Avanços técnicos recentes possibilitaram a produção em escala de uma plataforma in vitro para aplicações em metabolismo e toxicidade de fármacos. Um sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) fornece resultados fisiologicamente relevantes usando métodos tradicionais de cultura bidimensional. Esse protocolo dará suporte aos usuários finais na configuração, manutenção e aplicação do sistema.
Encontrar um modelo de cultura relevante para humanos a longo prazo para hepatócitos humanos primários (HPHs) para estudos farmacológicos e toxicológicos permanece um desafio. As plataformas atuais de modelos in vitro são frequentemente inconvenientes e complexas, carecem de estabilidade fenotípica ao longo do tempo e não suportam múltiplos lotes de PHH, carecendo de reprodutibilidade e flexibilidade experimentais. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o descongelamento, plaqueamento e manutenção de um sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+), que aproveita as técnicas e equipamentos de cultura bidimensional (2D) padrão, mantendo a longevidade e a estabilidade fenotípica ao longo do tempo que normalmente acompanham sistemas tridimensionais (3D) mais complexos. Os resultados mostram fixação e porcentagem de plaqueabilidade em TV2D+ em função da densidade de semeadura de PHH, bem como funcionalidade estável por pelo menos 2 semanas em cultura. Uma variedade de densidades de semeadura de PHH é avaliada para alcançar um cultivo bem-sucedido a longo prazo. Quando estabelecidas adequadamente, as HPHs em TV2D+ organizam-se em colônias de hepatócitos, expressam um marcador hepato-específico e mantêm viabilidade, integridade arquitetural e níveis fisiologicamente relevantes de albumina e ureia. Esta combinação única de atributos torna o sistema TV2D+ um modelo hepático adequado para uma variedade de aplicações farmacológicas e toxicológicas.
Predizer a segurança e eficácia terapêutica é uma parte importante do desenvolvimento pré-clínico de medicamentos. No entanto, os modelos hepáticos pré-clínicos convencionais in vitro são limitados em sua capacidade de mimetizar com precisão o microambiente celular hepático in vivo e manter a funcionalidade e a morfologia dos hepatócitos ao longo do tempo. Há necessidade de modelos que forneçam competência metabólica estável por mais de 1 semana para avaliar compostos de turnover lento ou investigar desfechos associados à exposição subaguda ou crônica. Testes in vivo em animais frequentemente falham em predizer a eficácia e o risco do fármaco devido a diferenças translacionais entre espécies e mecanismos de depuração hepática humana1. Os modelos hepáticos atuais in vitro de 2 dimensões (2D), como a monocultura primária tradicional de hepatócitos humanos (PHH) ou culturas sanduíche, carecem de estabilidade fenotípica e longevidade em cultura, levando à perda da função hepatocelular chave e integridade arquitetural ao longo do tempo2. Um método alternativo envolve a formação de esferoides hepatócitos tridimensionais (3D), oferecendo um microambiente mais relevante do que a cultura 2D. Entretanto, esse método é limitado pela disponibilidade de matéria-prima, seleção do lote doador de PHH, reprodutibilidade e perda de viabilidade com o aumento do tamanho do esferoide 3,4,5,6. Plataformas multicelulares foram introduzidas por meio das quais PHHs são semeadas com células alimentadoras em placas de tamanho fixo e micropadronizadas. Embora esses modelos possam permitir tempos de cultivo mais longos, células alimentadoras não humanas usadas nessas plataformas podem alterar os resultados experimentais e limitar sua aplicação devido à contribuição inata de fundo para a depuração de drogas e perfis metabólicos 1,7. O sistema hepático 2D+ totalmente humano TruVivo (TV2D+) recentemente descrito em Weaver, et al8, foi desenvolvido para abordar algumas das limitações dos métodos tradicionais, de co-cultivo e de cultura 3D de HPHs. As células não alimentadoras de fígado reduzem as diferenças interespécies no metabolismo e na produção parácrina e fornecem o suporte necessário para hepatócitos primários de forma reprodutível e robusta que não pode ser fornecida por células hepáticas não parenquimatosas correspondentes de um único lote de doadores devido a limitações na expansão, fenótipo e desempenho. As células