JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Een volledig menselijk leverkweeksysteem voor toepassingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65992
, , , , ,
1Institute of Regenerative Medicine,LifeNet Health, 2Biologics Division,LifeNet Health, 3LifeSciences Division,LifeNet Health, 4Research and Development,LifeSciences, LifeNet Health

Summary

Recente technische ontwikkelingen maakten de grootschalige productie mogelijk van een in vitro platform voor toepassingen op het gebied van geneesmiddelmetabolisme en toxiciteit. Een volledig menselijk 2D+ leversysteem (TV2D+) levert fysiologisch relevante resultaten met behulp van traditionele tweedimensionale kweekmethoden. Dit protocol ondersteunt eindgebruikers bij de installatie, het onderhoud en de toepassing van het systeem.

Abstract

Het vinden van een voor de mens relevant kweekmodel voor de lange termijn voor primaire humane hepatocyten (PHH’s) voor farmacologische en toxicologische studies blijft een uitdaging. De huidige in vitro modelplatforms zijn vaak onhandig en complex, missen fenotypische stabiliteit in de loop van de tijd en ondersteunen niet meerdere PHH-loten, zonder experimentele reproduceerbaarheid en flexibiliteit. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het ontdooien, uitplateren en onderhouden van een volledig menselijk 2D+ leversysteem (TV2D+), dat gebruik maakt van standaard tweedimensionale (2D) kweektechnieken en -apparatuur met behoud van de levensduur en fenotypische stabiliteit in de loop van de tijd die doorgaans gepaard gaan met complexere driedimensionale (3D) systemen. De resultaten tonen hechting en percentage plateerbaarheid in TV2D+ als functie van PHH-zaaidichtheid, evenals stabiele functionaliteit gedurende ten minste 2 weken in cultuur. Een reeks PHH-zaaidichtheden wordt beoordeeld om een succesvolle cultuur op lange termijn te bereiken. Als ze op de juiste manier zijn vastgesteld, organiseren de PHH’s in TV2D+ zich in hepatocytkolonies, brengen ze een leverspecifieke marker tot expressie en behouden ze de levensvatbaarheid, architecturale integriteit en fysiologisch relevante niveaus van albumine en ureum. Deze unieke combinatie van eigenschappen maakt het TV2D+ systeem tot een geschikt levermodel voor een verscheidenheid aan farmacologische en toxicologische toepassingen.

Introduction

Het voorspellen van therapeutische veiligheid en werkzaamheid is een belangrijk onderdeel van de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen. Conventionele preklinische in vitro levermodellen zijn echter beperkt in hun vermogen om de in vivo cellulaire micro-omgeving van de lever nauwkeurig na te bootsen en de functionaliteit en morfologie van de hepatocyten in de loop van de tijd te behouden. Er is behoefte aan modellen die gedurende meer dan 1 week een stabiele metabole competentie bieden om verbindingen met een langzame omzet te beoordelen of de resultaten te onderzoeken die verband houden met subacute of chronische blootstelling. In vivo dierproeven voorspellen vaak niet de werkzaamheid en het risico van geneesmiddelen als gevolg van translationele soortverschillen in menselijke leverklaringsmechanismen1. Huidige in vitro 2-dimensionale (2D) levermodellen, zoals traditionele primaire humane hepatocyt (PHH) monocultuur of sandwichculturen, missen fenotypische stabiliteit en levensduur in kweek, wat leidt tot verlies van de belangrijkste hepatocellulaire functie en architecturale integriteitin de loop van de tijd. Een alternatieve methode omvat de vorming van 3-dimensionale (3D) hepatocytsferoïden, die een relevantere micro-omgeving bieden dan 2D-kweek. Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van grondstoffen, PHH-donorlotselectie, reproduceerbaarheid en verlies van levensvatbaarheid bij toenemende sferoïde grootte 3,4,5,6. Er zijn meercellige platforms geïntroduceerd waarbij PHH’s met feedercellen worden gezaaid op platen met een vast formaat en een micropatroon. Hoewel deze modellen langere kweektijden mogelijk kunnen maken, kunnen niet-menselijke voedingscellen die in deze platforms worden gebruikt, de experimentele resultaten veranderen en de toepassing ervan beperken vanwege de aangeboren achtergrondbijdrage aan de klaring van geneesmiddelen en metabole profielen 1,7. Het TruVivo all-human 2D+ leversysteem (TV2D+) dat onlangs is beschreven in Weaver, et al8, is ontwikkeld om enkele van de beperkingen van traditionele, co-cultuur en 3D-kweekmethoden van PHH’s aan te pakken. De niet-levervoedingscellen verminderen de verschillen tussen soorten in metabolisme en paracriene productie en bieden de ondersteuning die nodig is voor primaire hepatocyten op een reproduceerbare, robuuste manier die niet kan worden geboden door overeenkomstige niet-parenchymale levercellen van een enkele donorpartij vanwege beperkingen in expansie, fenotype en prestaties. De gekozen voedingscellen konden vóór gebruik consequent worden uitgebreid en hadden geen transformatie of differentiatie nodig. Zoals beschreven door Glicklis et al.4 en Khetani et al.5, hebben 3D-kweekmodellen zoals hepatocytsferoïden problemen met reproduceerbaarheid als gevolg van donorvariabiliteit en het handhaven van consistentie in sferoïde grootte, wat de diffusie van voedingsstoffen in sferoïden groter dan 200 μm beïnvloedt, wat leidt tot verminderde levensvatbaarheid en functionaliteit. Net als 3D-sferoïde vorming vertrouwt het TV2D+-systeem op zelfassemblage van PHH’s; de gevormde PHH-kolonies zijn echter verspreid over het oppervlak van de put op een diepte van één cel in plaats van samengeperst tot een enkel aggregaat. Deze kweekmethode kan nuttig zijn om de variabiliteit van donoren aan te pakken, waardoor PHH’s kunnen worden geplateerd, gekweekt en de basisfunctionaliteit bij verschillende zaaidichtheden kunnen behouden. Het TV2D+-systeem kan ook de robuustheid van de gebruikershantering vergroten als gevolg van verlies tijdens manipulatie of gespecialiseerde apparatuur die nodig is om uitgebreide kweek in 3D-sferoïden uit te voeren.

