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Neurosciences

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Published: December 08, 2023
doi:
10.3791/66182
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1Institute for Neurosciences of Montpellier,University of Montpellier, INSERM, 2Department of Ophthalmology,Gui de Chauliac Hospital

Summary

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Abstract

La cornée est un tissu transparent qui recouvre l’œil et qui est crucial pour une vision claire. C’est le tissu le plus innervé du corps. Cette innervation procure sensation et fonction trophique à l’œil et contribue à préserver l’intégrité cornéenne. La perturbation pathologique de cette innervation est appelée kératite neurotrophique. Cela peut être déclenché par une blessure à l’œil, une intervention chirurgicale ou une maladie. Dans cette étude, nous proposons trois protocoles différents pour infliger des dommages à l’innervation de manière à récapituler les trois types de cas généralement rencontrés en clinique.

La première méthode consiste à effectuer une abrasion de l’épithélium à l’aide d’une fraise ophtalmique. Cela implique l’ablation de la couche épithéliale, des terminaisons nerveuses libres et du plexus sous-basal d’une manière similaire à la chirurgie de kératectomie photoréfractive réalisée en clinique. La deuxième méthode ne cible l’innervation qu’en la sectionnant à la périphérie avec un poinçon de biopsie, en maintenant l’intégrité de l’épithélium. Cette méthode est similaire aux premières étapes de la kératoplastie lamellaire et conduit à une dégénérescence de l’innervation suivie d’une repousse des axones dans la cornée centrale. Cette dernière méthode endommage l’innervation d’un modèle de souris transgénique à l’aide d’un microscope multiphotonique, qui localise spécifiquement le site de cautérisation des fibres nerveuses fluorescentes. Cette méthode inflige les mêmes dommages que la photokératite, c’est-à-dire une surexposition aux rayons UV.

Cette étude décrit différentes options pour étudier la physiopathologie de l’innervation cornéenne, en particulier la dégénérescence et la régénération des axones. Favoriser la régénération est crucial pour éviter des complications telles que des défauts de l’épithélium ou même une perforation de la cornée. Les modèles proposés peuvent aider à tester de nouvelles molécules pharmacologiques ou des thérapies géniques qui améliorent la régénération nerveuse et limitent la progression de la maladie.

Introduction

La cornée, qui est la surface transparente de l’œil, est composée de trois couches distinctes : l’épithélium, le stroma et l’endothélium. Cet organe a la plus forte densité d’innervation dans le corps et est composé principalement de fibres sensorielles (types Aδ et C) provenant de la branche ophtalmique du ganglion trijumeau. Les fibres sensorielles pénètrent à la périphérie de la cornée dans le stroma moyen sous la forme de gros faisceaux qui se ramifient pour couvrir la surface. Ils bifurquent ensuite pour percer la membrane de Bowmann et former le plexus sous-basal, facilement reconnaissable par la formation d’un vortex au centre de la cornée. Ces fibres se terminent par des terminaisons nerveuses libres à la surface externe de l’épithélium. Ils sont capables de transduire des stimuli thermiques, mécaniques et chimiques et de libérer des facteurs trophiques essentiels à l’homéostasie de l’épithélium 1,2. La kératite neurotrophique (NK) est une maladie dégénérative affectant l’innervation sensorielle cornéenne. Cette maladie rare provient d’une diminution ou d’une perte de sensibilité cornéenne qui se traduit par une baisse de la production de larmes et de mauvaises propriétés cicatrisantes de la cornée3. La NK progresse à travers trois stades bien décrits, du stade 1 où les patients souffrent de défauts épithéliaux, au stade 3 où une fusion stromale et/ou une perforation cornéennese produisent 4.

Cliniquement, les origines de cette maladie peuvent être diverses. Les patients peuvent perdre l’innervation cornéenne après une blessure physique à l’œil, une intervention chirurgicale ou à la suite de maladies chroniques, telles que le diabète 5,6. À ce jour, le processus de pathogenèse NK reste mal compris, et les options thérapeutiques pour cette maladie menaçant la vue sont très limitées. Par conséquent, une meilleure compréhension des caractéristiques des défauts épithéliaux est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la régénération de ces fibres et potentiellement les favoriser. Ici, nous proposons plusieurs modèles de lésions cornéennes qui induisent la NK chez la souris.