alimentadoras escolhidas foram capazes de ser consistentemente expandidas antes do uso e não tiveram a necessidade de transformação ou diferenciação. Como descrito por Glicklis et al.4 e Khetani et al.5, modelos de cultura 3D como os esferoides de hepatócitos apresentam desafios com a reprodutibilidade devido à variabilidade do doador e à manutenção da consistência no tamanho do esferoide, o que afeta a difusão de nutrientes em esferoides maiores que 200 μm, levando à diminuição da viabilidade e funcionalidade. Como a formação esferoide 3D, o sistema TV2D+ depende da auto-montagem de PHHs; no entanto, as colônias de PHH formadas estão dispersas sobre a área superficial do poço a uma profundidade de célula única, em vez de compactadas em um único agregado. Este método de cultura pode ser útil para abordar a variabilidade do doador, permitindo que os PHHs sejam plaqueados, cultivados e mantenham a funcionalidade básica em várias densidades de semeadura. O sistema TV2D+ também pode aumentar a robustez do manuseio do usuário devido à perda durante a manipulação ou equipamentos especializados necessários para realizar cultura estendida em esferoides 3D.
O sistema TV2D+ combina a cultura 2D padrão com a longevidade e estabilidade fenotípica que normalmente acompanham os sistemas 3D. O protocolo aqui descrito fornece instruções passo a passo para usuários com habilidades básicas de cultura de tecidos em laboratórios equipados com equipamentos padrão, como gabinetes de biossegurança, centrífugas e incubadoras de CO2 . Cada etapa do processo é descrita em detalhes, incluindo a preparação do meio, descongelamento, chapeamento e manutenção do sistema de cultura resultante. O protocolo também contém um método para determinar as saídas básicas da funcionalidade dos hepatócitos, albumina e ureia, bem como análise de imagens de imunofluorescência para determinar a fixação de HPH para normalização. Quando adequadamente estabelecidos, os HPHs em TV2D+ organizam-se em colônias de hepatócitos, mimetizando a morfologia hepática nativa, e mantêm viabilidade prolongada, integridade arquitetural e níveis fisiologicamente relevantes de albumina e ureia por pelo menos 2 semanas8. Como o sistema pode permitir uma variedade de densidades de semeadura de PHH, ele pode ser útil para aumentar a disponibilidade de lotes de PHH menos plaqueáveis que tenham características desejáveis de doadores. Esta combinação de acessibilidade e funcionalidade faz do TV2D+ um modelo hepático adequado para uma variedade de aplicações farmacológicas e toxicológicas.
O sistema de cultura hepática descrito pode ser estabelecido em laboratórios equipados com instrumentação padrão para cultura de tecidos. Composto por PHHs cultivadas com células alimentadoras, o sistema permite ao usuário cultivar PHHs por pelo menos duas semanas com produção estável de albumina e síntese de ureia. Devido à variabilidade do lote de doadores de HPH, apenas HPHs pré-triadas e qualificadas são recomendadas para uso no sistema. Embora o número de HPHs anexadas varie com base no lote doador e na densidade de semeadura, a plaqueabilidade relativa permanece semelhante dentro de cada lote doador. Embora as densidades de semeadura recomendadas sejam recomendadas, os dados acima sugerem que a densidade de semeadura de hepatócitos pode ser ajustada para diferentes necessidades experimentais; no entanto, deve-se notar que semear um número maior de HPHs pode não fornecer saídas funcionais mais altas ou mais consistentes. A análise dos lotes de HPH avaliados mostrou o menor CV para produção de albumina e síntese de ureia utilizando menores densidades de semeadura de 150.000 PHHs/poço e 200.000 PHHs/poço; no entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre albumina e ureia em qualquer densidade de semeadura. Maiores densidades de semeadura de 250.000 PHHs/poço e 300.000 PHHs/poço mostram maior diminuição de albumina e ureia ao longo dos 14 dias de cultivo. A variabilidade inerente do doador na platabilidade pode afetar a consistência da produção de albumina e a síntese de ureia em 250.000 PHHs/poço e 300.000 PHHs/poço para os lotes de doadores testados. Semelhante aos grandes esferoides hepatócitos, a sobresemeadura de PHHs no sistema TV2D+ pode ter efeitos negativos sobre a cultura e a funcionalidade a longo prazo de HPHs.