Het TV2D+-systeem combineert standaard 2D-cultuur met de lange levensduur en fenotypische stabiliteit die typisch zijn voor 3D-systemen. Het hierin beschreven protocol biedt stapsgewijze instructies voor gebruikers met basisvaardigheden op het gebied van weefselkweek in laboratoria die zijn uitgerust met standaardapparatuur zoals bioveiligheidskasten, centrifuges en CO2 -incubatoren. Elke stap in het proces wordt in detail beschreven, inclusief de voorbereiding van de media, het ontdooien, het plateren en het onderhoud van het resulterende kweeksysteem. Het protocol bevat ook een methode voor het bepalen van de basisfunctionaliteitsoutput van hepatocyten, albumine en ureum, evenals immunofluorescerende beeldanalyse voor het bepalen van PHH-gehechtheid voor normalisatie. Wanneer ze op de juiste manier zijn vastgesteld, organiseren de PHH’s in TV2D+ zich in hepatocytkolonies, bootsen ze de oorspronkelijke levermorfologie na en behouden ze gedurende ten minste 2 weken een verlengde levensvatbaarheid, architecturale integriteit en fysiologisch relevante niveaus van albumine en ureum8. Omdat het systeem een reeks PHH-zaaidichtheden mogelijk maakt, kan het nuttig zijn bij het vergroten van de beschikbaarheid van minder plateable PHH-partijen met gewenste donorkenmerken. Deze combinatie van toegankelijkheid en functionaliteit maakt TV2D+ tot een geschikt levermodel voor een verscheidenheid aan farmacologische en toxicologische toepassingen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van Lifenet Health. Het manuscript bevat geen studies met menselijke deelnemers of dierstudies uitgevoerd door een van de auteurs. Alle cellen werden geïsoleerd uit donorweefsel met volledige toestemming voor onderzoeksdoeleinden door Lifenet Health. 1. Medium voorbereiding Ontdooi één fles per ontdooimedium van de voedingscel, supplement A, supplement B en supplement C (zie materiaaltabel) in een waterbad van 37 °C of 16-24 uur bij 4 °C. Aliquot de hele fles (10 ml) ontdooimedium van de voedingscel in een conische buis van 15 ml of 50 ml.NOTITIE: De grootte van de celpellet is gemakkelijker te bekijken met een conische buis van 15 ml. Voeg 4,5 ml supplement B en 11 ml supplement A toe aan een fles platingmedium (75 ml) (zie materiaaltabel) om een volledig platingmedium te maken.OPMERKING: Compleet platingmedium heeft een concentratie FBS <5% v/v. Voeg in een aparte fles 100 ml kweekmedium toe (zie Materiaaltabel), 1 ml supplement C en 14 ml supplement A om een compleet kweekmedium te maken.OPMERKING: Volledig kweekmedium heeft een concentratie FBS <1% v/v Bewaar resterend supplement C en supplement A bij -20 °C tot week 2 medium bereiding.OPMERKING: Herhaalde vries-dooicycli zullen de houdbaarheid van de supplementen verkorten. Het wordt aanbevolen om slechts één keer te bevriezen en te ontdooien. Verwarm voor gebruik 10 ml van het ontdooimedium van de voedingscel, het ontdooimedium van de hepatocyten, het complete uitplatingsmedium en het complete kweekmedium gedurende 20-30 minuten in een waterbad van 37 °C. 2. Ontdooien, tellen en uitplaten van menselijke voedercellen (Figuur 1A) Kweek de voedercellen ongeveer 1 uur voor het zaaien van PHH’s. Ontdooi de voedercellen (zie Materiaaltabel) in een waterbad van 37 °C gedurende 1-2 min.NOTITIE: Vermijd langdurige blootstelling (bijv. >2 min) door het ontdooien en verwijderen van de injectieflacon te controleren wanneer er vloeistof loskomt in de cryovial wanneer deze wordt omgekeerd. Plaats de voedercellen onmiddellijk na het ontdooien op ijs. Voeg met behulp van aseptische technieken in een bioveiligheidskast (BSC) vers ontdooide cellen toe aan 10 ml ontdooimedium voor voedingscellen. Gebruik een pipet van 1000 μl om de injectieflacon eenmaal te wassen met 1 ml cel/dooimediumsuspensie en verzamel deze. Centrifugeer gedurende 4 minuten op 400 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatans voorzichtig weg om de celpellet niet te verstoren door pipetteren of vacuümaspiratie. Resuspendeer de celpellet in 1 ml volledig uitplatingmedium en tel de toevoercellen.OPMERKING: Feedercellen kunnen worden geteld met behulp van acridine orange en propidiumjodide (AOPI) op een geautomatiseerde celteller of trypan blue met behulp van een hemacytometer. Het aantal cellen kan variëren, afhankelijk van de technologie en de gebruiker. Voor de beste resultaten telt u dubbele monsters en blijft u consistent in de gekozen methodologie. Verdun de celsuspensie tot 100.000 cellen/ml met behulp van het volledige platingmedium. Plaat 500 μL (50.000 cellen) per putje van de verdunde celsuspensie op een met collageen beklede plaat met 24 putjes (zie Materiaaltabel). Schud de plaat in een noord (N)-zuid (S)-Oost (E)-West (W) beweging door 2 keer een heen-en-weer beweging in de N-Z-richting te gebruiken, gevolgd door dezelfde beweging E-W. Herhaal dit schudprotocol nog 2 keer voor een totaal van 3 rondes.NOTITIE: Schud met matige kracht om spatten op het plaatdeksel te voorkomen en toch te helpen bij de celdistributie (raadpleeg de video). Incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 60 min. Bekijk de bevestiging van de feedercel voordat u doorgaat met het ontdooien van hepatocyten.OPMERKING: Acceptabele bevestiging van de invoercel is visueel ongeveer 50% confluent. 