Le premier modèle est l’abrasion de la couche épithéliale de la cornée avec une bavure oculaire. Ce modèle a été principalement étudié dans le cadre de la régénération de l’épithélium chez différents animaux, tels que les rongeurs et les poissons 7,8,9, et pour tester des molécules favorisant la cicatrisation cornéenne10,11. Physiologiquement, il faut 2 à 3 jours pour que les cellules épithéliales referment la plaie. Le schéma physiologique de l’innervation, cependant, prend plus de quatre semaines pour se remettre de l’abrasion12,13. Au cours de la chirurgie, la bavure oculaire enlève la couche épithéliale de la cornée qui contient le plexus sous-basal et les terminaisons nerveuses libres des fibres. Cette procédure peut être comparée cliniquement aux patients ayant subi une kératectomie photoréfractive (PKR) pour corriger les défauts de réfraction oculaire. L’intervention consiste à enlever l’épithélium de la cornée puis à remodeler le stroma à l’aide d’un laser14. Les patients peuvent ressentir plusieurs effets secondaires à la suite d’une telle chirurgie, tels qu’une diminution de la densité du nerf cornéen pendant 2 ans et une réduction de la sensibilité pendant une durée de 3 mois à un an après la chirurgie15. Étant donné que la chirurgie induit une fragilité du microenvironnement cornéen, ce modèle pourrait permettre d’étudier ces effets secondaires et de développer des approches thérapeutiques qui favoriseraient une réinnervation plus rapide, réduisant ainsi les effets secondaires en question.

Le second modèle consiste à sectionner les axones à la périphérie de la cornée à l’aide d’un poinçon de biopsie, induisant une dégénérescence wallérienne de l’innervation centrale 16. Cliniquement, cette méthode pourrait être comparée à la kératoplastie lamellaire antérieure, dans laquelle le chirurgien réalise une trépanation partielle de la cornée pour enlever une partie de l’épaisseur antérieure de la cornée et la remplacer par une greffe de donneur 17. Après une kératoplastie lamellaire, les patients peuvent souffrir d’un certain nombre de symptômes, notamment la sécheresse oculaire, la perte de l’innervation cornéenne et le rejet du greffon18. Ce modèle d’axotomie réalisée sur les nerfs cornéens pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de la dégénérescence des fibres, qui se produit après une greffe, suivie de la régénération des axones.

La troisième méthode endommage les nerfs cornéens avec un laser. En utilisant un microscope multiphotonique sur la cornée d’animaux anesthésiés, la dégénérescence des nerfs localisés dans le champ optique est induite à la suite de la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ce qui entraîne des dommages à l’ADN et une cavitation cellulaire19. Cette méthode récapitule les photodommages cornéens induits par une surexposition aux UV naturels (coups de soleil), qui déclenchent également la formation de ROS, entraînant des dommages à l’ADN20. Les patients qui souffrent de coups de soleil cornéens ressentent une grande douleur, car la détérioration des cellules épithéliales prive les extrémités des fibres cornéennes de tout.

Les trois méthodes décrites ici sont conçues pour permettre l’étude du processus de pathogenèse NK et de la régénération axonale. Ils sont facilement reproductibles et précis. De plus, ils permettent une récupération rapide et un suivi facile des animaux.

Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le National Animal Experiment Board. 1. Préparatifs Préparez une solution anesthésique de kétamine-xylazine pour l’anesthésie. Injecter de la kétamine à 80 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg en diluant 200 μL de kétamine (100 mg/mL) et 125 μL de xylazine (20 mg/mL) dans 2 175 mL de NaCl stérile à 0,9 %. Préparer une solution de buprénorphine à 0,02 mg/mL comme solution analgésique en ajoutant 100 μL de buprénorphine à 0,3 mg/mL à 1 400 mL de NaCl stérile à 0,9 %. Préparez la solution de coloration fluorescente.À l’aide d’une balance fine, peser 10 mg de sel de fluorescéine et le diluer dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une solution de fluorescéine à 0,1 %. Protégez la solution de la lumière et agitez-la pendant 5 min. Filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre à seringue de 0,2 μm.REMARQUE : La solution fluorescente doit être protégée de la lumière et peut être conservée à +4 °C pendant 5 jours. Préparation de la sourisPeser la souris et induire l’anesthésie en effectuant une injection intrapéritonéale de 10 μL/g de poids de souris (MW) de la solution anesthésique. Lorsque la souris s’arrête de bouger, placez-la sur une plaque chauffante (37 °C) et vérifiez qu’elle est complètement anesthésiée en lui pinçant les orteils. Appliquez une goutte de larme artificielle sur l’œil subissant la chirurgie et une goutte de gel oculaire sur l’œil controlatéral. Une fois que la souris ne réagit plus au pincement, injecter l’analgésie (0,02 mg/mL de buprénorphine) à 5 μL/g de MW pour fournir 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée dans le cou. 2. Abrasion de la cornée Suivez l’étape 1.3 pour préparer la solution de coloration fluorescente. Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris. Avant de procéder à l’abrasion, trempez la bavure oculaire dans de l’EtOH à 70 %, puis dans du PBS pour la nettoyer. Placez la souris sur une plaque chauffante (37 °C) sur le côté pour accéder facilement à l’œil en cours d’opération.Utilisez un coton-tige pour absorber la larme artificielle et brossez les cils sans toucher l’œil. Allumez la bavure oculaire, ouvrez la paupière de la souris avec deux doigts et bloquez simultanément les vibrisses pour éviter qu’elles ne se coincent dans la bavure. Localisez la pupille ou le centre de l’œil et appliquez la bavure oculaire sur la surface de l’œil, et faites des mouvements circulaires. En regardant de près, la surface de l’épithélium retiré peut être observée. Sinon, faites environ 20 mouvements circulaires sur la cornée. Remettez la souris sur le ventre et vérifiez si le gel oculaire est toujours présent dans l’œil controlatéral. Appliquez une goutte de solution colorante fluorescente sur l’œil abrasé et attendez 20 s. Absorbez la goutte avec un mouchoir en papier sans toucher l’œil et rincez-la avec une goutte de larme artificielle. Absorbez la goutte de la larme artificielle avec un mouchoir et illuminez l’œil avec la lampe au cobalt bleu.REMARQUE : L’abrasion doit avoir une forme circulaire. Il faut une certaine formation pour l’obtenir. Appliquez une goutte de gel oculaire sur l’œil abrasé et laissez la souris se réveiller sur le coussin chauffant. Lorsque la souris se déplace toute seule, remettez-la dans sa cage. Vérifier le bien-être de l’animal pendant les 2 jours suivants. Après l’utilisation de la bavure oculaire, utilisez un tissu mou pour retirer les cellules épithéliales coincées dans la tête de la bavure et trempez-la dans 70% d’EtOH puis de PBS.REMARQUE : Une fois que les cellules épithéliales sont retirées avec les tissus mous, assurez-vous qu’aucun morceau de tissu n’est coincé dans la tête de la bavure. 3. Axotomie des nerfs cornéens Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris. Placez la souris sous une loupe binoculaire sur le côté pour accéder à l’œil subissant la chirurgie. Placez le fond d’une boîte de Pétri sous la tête de la souris pour que l’œil soit horizontal.REMARQUE : Les étapes suivantes seront effectuées en regardant à travers la loupe binoculaire. Retirez la larme artificielle avec un coton-tige et retirez les cils sans toucher l’œil. Placez une pince lisse et incurvée sous l’œil de l’animal afin de le faire sortir de l’orbite. Assurez-vous de fermer suffisamment la pince pour que l’œil ne puisse pas retourner dans l’orbite une fois la pression appliquée, mais pas excessivement pour éviter d’endommager le nerf optique. Appliquer le poinçon de biopsie de 2,5 mm verticalement sur l’œil sans pression pour assurer un contact total du poinçon avec la surface de la cornée.REMARQUE : Une fois le poinçon appliqué contre la cornée, la main de l’expérimentateur peut interférer avec le champ de vision. Ensuite, commencez à appliquer une pression et tournez le poinçon plusieurs fois.REMARQUE : En fonction de la pression, le nombre de torsions peut varier, mais généralement il est d’environ 5. Il faut s’entraîner pour ressentir la bonne pression et le bon mouvement. Si une pression trop forte est appliquée, l’œil se rompt. Dans ce cas, on peut observer du liquide sortir de la lésion et l’œil se ramollir. L’animal doit être sacrifié. Retirez le poinçon de biopsie. Un cercle doit être visible sur la cornée où le poinçon de biopsie a été appliqué.REMARQUE : Les étapes suivantes ne nécessitent pas de loupe binoculaire. Vérifiez si l’œil controlatéral a encore du gel oculaire et appliquez-en sur l’œil axotomisé. Laissez la souris se réveiller sur un coussin chauffant (37 °C) et remettez-la dans sa cage lorsqu’elle se déplace seule. Vérifier le bien-être de l’animal pendant les 2 jours suivants. 