Todas as etapas de descongelamento, chapeamento e manutenção são críticas para o sucesso da cultura e da geração de dados; No entanto, existem vários erros comuns que usuários inexperientes podem evitar. Os HPHs são altamente suscetíveis a danos secundários à flutuação de temperatura, tensão de cisalhamento e exposição ao ar 9,10. Precauções devem ser tomadas ao descongelar PHHs para evitar períodos prolongados de descongelamento e pipetagem excessiva. O uso de um método de derramamento manual, um temporizador e a transferência imediata do banho-maria para o gelo reduzirão esses erros comuns que podem afetar a viabilidade e a plaqueabilidade dos HPHs. Além disso, com os problemas da cadeia de suprimentos se tornando mais comuns, pode ser difícil obter placas revestidas com colágeno. O revestimento manual de placas tratadas com cultura de tecidos utilizando soluções comerciais de colágeno tipo I (5-10 μg/cm2) pode ser utilizado para superar essa questão; No entanto, para um ótimo desempenho e consistência, recomenda-se o uso de placas de colágeno pré-revestidas. No processo de transição da cultura somente de células alimentadoras para a introdução de PHHs, é fundamental evitar que a camada de células alimentadoras seque. Nunca permita a exposição do ar às células alimentadoras. Qualquer tempo de exposição ao ar pode levar a uma má qualidade da camada de células alimentadoras, o que afetará negativamente a cultura de PHHs a longo prazo. É uma prática recomendada permitir que uma pequena quantidade de meio residual permaneça entre as mudanças médias. Ocasionalmente, os HPHs podem conter excesso de detritos provenientes do isolamento, o que pode dificultar a visualização da morfologia. Para ajudar com esse problema, agite a placa antes de uma troca de meio e use aspiração a vácuo. Finalmente, ao realizar uma troca de meio, aspirar cuidadosamente o meio gasto, tomando cuidado para não perturbar as células cultivadas. Pipetar o volume médio fresco na lateral do poço para evitar a pipetagem diretamente na camada celular. O usuário também deve evitar a exposição ao ar a cada mudança de meio, usando a troca recomendada de 3 poços (Seções 3 e 4). Deve-se notar também que uma mudança de meio diária é ideal, mas não necessária.
Embora microscópios fluorescentes tenham se tornado comuns na maioria dos laboratórios, softwares necessários para realizar análises específicas de imagens podem incorrer em despesas adicionais. O ImageJ pode ser baixado gratuitamente, tornando-se uma ferramenta de análise de imagens de fácil acesso. As etapas do protocolo fornecem uma base para a qual o usuário pode precisar otimizar, especificamente a análise de partículas da coloração DAPI; no entanto, na ausência de capacidade de imagem fluorescente, os valores de fixação de PHH no dia 14 são fornecidos em certificados de análise específicos do lote. Um limiar deficiente resultará em uma contagem imprecisa das partículas DAPI. Também é recomendável verificar a área de superfície de partículas DAPI individuais antes de definir uma exclusão de tamanho. Isso pode ser feito usando o ícone Oval [Figura 2 (1), ícone de círculo abaixo da guia Editar ] e desenhando um círculo que engloba a partícula DAPI. A guia Analisar pode ser usada para medir a área da partícula DAPI selecionada. Medidas específicas podem ser selecionadas usando o conjunto de medidas na guia Analisar [etapa 8.9 e Figura 2 (4)].