3. Ontdooien, tellen en uitplaten van primaire menselijke hepatocyten (Figuur 1B) Filtreer na 30 minuten toevoercelkweek het voorverwarmde ontdooimedium van de hepatocyten door een 0,2 μm polyethersulfon (PES)-filtereenheid. Ontdooi PHH’s in een waterbad van 37 °C gedurende 1-2 minuten.NOTITIE: Vermijd langdurige blootstelling (bijv. >2 min) door het ontdooien en verwijderen van de injectieflacon te controleren wanneer er vloeistof loskomt in de cryovial wanneer deze wordt omgekeerd. Plaats PHH’s onmiddellijk na het ontdooien op ijs. Giet in een BSC PHH-suspensie in het ontdooimedium van de hepatocyten.OPMERKING: Vermijd pipetteren PHH-celsuspensies indien mogelijk. Het is van het grootste belang om niet te pipetteren tijdens de overdracht van ontdooide PHH’s van het cryoviale naar het ontdooimedium. Gebruik een pipet van 1000 μl om de injectieflacon 3-4 keer te wassen door voorzichtig 1 ml hepatocyt/dooimediumsuspensie terug in de injectieflacon te pipetteren en het wasgoed op te vangen door het terug in het dooimedium te gieten. Sluit de ontdooide PHH-suspensie 5 keer af en keer deze voorzichtig om. Centrifugeer op 100 x g gedurende 8 minuten bij RT. Gooi het supernatans voorzichtig weg om de celpellet niet te verstoren door pipetteren of vacuümaspiratie. Voeg aan de wand van de conische buis 3 ml compleet platingmedium toe. Schud de conische buis heen en weer om de celpellet te suspenderen. Voeg nog eens 5 ml volledig platingmedium toe aan de geresuspendeerde hepatocyten. Tel PHH’s.OPMERKING: PHH’s kunnen worden geteld met behulp van AOPI op een geautomatiseerde celteller of trypanblauw met behulp van een hemacytometer. Het aantal cellen kan variëren, afhankelijk van de technologie en de gebruiker. Voor de beste resultaten telt u dubbele monsters en blijft u consistent in de gekozen methodologie. Verdun de celsuspensie tot de gewenste zaaidichtheid (300.000-600.000 PHH’s/ml) met behulp van het volledige uitplatingsmedium.OPMERKING: De optimale zaaidichtheid van hepatocyten kan van partij tot partij verschillen. De aanbevolen zaaidichtheid voor een bepaalde partij wordt vermeld in het analysecertificaat (COA). Gebruik de onderstaande vergelijking om hepatocyten/ml te bepalen voor een plaat met 24 putjes. Verwijder het medium uit de geplateerde toevoercellen door middel van pipetteren of vacuümaspiratie.NOTITIE: Om de levensvatbaarheid van de voedingscellen te garanderen, wordt aanbevolen om niet meer dan 3 putjes tegelijk te vervangen. Plaat onmiddellijk 500 μL (150.000-300.000 cellen) per putje van de verdunde hepatocytensuspensie op de vooraf gecoate collageenplaat met 24 putjes die voedingscellen bevat. Schud de plaat in een N-Z-E-W-beweging door 2 keer een heen-en-weerbeweging in de N-Z-richting te gebruiken, gevolgd door dezelfde beweging E-W. Herhaal dit schudprotocol nog 2 keer voor een totaal van 3 rondes.NOTITIE: Schud met matige kracht om spatten op het plaatdeksel te voorkomen en toch te helpen bij de celdistributie. Incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 2-4 uur. Schud de plaat gedurende de eerste 60 minuten van de kweek elke 15 minuten in N-Z-O-W-beweging zoals in stap 3.15 hierboven. Haal na het broeden de plaat uit de incubator en plaats deze in BSC. Schud de plaat en verwijder het volledige platingmedium door middel van pipetteren of vacuümaspiratie.OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cultuur te garanderen, wordt aanbevolen om niet meer dan 3 putten tegelijk te vervangen. Voeg onmiddellijk 500 μL voorverwarmd compleet kweekmedium toe aan elk putje. 4. Onderhoud Aliquot en verwarm het complete kweekmedium voor in een waterbad van 37 °C gedurende 20-30 minuten. Er is ongeveer 13,5 ml medium nodig voor een plaat met 24 putjes. Voer culturen dagelijks met 500 μL per putje vers, voorverwarmd compleet kweekmedium.OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cultuur te garanderen, wordt aanbevolen om niet meer dan 3 putten tegelijk te vervangen. Bereid elke 7 dagen vers compleet kweekmedium. 5. Verzameling van monsters van het bovendrijvende middel voor het meten van albumine en ureum Verzamel op dag 7, 10 en 14 500 μL medium uit de gewenste monsterput(jes) in een microcentrifugebuis(je) in een microcentrifugebuis(je), zoals weergegeven in figuur 1C. Draai het (de) monster(s) gedurende 10 minuten bij 4 °C op 320 x g tot pelletresten. Gebruik een pipet om de supernatant(en) van het monster over te brengen in nieuwe microcentrifugebuis(jes), zodat de pellet niet wordt verstoord. Voer de monsters uit op de albumine- en/of ureumtest (zie respectievelijk rubrieken 10 en 11).OPMERKING: Monsters kunnen gedurende 2 weken bij -20 °C tot -80 °C worden bewaard. 6. Kleuring dag I LET OP: Fixatiebuffer bevat paraformaldehyde. Paraformaldehyde kan oogletsel, huidirritatie en orgaantoxiciteit veroorzaken. Werk in een ruimte met goede ventilatie en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Voeg na het verzamelen van mediummonsters op dag 14 300 μL fixatiebuffer (zie materiaaltabel) toe aan elk te kleuren putje, zoals weergegeven in figuur 1C. Vlek minimaal 2 putjes. Incubeer bij 4 °C gedurende 20-60 min. Bereid 1x permeabilisatiebuffer (zie Materiaaltabel) door 5 ml 10x stockoplossing toe te voegen aan 45 ml 1x PBS (zie Materiaaltabel).LET OP: De 1x permeabilisatiebuffer kan 1 maand bij 4° C worden bewaard. Was 2 keer met 300 μL 1x permeabilisatiebuffer op ijs. Voeg 300 μL primair antilichaam cytokeratine 18 toe (zie materiaaltabel) met behulp van een verdunning van 1:1000 in 1x permeabilisatiebuffer op ijs.OPMERKING: Incubeer minimaal één putje met 1x permeabilisatiebuffer alleen voor een secundaire controle met alleen antilichamen. Incubeer 16-24 uur bij 4 °C. 7. Kleuring dag II Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam door pipetteren of vacuümaspiratie. Was 2 keer met 300 μL per putje of 1x permeabilisatiebuffer op ijs. Voeg 300 μL fluorescerend secundair antilichaam toe (zie materiaaltabel) met behulp van een verdunning van 1:500 in 1x permeabilisatiebuffer (inclusief alleen secundaire controle).OPMERKING: Vermijd licht bij het gebruik van fluorescerende antilichamen. Incubeer gedurende 30-45 min bij 4 °C in het donker. Verwijder het secundaire antilichaam door pipetteren of vacuümaspiratie. Was 2 keer met 300 μL per putje of 1x permeabilisatiebuffer op ijs. 1 keer wassen met 300 μL per putje van 1x PBS. Voeg 150 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) montagemedium (zie Materiaaltabel) toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij RT in het donker.OPMERKING: De plaat kan in parafilm worden gewikkeld en 1 week bij 4 °C in het donker worden bewaard. Bekijk onder een fluorescerende microscoop. Leg 5 beelden vast van elk specifiek fluorescerend kanaal voor elke put met behulp van de 10x objectieflens (zorg ervoor dat één afbeelding een schaalbalk heeft).OPMERKING: DAPI heeft een excitatie/emissie van 358 nm/461 nm. Gebruik een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met de juiste detectiefilters voor zowel DAPI als het secundaire antilichaam fluorofoor. 