4. Traitement de la cornée à montage entier Prélèvement et fixation d’échantillons.Peser la souris et induire l’anesthésie en effectuant une injection intrapéritonéale de 10 μL/g de poids de souris (MW) de la solution anesthésique. Lorsque la souris s’arrête de bouger et n’a pas de réflexes par pincement des orteils, effectuez une luxation cervicale. Sortez l’œil de l’orbite à l’aide de deux doigts et énucléez l’œil en coupant le nerf optique à l’aide de ciseaux incurvés. Placez l’œil dans un tube en plastique de 2 ml contenant du PBS. Fixez l’œil en remplaçant le PBS par du paraformaldéhyde à 4 % et en le plaçant sur un shaker (30 tr/min) à température ambiante (RT) pendant 20 min. Rincer 3 fois pendant 10 min avec PBS à RT sur un shaker (30 tr/min). Dissection de la cornéePlacez une goutte de PBS sur un morceau de parafilm à l’intérieur d’une boîte de Pétri. Placez l’œil dans cette goutte de PBS. Placez la boîte de Pétri sous la loupe binoculaire. Disséquez la cornée à l’aide de ciseaux de microdissection et d’une pince. Coupez au-dessus du corps ciliaire pour garder le limbe. Retirez le cristallin, le corps ciliaire et l’iris à l’aide d’une pince fine. Replacez la cornée dans un tube en plastique de 2 ml. Protocole d’immunofluorescenceIncuber la cornée dans 2 mL de gélatine de peau de poisson à 2,5 %, de sérum de chèvre à 5 % et de détergent à 0,5 % dans du PBS pendant 1 h à RT sur un shaker (30 tr/min). Incuber la cornée dans 150 μL d’une solution de gélatine de peau de poisson à 2,5 %, de sérum de chèvre à 5 % et de détergent à 0,1 % dans du PBS contenant l’anticorps primaire dilué à 1/1000 (anticorps anti-tubuline βIII) pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur (30 tr/min). Rincer 3 fois pendant 1 h avec 0,1% de lessive en PBS à RT sur un shaker (30 tr/min). Incuber la cornée dans la même solution qu’à l’étape 4.3.2, contenant l’anticorps secondaire dilué à 1/500 pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur (30 tr/min). Rincer 3 fois pendant 1 h avec du PBS à RT sur un shaker (30 tr/min). Incuber la cornée pendant 10 min avec 150 μL d’intercalateur d’ADN dilué à 1/5000 à RT sur un agitateur (30 tr/min). Rincez 2 fois pendant 5 min avec du PBS. Montage de la cornéePlacez la cornée sur une lame, l’épithélium face à la lame, et utilisez un scalpel pour créer quatre sections sans atteindre le centre.REMARQUE : Faites les sections opposées l’une à l’autre pour former une forme de fleur. Placez l’endothélium cornéen face de la lame et retirez le PBS autour de la cornée à l’aide d’un mouchoir.REMARQUE : Ne retirez pas le PBS sous la cornée ; sinon, des bulles d’air peuvent apparaître. Si c’est le cas, ajoutez du PBS à la cornée et retirez la bulle d’air. Recommencez ensuite à partir de l’étape 4.3.2. Ajoutez de la pâte de modèle aux quatre coins d’une lamelle rectangulaire.REMARQUE : La pâte modèle surélève la lamelle car la cornée est un tissu épais. Déposez 50 μL d’un produit de montage sur la cornée et posez soigneusement la lamelle au-dessus pour éviter la formation de bulles. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles. ImageriePlacez la lame sous un microscope à épifluorescence. Définissez la taille de la mosaïque et la profondeur de l’image et lancez l’acquisition. Appliquez un programme de défloutage et de déconvolution sur l’image acquise.REMARQUE : L’étape 4.6.3 est une option sélectionnée sur le logiciel d’acquisition (Large Volume Computational Clearing [LVCC]) 5. Ablation localisée au laser des nerfs cornéens Allumez le microscope multiphotonique vertical et le laser combiné à un oscillateur paramétrique optique. Activez la platine chauffée du microscope (37 °C) et réglez les lasers à 850 nm et 1100 nm, correspondant aux longueurs d’onde requises pour le modèle de souris. Utilisez un wattmètre pour régler simultanément la puissance des lasers à environ 20 mW. Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris et appliquez le gel oculaire sur les deux yeux.NOTE : L’animal utilisé pour ce protocole doit provenir d’une lignée de souris transgénique (souris transgénique MAGIC-Marker21) qui exprime un fluorophore endogène dans les fibres nerveuses cornéennes. Installez l’animal dans un porte-tête. Tournez l’animal de 90° pour que l’œil qui vous intéresse fasse face au plafond. Attachez les vibrisses de l’animal pour dégager le contour des yeux. Attachez le corps de l’animal pour réduire le mouvement de la tête induit par la respiration. Placez une lamelle circulaire sur l’œil au-dessus du gel oculaire. La lamelle doit être horizontale. N’hésitez pas à bouger la tête de l’animal pour que la lamelle soit correctement positionnée. Ajoutez une goutte de PBS au-dessus de la lamelle. Placez soigneusement l’animal sur la platine du microscope et placez la tourelle d’objectif à la bonne distance. Utilisez l’objectif aqueux 20x et l’épifluorescence pour localiser l’œil et l’innervation à travers l’oculaire. Activez les lasers et définissez la profondeur à éclairer. Acquérez une image de 1024 x 1024 (pixels) à une vitesse d’acquisition de 70 % à 85 % de la vitesse de numérisation maximale. Une fois l’image acquise, retirez l’animal du microscope et retirez la lamelle et les sangles. Retirez l’animal du support de tête, ajoutez plus de gel oculaire si nécessaire et laissez-le se réveiller dans une cage sur une plaque chauffante.NOTE : La destruction de l’innervation peut être observée 1 semaine après l’imagerie. Ce protocole peut être répété une fois par semaine pendant plusieurs semaines pour augmenter les dommages causés par les lasers. Lorsque l’animal se déplace seul, remettez la cage dans l’écurie et vérifiez son bien-être pendant les 2 jours suivants.