Os métodos atuais de cultivo de HPHs envolvem o uso de revestimentos como o colágeno-I para aumentar a fixação celular na monocultura tradicional de 2dimensões11 ou sobreposição com uma matriz extracelular, como o Matrigel à base de murina, uma técnica comumente referida como “cultura sanduíche”12,13,14,15. Embora a técnica de cultura sanduíche melhore a morfologia e polaridade do PHH ao longo do tempo em comparação com a monocultura tradicional, ambas as abordagens ainda carecem de estabilidade fenotípica em longo prazo na cultura para a maioria dos lotes plaqueáveis de PHHs. Outro método usado para cultivar PHHs é fazer esferoides 3D; no entanto, como dito anteriormente por Glicklis et al.4, pode haver desafios técnicos com a reprodutibilidade do tamanho do esferoide devido à variabilidade do doador. Em um esforço para fazer um modelo hepático fisiologicamente mais relevante, modelos multicelulares têm sido desenvolvidos. Como descrito por Ware et al.7, o uso de micropadronização, fibroblastos murinos e células endoteliais sinusóides hepáticas primárias humanas cercadas por HPHs possibilitaram maior tempo de cultivo in vitro. No entanto, a micropadronização pode ser um processo complexo e demorado, e as células alimentadoras não humanas podem contribuir para o background em sinais metabólicos, limitando a utilidade dessa plataforma em determinadas aplicações. O uso de várias células não-hepáticas, incluindo fibroblastos dérmicos humanos e de ratos e células endoteliais da aorta bovina como células alimentadoras para co-cultura de hepatócitos, tem mostrado secreção de albumina e formação de tight junction semelhante às co-culturas de células alimentadoras de origemhepática16. No entanto, o mecanismo de interações entre as células não-alimentadoras de TV2D+ e os HPHs em cultura precisa ser mais bem investigado para melhor compreender a influência na estabilidade e funcionalidade dos HPHs neste sistema. O sistema de cultura previamente descrito por Weaver et al.8 pode cultivar HPHs com sucesso em colônias hepáticas por até 42 dias, formando extensas redes biliares canaliculares. Os PHHs cultivados neste sistema mantiveram a funcionalidade hepática chave, incluindo a atividade do citocromo 1A2, 2B6 e 3A4 e a atividade enzimática baseada na uridina 5′-difosfo-glucuroniltransferase (UGT), formação de metabólitos de fase I e II, produção de albumina e síntese de ureia por pelo menos 22 dias in vitro sem Matrigel. Este sistema de cultura produz resultados estáveis e fisiologicamente relevantes que são facilmente adaptáveis a qualquer laboratório para aplicações farmacológicas e toxicológicas. Embora as principais funções PHH sejam mantidas no sistema TV2D+, nenhuma comparação direta foi feita com o modelo esferoide 3D; no entanto, trabalhos futuros comparando os mesmos doadores de HPH entre os sistemas de cultura serão valiosos para determinar os limites e vantagens de ambos os métodos.
Aplicações potenciais do TV2D+ incluem avaliação da depuração metabólica e interações medicamentosas de compostos de baixa rotação, lesão hepática induzida por drogas e avaliação de risco de agroquímicos. A previsão precisa da depuração hepática de drogas novas e emergentes depende de uma cultura de PHH estável e prolongada com retenção da funcionalidade hepatocelular chave, o que é particularmente desafiador quando se avaliam compostos de baixo turnover. Além disso, a avaliação de risco e a toxicidade hepática induzida por produtos químicos são grandes preocupações para a saúde, e os modelos atuais não fornecem estabilidade e funcionalidade a longo prazo em cultura para avaliar com precisão a potencial toxicidade química crônica que pode ser secundária à exposição aguda. HPHs saudáveis e doentes cultivadas em TV2D+ mostraram diferenças características na função e disposição lipídica que foram mantidas ao longo do tempo17. Estes estudos suportam TV2D+ como uma ferramenta promissora para uma variedade de aplicações farmacológicas e toxicológicas.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Mellissa Keller e Wendy Hetman por sua assistência com a revisão de manuscritos e figuras.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |