, לוקח 2-3 ימים לתאי האפיתל לסגור את הפצע. הדפוס הפיזיולוגי של העצבוב, לעומת זאת, לוקח יותר מארבעה שבועות להתאושש מהשחיקה12,13. במהלך הניתוח, בור העין מסיר את שכבת האפיתל של הקרנית המכילה את המקלעת התת-בזאלית ואת קצות העצבים החופשיים של הסיבים. הליך זה ניתן להשוות קלינית לחולים עם keratectomy photorefractive (PRK) כדי לתקן פגמים שבירה בעין. ההליך מורכב מהסרת האפיתל של הקרנית ולאחר מכן עיצוב מחדש של הסטרומה עם לייזר14. חולים יכולים לחוות מספר תופעות לוואי לאחר ניתוח כזה, כגון ירידה בצפיפות עצב הקרנית למשך שנתיים וירידה ברגישות למשך 3 חודשים עד שנה לאחר הניתוח15. בהתחשב בכך שהניתוח גורם לשבריריות של מיקרו-סביבה בקרנית, מודל זה יכול לסייע לחקור תופעות לוואי אלה ולפתח גישות טיפוליות שיקדמו עצבוב מחדש מהיר יותר, ובכך להפחית את תופעות הלוואי המדוברות.

המודל השני מורכב מחיתוך האקסונים בשולי הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיה, הגורם לניוון וולרי של העצבוב המרכזי 16. מבחינה קלינית, ניתן להשוות שיטה זו לקרטופלסטיקה למלרית קדמית, שבה המנתח מבין טרפינציה חלקית של הקרנית כדי להסיר חלק מהעובי הקדמי של הקרנית ולהחליפו בהשתלת תורם 17. לאחר קרטופלסטיקה למלרית, חולים עלולים לסבול ממספר תסמינים, כולל עין יבשה, אובדן עצבוב הקרנית ודחיית השתל18. מודל אקסוטומיה זה המבוצע על עצבי הקרנית יכול לספק תובנה לגבי מנגנוני ניוון הסיבים, המתרחש לאחר השתלה, ואחריה התחדשות האקסונים.

השיטה השלישית פוגעת בעצבי הקרנית באמצעות לייזר. על ידי שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון על הקרנית של בעלי חיים מורדמים, ניוון העצבים הממוקמים בשדה האופטי מושרה כתוצאה מהיווצרות מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שמוביל לנזק לדנ”א ולקוויטציה תאית19. שיטה זו משחזרת את נזקי האור של הקרנית הנגרמים על ידי חשיפת יתר לקרינת UV טבעית (כוויות שמש), אשר גם מפעילה היווצרות ROS, מה שמוביל לנזק לדנ”א20. חולים הסובלים מכוויות שמש בקרנית חווים כאב רב, שכן הידרדרות תאי האפיתל שוללת את הגפיים של סיבי הקרנית מכל.

שלוש השיטות המתוארות כאן נועדו לאפשר חקירה של תהליך הפתוגנזה NK והתחדשות אקסונים. הם ניתנים לשחזור ומדויקים בקלות. יתר על כן, הם מאפשרים התאוששות מהירה וניטור קל של בעלי החיים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים. 1. הכנות הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ”ג/ק”ג וקסילזין ב-10 מ”ג/ק”ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ”ג/מ”ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ”ג/מ”ל) ב-2,175 מ”ל של 0.9% NaCl סטרילי. הכ…

Representative Results

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיב?…

Discussion

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו3. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי22, ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. י…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר קארין לולייה על הגישה לקו העכבר המהונדס MAGIC-Markers. המחברים מודים גם למתקן הליבה של בעלי החיים RAM-Neuro ולמתקן ההדמיה MRI, חבר בתשתית הלאומית צרפת-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04, “השקעות לעתיד”). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, אוניברסיטת מונפלייה, סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140), וקרן Groupama.

Materials

0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium

References

  1. Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).
  2. Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).
  3. Dua, H. S., et al. Neurotrophic keratopathy. Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).
  4. Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. Neurotrophic keratitis. Eye. 17 (8), 989-995 (2003).
  5. Barrientez, B., et al. Corneal Injury: Clinical and molecular aspects. Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).
  6. Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. Corneal Injury. StatPearls. , (2023).
  7. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  8. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).
  9. Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure. bioRxiv. , (2021).
  10. Yang, L., et al. Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor. Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).
  11. Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-κB c-Rel. Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).
  12. Downie, L. E., et al. Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice. Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).
  13. He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).
  14. Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. Corneal reinnervation following refractive surgery treatments. Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).
  15. Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).
  16. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  17. Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. Lamellar corneal transplantation. Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).
  18. Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).
  19. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  20. Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. UV protection in the cornea: Failure and rescue. Biology. 11 (2), 278 (2022).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Dana, R., et al. Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy. BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).
  23. Matsumoto, Y., et al. Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy. Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).
  24. Bonini, S., et al. Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis. Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).
  25. Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain. Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).
  26. Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. Lamellar keratoplasty techniques. Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).
  27. Gautier, B., et al. AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).

Play Video

Cite This Article
Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).

View Video