Representative Results

Cette étude propose plusieurs protocoles pour infliger des dommages à l’innervation cornéenne chez la souris. Alors que des protocoles similaires ont été utilisés pour étudier la physiopathologie de la cicatrisation de l’épithélium, nous avons choisi d’adapter et de développer de nouvelles méthodes d’étude de la régénération de l’innervation cornéenne. Pour observer l’innervation, nous avons utilisé deux techniques. Dans un premier temps, nous avons utilisé une technique d’immunofluorescen…

Discussion

La kératite neurotrophique est considérée comme une maladie rare, affectant 5 personnes sur 10 000. Cependant, les personnes souffrant de NK en raison d’une blessure physique telle que des brûlures chimiques, ou des syndromes tels que le diabète ou la sclérose en plaques ne sont pas incluses dans ces statistiques3. De plus, cette affection reste largement sous-diagnostiquée22 et la prévalence de la maladie est sous-estimée. Il existe un fort besoin de nouveaux tr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Karine Loulier pour l’accès à la lignée de souris transgéniques MAGIC-Markers. Les auteurs remercient également la plateforme de carottage animalier RAM-Neuro et la plateforme d’imagerie IRM, membre de l’infrastructure nationale France-BioImaging soutenue par l’Agence nationale de la recherche (ANR-10-INBS-04, « Investissements d’avenir »). Ces recherches ont été soutenues par le programme ATIP-Avenir, l’Inserm, la Région Occitanie, l’Université de Montpellier, l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-21-CE17-0061), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) et la Fondation Groupama.

Materials

0.2 µm seringe filter CLEARLINE 51733
0.5 mm rust ring remover Alger Equipment Company BU-5S
2 mL plastic tubes Eppendrof  30120094
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody Abcam ab18207
Antigenfix Diapath P0016
Artificial tear Larmes artificielles Martinet N/A
Buprecare Animalcare N/A
Cotton swab Any provider N/A
Dissecting tools Fine Science Tools N/A
Fluorescein Merck 103887
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7765
Goat serum Merck S26
Head Holder Narishige SGM 4
Heated plate BIOSEB LAB instruments BIO-HE002
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Imalgene 1000 BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France N/A French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software Leica N/A Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II Coherent N/A
Laser power meter Coherent N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope Leica N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope Zeiss N/A
Ocry-gel TVM lab N/A
Parametric oscillator Coherent N/A
Penlights with blue cobalt filtercap Bernell ALPEN
Petri dish Thermo Scientific 150318 Axotomy protocol
Petridish Thermo Scientific 150288 Cornea whole-mount processing
Rompun 2% Elanco N/A French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm LCH medical LCH-PUK-25
Triton X-100 VWR 0694
Vectashield EuroBioSciences H-1000 Mounting medium
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References

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Citer Cet Article
Meneux, L., Caballero, A., Boukhaddaoui, H., Michon, F. Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea. J. Vis. Exp. (202), e66182, doi:10.3791/66182 (2023).
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