8. ImageJ-analyse (Figuur 2) OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ImageJ versie 1.52a of hoger te gebruiken. Open een afbeelding met een schaalbalk in ImageJ. Klik op het pictogram Rechte lijn en teken een lijn op de exacte lengte van de schaalbalk [Figuur 2 (1)]OPMERKING: Klik indien nodig op het vergrootglaspictogram om in of uit te zoomen. Klik op het tabblad Analyseren . Markeer en klik op Schaal instellen. Wijzig Bekende afstand in de afstand van de schaalbalk. Wijzig Lengte-eenheden in de eenheden van de schaalbalk. Pas de instellingen globaal toe door Globaal aan te vinken. Klik op OK om de schaal in te stellen.OPMERKING: Zodra deze instelling is toegepast, wordt bij elke geopende afbeelding het berekende gebied van het gezichtsveld weergegeven in eenheden die door de gebruiker zijn ingevoerd. Open een DAPI-only image in ImageJ. Klik op het tabblad Proces en markeer Achtergrond aftrekken. Verwijder de achtergrond met 50 pixels tegelijk totdat de ongekleurde gebieden zwart zijn.OPMERKING: Als de afbeelding geen achtergrond bevat, is deze stap niet vereist. Klik op het tabblad Afbeelding en markeer Type. Klik op 8-bit om de afbeelding grijstinten te maken [Figuur 2 (2)]. Drempel het beeld handmatig of automatisch om alle DAPI-deeltjes op te nemen (pas op dat u de drempel niet handmatig overschrijdt) [Figuur 2 (3)]. Klik op het tabblad Afbeelding en markeer Aanpassen. Klik op Drempelwaarde. Klik op Toepassen als u klaar bent. Klik op het tabblad Proces en markeer Binair. Klik op Waterscheiding. Klik op het tabblad Analyseren en markeer /klik op Deeltjes analyseren [Figuur 2 (4)]. Stel de maat in op 5-oneindig en circulariteit op 0.00-1.00. Selecteer in de vervolgkeuzelijst Weergeven de optie Contouren. Zorg ervoor dat Resultaten weergeven, Samenvatten en Gaten opnemen zijn aangevinkt. Klik op OK.OPMERKING: Het gewenste deeltjesbereik kan worden aangepast als drempelwaarden achtergrondpixels opleveren. Noteer het resultaat van de telling als TOTAAL DAPI. Open een samengevoegde Cytokeratine 18/DAPI-afbeelding in ImageJ. Gebruik het Multi-Point [Figuur 2 (5)] pictogram om alle DAPI-deeltjes die niet gekleurd zijn voor Cytokeratine 18 handmatig te tellen. Noteer het resultaat als FEEDER CELLS. Gebruik de onderstaande vergelijking om de DAPI van de hepatocyt te bepalen.Hepatocyt DAPI = Totaal DAPI – Feeder Cell DAPI 9. Kwantificering van het totale aantal aangehechte hepatocyten en het percentage aanhechting (plateerbaarheid) Maak een schaalfactor voor het kweekgebied met 24 putjes met behulp van de onderstaande vergelijking. Metingen van het gezichtsveld zijn te vinden aan de bovenkant van elk geopend beeld [Figuur 2 (2), groen kader]. Bereken het totale aantal aangehechte hepatocyten met behulp van de onderstaande vergelijking.Bijgevoegde hepatocyten = schaalfactor × Hepatocyt DAPI Bereken de procentuele aanhechting van de hepatocyten met behulp van de onderstaande vergelijking. 10. Albumine-test Meet de albumineproductie met behulp van een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) (zie materiaaltabel) op monsters verdund met 1:200.NOTITIE: Voor nauwkeurigheid bevestigt de gebruiker dat de monsters binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen. De gespecificeerde kit bevat alle materialen en instructies om de test uit te voeren. Normaliseer de monsterconcentraties naar aangehechte hepatocyten met behulp van de onderstaande vergelijking. 11. Ureumtest LET OP: Bloedureumstikstof (BUN) zuurreagens bevat zwavelzuur. De zwavelzuurconcentratie in het BUN-zuurreagens wordt als corrosief beschouwd. Niet inslikken. Werk in een ruimte met goede ventilatie en draag geschikte PBM’s. De synthese van ureum wordt gemeten met behulp van een gemodificeerde diacetylmonoximmethode (zie materiaaltabel). Verdun 53,3 μL van 75 mg/dL ureum tot 346,7 μL compleet kweekmedium om Standaard #1 te maken (100 μg/ml) Label de buisjes 2-8 en gebruik een seriële verdunning van 1:2 om de ureumteststandaarden te maken (tabel 1). Voeg 10 μl monster of standaard toe aan putjes met een zwartwandige, doorzichtige bodemplaat met 96 putjes (zie Materiaaltabel). Voeg 150 μl BUN-reagens toe aan elk putje met monster. Bereid het BUN-reagens voor door 1/3 van het BUN-kleurreagens te mengen met 2/3 BUN-zuurreagens. Gebruik de onderstaande vergelijking om te helpen bij het berekenen.BUN-kleurreagens (ml) = Totaal BUN-reagens dat nodig is × 0.333BUN-zuurreagens (ml) = Totaal BUN-reagens dat nodig is × 0,667 Incubeer de plaat gedurende 90 minuten in een oven of incubator op 60 °C. Lees de plaatabsorptie onmiddellijk af bij 540 nm en 650 nm. Creëer een standaardcurve door blanco en achtergrondabsorptie (650 nm) af te trekken van alle monsters en standaarden. Genereer een best passende lijn door middel van lineaire regressieanalyse. Bepaal de onbekende monsterconcentratie aan de hand van de standaardcurve. Normaliseer de monsterconcentraties naar aangehechte hepatocyten met behulp van de onderstaande vergelijking.

Representative Results

De algemene methode van plating, kweek en testen van de basisfunctionaliteit van het leverkweeksysteem omvat algemene primaire celkweektechnieken en -analyse, zoals geïllustreerd in figuur 1. De hechting van hepatocyten en de beplateerbaarheid werden op dag 14 berekend met behulp van ImageJ-analyse van ten minste vijf beelden van cytokeratine 18 en DAPI-kleuring per putje (figuur 2). Representatieve beelden van PHH’s gekweekt met voedercellen worden weergegeven in figuur 3. De verschillende inzaaidichtheden van de lever vertoonden visuele verschillen in samenvloeiing op basis van de zaaidichtheid en handhaafden de typische lever-, kubusvormige morfologie gedurende 14 dagen kweek. Beelden van hepatocytendonorpartijen A en B werden vastgelegd voor elke geteste zaaidichtheid (Figuur 4A). Het gemiddelde percentage plateerbaarheid voor donor B (89.04% ± 3.99%, 198.552 ± 49.885 PHH’s) was hoger dan dat van donor A (66.08% ± 6.67%, 146.128 ± 33.063 PHH’s) over alle gebruikte zaaidichtheden (Figuur 4B). Donor A had een significant hoger percentage plateerbaarheid bij gebruik van 150.000 PHH’s/put (76.07% ± 12.87%) vergeleken met 250.000-300.000 PHH’s/put (62.75% ± 9.64%). Donor B vertoonde geen significante verschillen in de plateerbaarheid van het hepatocytpercentage. Donor B had de laagste plateerbaarheid van hepatocyten (85,78% ± 13,25%) bij de hoogste zaaidichtheid, 300.000 PHH’s/put. Net als bij donor A had het zaaien van donor B met 150.000 PHH’s/well het hoogste percentage beplateerbaarheid van hepatocyten (94,75% ± 15,07%). Albumineproductie en ureumsynthese werden gemeten op drie tijdstippen tijdens de kweekperiode van 14 dagen en genormaliseerd naar berekende aangehechte hepatocyten. Over het algemeen had donor A een verhoogde albumineproductie in vergelijking met donor B (41,32 ± 4,58 μg alb/dag/106 PHH’s vs. 34,66 ± 10,03 μg alb/dag/106 PHH’s) (Figuur 5). Donoren A en B hadden de hoogste albumineproductie bij het zaaien van hepatocyten met respectievelijk 150.000 PHH’s/put, 45,91 ± 5,96 μg alb/dag/106 PHH’s en 48,67 ± 20,44 μg alb/dag/106 PHH’s. Er werden geen significante verschillen in albumineproductie waargenomen in de gebruikte zaaidichtheden. Zoals gesteld door Baudy et al.3, is het wenselijk dat de microfysiologische systemen van de lever een consistente albumineproductie en ureumsynthese handhaven met minder dan 50% verandering gedurende 14 dagen kweek. De variatiecoëfficiënt (CV) werd berekend door het gemiddelde te delen door de standaarddeviatie voor dag 7, 10 en 14. Alle steekproeven werden in tweevoud uitgevoerd. De CV voor albumineproductie gedurende de kweekperiode van 14 dagen bij 150.000 PHH’s/put was 12,24% voor donor A en 37,97% voor donor B, minder dan het gewenste criterium van 50%. Een hoge variantie in albumineproductie werd gezien bij zowel donor A als donor B bij 250.000 en 300.000 PHH’s/put. Bij deze zaaidichtheden ervaren beide donoren een sterke afname van de albumineproductie tussen dag 7, 10 en 14 van de kweek (CV-donor A, 22,49% en donor B, 45,07%). De ureumsynthese van donor B (95,09 ± 18,91 μg ureum/dag/106) was verhoogd in vergelijking met donor A (64,92 ± 4,66 μg ureum/dag/106 PHH’s) bij het gemiddelde van dag 7, 10 en 14 PHH partijspecifieke gegevens (figuur 6). Donor B (113,49 ± 37,34 μg ureum/dag/106 PHH’s) en donor A (69,12 ± 17,06 μg ureum/dag/106 PHH’s) hadden de grootste ureumsynthese gedurende een kweekperiode van 14 dagen en zaaiden met een dichtheid van respectievelijk 150.000 PHH’s/well en 200.000 PHH’s/put. Beide donorpartijen hadden de laagste ureumproductie en de hoogste CV met 300.000 PHH’s/put. Er werden geen significante verschillen in ureumsynthese waargenomen in de gebruikte zaaidichtheden. Het laagste CV voor ureumsynthese voor donor A werd gezien bij kweek bij 250.000 PPH’s/put (23.11%) en 200.000 PHH’s/well voor donor B (28.26%). Zoals uit deze resultaten blijkt, hangt de optimale zaaidichtheid voor een bepaalde partij PHH af van het gewenste niveau van samenvloeiing op het moment van de test en de aard van de resultaten die worden gemeten; Een hogere zaaidichtheid correleert niet altijd met een hoger signaal of dynamisch bereik. Figuur 1: Stroomschema van het uitplaten, kweken en functioneel testen van hepatocyten met voedingscellen. (A) Voedercellen worden ontdooid in een specifiek ontdooimedium (zie Materiaaltabel), geresuspendeerd in een volledig uitplatingsmedium (zie Materiaaltabel) en de cellen worden geteld. De cellen worden verdund, geplateerd en gedurende 60 minuten geïncubeerd bij 37 °C/5% CO2 . (B) Hepatocyten worden ontdooid in een specifiek ontdooimedium (zie materiaaltabel), geresuspendeerd in een volledig uitplatingsmedium en de cellen worden geteld. De hepatocyten worden verdund en geplateerd met voedingscellen. De cellen worden gedurende 2-4 uur geïncubeerd bij 37 °C/5% CO2 en schudden gedurende de eerste 60 minuten van de kweek elke 15 minuten in een N-Z-O-W-beweging. Het platingmedium wordt vervangen door een voorverwarmd compleet kweekmedium voor het behoud van de cultuur (zie Tabel met materialen). De culturen worden dagelijks gevoed. (C) Op dag 7, 10 en 14 worden mediummonsters verzameld voor albumine- en ureumtesten. Na het verzamelen van monsters op dag 14 worden de cellen gefixeerd en gekleurd met cytokeratine 18 (zie materiaaltabel) antilichaam 16-24 uur bij 4 °C. Verder worden ze geïncubeerd in een geschikt secundair antilichaam, gewassen en gemonteerd met DAPI (zie Materiaaltabel) voor opname en beeldanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Beeldanalyse met behulp van ImageJ-software. ImageJ-verwerking van vastgelegde beelden. Stap 1: op alle afbeeldingen wordt een schaal toegepast op basis van de microscoopspecifieke schaalbalk. Stap 2: het afbeeldingstype wordt gewijzigd. Stap 3: er wordt een drempelwaarde toegepast om DAPI-deeltjes te selecteren. Stap 4: er wordt een deeltjesanalyse uitgevoerd en de telling wordt geregistreerd. Stap 5: om het aantal aangesloten feedercellen te bepalen, wordt een samengevoegde afbeelding geteld met behulp van de multi-point tool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Morfologie van verschillende hepatische zaaidichtheden gekweekt met voedercellen. Representatieve beelden op dag 7 en 14 van PHH’s gekweekt met feedercellen (50.000 cellen/putje) bij leverzaaidichtheden van 150.000, 200.000, 250.000 en 300.000 PHH’s/putjes. De foto’s zijn gemaakt met een 10x objectieflens op een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Fluorescerende immunocytochemie van verschillende hepatische seeding-dichtheden gekweekt met feedercellen. (A) Representatieve beelden van cytokeratine 18 (rode) kleuring op dag 14 bij leverzaaidichtheden van 150.000, 200.000, 250.000 en 300.000 PHH’s/putjes. Twee putten voor elke zaaidichtheid werden gedurende 30 minuten bij 4 °C gefixeerd. Putten werden 16-24 uur bij 4° C geïncubeerd met primair antilichaam om 1:1000. Een secundair antilichaam werd gebruikt om 1:500 gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. DAPI (blauwe) nucleaire vlek werd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur aan putten toegevoegd. De foto’s zijn gemaakt met een 10X-objectieflens op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. (B) Berekende aangehechte hepatocyten en percentage plateerbaarheid van verschillende leverzaaidichtheden berekend met behulp van ImageJ. *p ≤ 0,05, tot percentage plateerbaarheid voor 200.000, 250.000 en 300.000 PHH’s/put. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (n ≥ 5 afbeeldingen per voorwaarde). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Albumineproductie van hepatocyten gekweekt met voedingscellen. Albumineproductie uit hepatische zaaidichtheden bij 150.000, 200.000, 250.000 en 300.000 PHH’s/put. Kolommen vertegenwoordigen het 14-daags gemiddelde van microgram albumine/dag genormaliseerd naar het totale aantal aangehechte hepatocyten. Een lijn vertegenwoordigt CV tussen dag 7, 10 en 14. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (n ≥ 2 putjes per conditie met replicaten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Ureumsynthese van hepatocyten gekweekt met voedercellen. Ureumsynthese uit leverzaaidichtheden bij 150.000, 200.000, 250.000 en 300.000 PHH’s/put. De kolommen vertegenwoordigen het 14-daags gemiddelde van μg ureum/dag genormaliseerd naar het totale aantal aangehechte hepatocyten. Een lijn staat voor %CV tussen dag 7, 10 en 14. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (n ≥ 2 putjes per conditie met replicaten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Standaard (S) # Concentratie (μg/ml) Ureumoplossing (μL) Volledige cultuur (μL) 1 100 53.375 mg/dL voorraad 346.7 2 50 100(S1-oplossing) 100 3 25 100(S2-oplossing) 100 4 12.5 100(S3-oplossing) 100 5 6.26 100(S4-oplossing) 100 6 3.125 100(S5-oplossing) 100 7 1.5625 100(S6-oplossing) 100 Blanco 0 0 100 Tabel 1: Ureum standaard monstervoorbereiding. Bereid met 75 mg/dl voorraadureum een ureumoplossing van 100 μg/ml. Aliquot de voorgestelde volumes om de uiteindelijke concentratie voor de standaardcurve te bereiken.

Discussion

Het beschreven leverkweeksysteem kan worden opgezet in laboratoria die zijn uitgerust met standaard weefselkweekinstrumenten. Het systeem bestaat uit PHH’s gekweekt met voedingscellen en stelt de gebruiker in staat om PHH’s gedurende ten minste twee weken te kweken met een stabiele albumineproductie en ureumsynthese. Vanwege de variabiliteit van de PHH-donorpartij worden alleen vooraf gescreende en gekwalificeerde PHH’s aanbevolen voor gebruik in het systeem. Hoewel het aantal aangehechte PHH’s varieert op basis van de donorpartij en de zaaidichtheid, blijft de relatieve plateerbaarheid binnen elke donorpartij vergelijkbaar. Hoewel aanbevolen zaaidichtheden worden geadviseerd, suggereren de bovenstaande gegevens dat de kiemdichtheid van hepatocyten kan worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften; er moet echter worden opgemerkt dat het zaaien van een groter aantal PHH’s mogelijk geen hogere of consistentere functionele output oplevert. Analyse van de geëvalueerde PHH-partijen toonde de laagste CV voor albumineproductie en ureumsynthese met lagere zaaidichtheden van 150.000 PHH’s/put en 200.000 PHH’s/put; Er werden echter geen significante verschillen gevonden tussen albumine en ureum bij enige zaaidichtheid. Hogere zaaidichtheden van 250.000 PHH’s/put en 300.000 PHH’s/put laten een grotere afname van albumine en ureum zien gedurende de kweekperiode van 14 dagen. Inherente donorvariabiliteit in plateerbaarheid kan van invloed zijn op de consistentie van albumineproductie en ureumsynthese bij 250.000 PHH’s/putje en 300.000 PHH’s/putje voor de geteste donorpartijen. Net als bij grote hepatocytsferoïden kan het doorzaaien van PHH’s in het TV2D+-systeem negatieve effecten hebben op de langetermijnkweek en functionaliteit van PHH’s.

Alle stappen in ontdooien, plateren en onderhoud zijn van cruciaal belang voor het succesvol genereren van cultuur en gegevens; Er zijn echter verschillende veelgemaakte fouten die onervaren gebruikers kunnen vermijden. PHH’s zijn zeer gevoelig voor schade als gevolg van temperatuurschommelingen, schuifspanning en blootstelling aan lucht 9,10. Bij het ontdooien van PHH’s moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om langere ontdooitijden en overmatig pipetteren te voorkomen. Het gebruik van een handschenkmethode, een timer en onmiddellijke overdracht van waterbad naar ijs zal deze veelvoorkomende fouten verminderen die de levensvatbaarheid en plateerbaarheid van de PHH’s kunnen beïnvloeden. Bovendien, nu problemen met de toeleveringsketen steeds vaker voorkomen, kan het moeilijk zijn om met collageen beklede platen te verkrijgen. Handmatig coaten van met weefselkweek behandelde platen met behulp van in de handel verkrijgbare oplossingen van collageen type I (5-10 μg/cm2) kan worden gebruikt om dit probleem op te lossen; Voor optimale prestaties en consistentie wordt het echter aanbevolen om voorgecoate collageenplaten te gebruiken. In het proces van overgang van alleen feedercelkweek naar de introductie van PHH’s, is het van cruciaal belang om te voorkomen dat de feedercellaag uitdroogt. Zorg ervoor dat de lucht nooit in aanraking komt met de voedingscellen. Elke blootstellingstijd aan de lucht kan leiden tot een slechte kwaliteit van de voedingscellaag, wat een negatieve invloed zal hebben op de langetermijnkweek van PHH’s. Het is een goede gewoonte om een kleine hoeveelheid restmedium te laten overblijven tussen mediumwisselingen. Af en toe kunnen PHH’s overtollig puin uit isolatie bevatten, wat het bekijken van de morfologie kan bemoeilijken. Om dit probleem op te lossen, schudt u de plaat voordat u het medium verwisselt en gebruikt u vacuümaspiratie. Ten slotte, wanneer u een mediumwissel uitvoert, moet u het gebruikte medium voorzichtig opzuigen en ervoor zorgen dat u de gekweekte cellen niet verstoort. Pipetteer verse, middelgrote hoeveelheden langs de zijkant van de put om te voorkomen dat het rechtstreeks op de cellaag pipetteert. De gebruiker moet ook blootstelling aan de lucht vermijden bij elke mediumwissel, met behulp van de aanbevolen vervanging van 3 putjes (secties 3 en 4). Er moet ook worden opgemerkt dat een dagelijkse mediumwissel ideaal is, maar niet vereist.

Hoewel fluorescentiemicroscopen in de meeste laboratoria gemeengoed zijn geworden, kan software die nodig is om specifieke beeldanalyse uit te voeren, extra kosten met zich meebrengen. ImageJ kan gratis worden gedownload, waardoor het een gemakkelijk toegankelijke tool voor beeldanalyse is. De stappen in het protocol bieden een basis waarop de gebruiker mogelijk moet optimaliseren, met name deeltjesanalyse van DAPI-kleuring; bij gebrek aan fluorescerende beeldvorming worden PHH-hechtingswaarden op dag 14 echter vermeld op partijspecifieke analysecertificaten. Slechte drempelwaarden zullen resulteren in een onnauwkeurige telling van de DAPI-deeltjes. Het wordt ook aanbevolen om het oppervlak van individuele DAPI-deeltjes te controleren voordat u een uitsluiting van de grootte instelt. Dit kan worden bereikt door het ovale pictogram [Figuur 2 (1), cirkelpictogram onder het tabblad Bewerken ] te gebruiken en een cirkel te tekenen die het DAPI-deeltje omvat. Het tabblad Analyseren kan vervolgens worden gebruikt om de oppervlakte van het geselecteerde DAPI-deeltje te meten. Specifieke metingen kunnen worden geselecteerd met behulp van de Set Measurements (Metingen instellen ) op het tabblad Analyseren [stap 8.9 en Figuur 2 (4)].

De huidige methoden voor het kweken van PHH’s omvatten het gebruik van coatings zoals collageen-I voor het verhogen van de celhechting in traditionele 2-dimensionale monocultuur11 of het bedekken met een extracellulaire matrix, zoals de op muizen gebaseerde Matrigel, een techniek die gewoonlijk wordt aangeduid als “sandwichcultuur”12,13,14,15. Hoewel de sandwichcultuurtechniek de morfologie en polariteit van PHH in de loop van de tijd verbetert in vergelijking met traditionele monocultuur, ontbreekt het bij beide benaderingen nog steeds aan fenotypische stabiliteit op lange termijn in de cultuur voor de meeste plateable partijen PHH’s. Een andere methode die wordt gebruikt om PHH’s te kweken, is het maken van 3D-sferoïden; zoals eerder vermeld door Glicklis et al.4, kunnen er echter technische uitdagingen zijn met de reproduceerbaarheid van de sferoïde grootte als gevolg van donorvariabiliteit. In een poging om een fysiologisch relevanter levermodel te maken, zijn meercellige modellen ontwikkeld. Zoals beschreven door Ware et al.7, maakten het gebruik van micropatterning, muizenfibroblasten en primaire menselijke leversinusoïde endotheelcellen omgeven door PHH’s langere in-vitrokweektijden mogelijk. Micropatterning kan echter een complex en tijdrovend proces zijn, en de niet-menselijke feedercellen kunnen bijdragen aan de achtergrond van metabole signalen, waardoor het nut van dit platform in bepaalde toepassingen wordt beperkt. Het gebruik van verschillende niet-levercellen, waaronder menselijke en ratten dermale fibroblasten en runderaorta-endotheelcellen als feedercellen voor co-kweek van hepatocyten, heeft albuminesecretie en tight junction-vorming aangetoond die vergelijkbaar zijn met co-culturen van feedercellen van leveroorsprong16. Het mechanisme van interacties tussen TV2D+ niet-levervoedercellen en de PHH’s in kweek moet echter verder worden onderzocht om de invloed op de stabiliteit en functionaliteit van de PHH’s in dit systeem beter te begrijpen. Het kweeksysteem dat eerder door Weaver et al.8 werd beschreven, kan met succes PHH’s kweken in leverkolonies gedurende maximaal 42 dagen, waarbij uitgebreide galkanaalnetwerken worden gevormd. De PHH’s die in dit systeem werden gekweekt, behielden de belangrijkste leverfunctionaliteit, waaronder cytochroom 1A2-, 2B6- en 3A4-activiteit en op uridine 5′-difosfo-glucuronosyltransferase (UGT) gebaseerde enzymactiviteit, fase I- en II-metabolietvorming, albumineproductie en ureumsynthese gedurende ten minste 22 dagen in vitro zonder matrigel. Dit kweeksysteem produceert stabiele, fysiologisch relevante outputs die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan elk laboratorium voor farmacologische en toxicologische toepassingen. Hoewel de belangrijkste PHH-functies behouden blijven in het TV2D+-systeem, zijn er geen directe vergelijkingen gemaakt met het 3D-sferoïde model; toekomstig werk dat dezelfde PHH-donoren tussen de kweeksystemen vergelijkt, zal echter waardevol blijken te zijn bij het bepalen van de limieten en voordelen van beide methoden.

Mogelijke toepassingen van TV2D+ zijn onder meer evaluatie van metabole klaring en geneesmiddelinteracties van verbindingen met een lage omzet, door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadiging en risicobeoordeling van landbouwchemicaliën. Het nauwkeurig voorspellen van de leverklaring van nieuwe en opkomende geneesmiddelen is afhankelijk van een stabiele en langdurige PHH-kweek met behoud van de belangrijkste hepatocellulaire functionaliteit, wat vooral een uitdaging is bij het evalueren van verbindingen met een lage omzet. Bovendien zijn risicobeoordeling en door chemicaliën geïnduceerde levertoxiciteit belangrijke gezondheidsproblemen, en de huidige modellen bieden niet de stabiliteit en functionaliteit op lange termijn in kweek om potentiële chronische chemische toxiciteit die secundair kan zijn aan acute blootstelling nauwkeurig te evalueren. Gezonde en zieke PHH’s gekweekt in TV2D+ vertoonden karakteristieke verschillen in functie en lipidendispositie die in de loop van de tijd behouden bleven17. Deze studies ondersteunen TV2D+ als een veelbelovend hulpmiddel voor een verscheidenheid aan farmacologische en toxicologische toepassingen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Mellissa Keller en Wendy Hetman bedanken voor hun hulp bij het beoordelen van manuscripten en figuren.

Materials

0.2 µm PES  filter unit  Thermo Fisher Scientific  565-0020 User preference 
15 mL or 50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific  352196 or 352070 User preference 
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific  A-21428 Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody  abcam ab24561 Necessary using same dilution
AOPI  Nexcelom  CS2-0106-5mL Used for Cellometer counting 
Biosafety cabinet  Labconoco 3460801 User preference 
Black-walled, clear bottom, 96-well plate  Thermo Fisher Scientific  165305 User preference 
Centrifuge Thermo Fisher Scientific  Sorvall X4R Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well Greiner Bio-One 662950 Rat tail collagen coating
Counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002 Used for Cellometer counting 
Culture medium  LifeNet Health  MED-TCCM
Culture supplement  LifeNet Health  MED-TCSC
DAPI  Thermo Fisher Scientific  00-4959-52 Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg) Thermo Fisher Scientific  14190250 User preference 
Feeder cell supplement  LifeNet Health  MED-TCSA
Feeder cell thawing medium LifeNet Health  MED-FCTM
Fluorescent microscope  Zeiss AxioObserver Z1 Equipped with user specific filters 
Hepatocyte thawing medium LifeNet Health  MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit  abcam ab108788 Necessary if using same dilution
Human feeder cells LifeNet Health  PHFC24
Humidified incubator  VWR 97025-842 Capable of 5% CO2 
IC Fixation buffer Thermo Fisher Scientific  00-8222-49 Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ National Insitute of Health  Version 1.52a  1.52a or higher 
Inverted phase contrast microscope  Olympus CK40-F100 User preference 
Microcentrifuge tubes VWR 20170-022 User preference 
Micropipettes (various sizes) USA Scientific  ErgoOne User preference 
Permeabilization buffer (10x) Thermo Fisher Scientific  00-8333-56 Other permeabilization buffers can work
Plate reader  BMG Labtech CLARIOstar Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium  LifeNet Health  MED-TCPM
Plating supplement  LifeNet Health  MED-TCSB
Primary human hepatocytes  LifeNet Health  various  Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody  Thermo Fisher Scientific  A-21428 User preference 
Serological pipet controller Gilson  F110120 User preference 
Storage bottle 100–500 mL  VWR 76311-770 User preference 
Urea Nitrogen (BUN) Test  Stanbio 0580-250
Water bath PolyScience WBE05 Capable for use at 37 °C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  2. Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
  3. Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
  4. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  5. Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
  6. Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506 (2021).
  7. Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
  8. Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504 (2023).
  9. Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
  10. Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
  11. Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
  12. Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
  13. Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
  14. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  15. Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  16. Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
  17. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. , 4283 (2023).

Tags

Hepatic Culture SystemPrimary Human HepatocytesIn Vitro PlatformDrug DevelopmentPharmacokineticsMetabolic ClearancePhenotypic StabilityReproducibilityTruVivo2D+ Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Odanga, J. J., Gianulis, E., Whaley, L., LeCluyse, E. L., Presnell, S., Weaver, J. R. An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications. J. Vis. Exp. (200), e65992, doi:10.3791/65992 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image