Недавние технические достижения позволили масштабировать производство платформы in vitro для применения в метаболизме и токсичности лекарств. Полностью человеческая 2D+ печеночная система (TV2D+) обеспечивает физиологически значимые результаты с использованием традиционных двумерных методов культивирования. Этот протокол поможет конечным пользователям в установке, обслуживании и применении системы.
Поиск долгосрочной, релевантной для человека модели культивирования первичных гепатоцитов человека (ПГХ) для фармакологических и токсикологических исследований остается сложной задачей. Современные платформы моделей in vitro часто неудобны и сложны, им не хватает фенотипической стабильности с течением времени, и они не поддерживают несколько партий PHH, не обладая экспериментальной воспроизводимостью и гибкостью. Здесь мы приводим подробный протокол размораживания, гальванизации и обслуживания полностью человеческой 2D+ печеночной системы (TV2D+), которая использует преимущества стандартных двухмерных (2D) методов и оборудования для культивирования, сохраняя при этом долговечность и фенотипическую стабильность с течением времени, которые обычно сопровождают более сложные трехмерные (3D) системы. Результаты показывают прикрепление и процентную пластинчатость у TV2D+ в зависимости от плотности посева PHH, а также стабильную функциональность в течение не менее 2 недель в культуре. Для получения успешной культуры в течение длительного времени оценивается диапазон плотности посева PHH. При правильном установлении PHH в TV2D+ организуются в колонии гепатоцитов, экспрессируют печенкоспецифический маркер и поддерживают жизнеспособность, архитектурную целостность и физиологически значимые уровни альбумина и мочевины. Это уникальное сочетание свойств делает систему TV2D+ подходящей моделью печени для различных фармакологических и токсикологических применений.
Прогнозирование терапевтической безопасности и эффективности является важной частью доклинической разработки лекарственных средств. Тем не менее, традиционные доклинические модели печени in vitro ограничены в своей способности точно имитировать клеточное микроокружение печени in vivo и поддерживать функциональность и морфологию гепатоцитов с течением времени. Существует потребность в моделях, обеспечивающих стабильную метаболическую компетентность в течение более 1 недели, для оценки соединений с медленным оборотом или исследования исходов, связанных с подострым или хроническим воздействием. Тесты in vivo на животных часто не позволяют предсказать эффективность и риск лекарства из-за трансляционных видовых различий в механизмах клиренса печени человека1. Существующие in vitro 2-мерные (2D) модели печени, такие как традиционная монокультура первичных гепатоцитов человека (ПГГ) или сэндвич-культуры, не обладают фенотипической стабильностью и долговечностью в культуре, что приводит к потере ключевой гепатоцеллюлярной функции и архитектурной целостности с течением времени2. Альтернативный метод включает в себя формирование трехмерных (3D) сфероидов гепатоцитов, предлагая более релевантное микроокружение по сравнению с 2D-культурой. Однако этот метод ограничен доступностью сырья, выбором донорной партии ПГХ, воспроизводимостью и потерей жизнеспособности при увеличении размера сфероида 3,4,5,6. Были введены многоклеточные платформы, с помощью которых PHH засеваются с фидерными клетками на пластины фиксированного размера с микроузорами. Несмотря на то, что эти модели могут обеспечить более длительное время культивирования, нечеловеческие питательные клетки, используемые в этих платформах, могут изменить результаты экспериментов и ограничить их применение из-за врожденного фонового вклада в клиренс лекарств и метаболические профили 1,7. Полностью человеческая печеночная система 2D+ (TV2D+) TruVivo, недавно описанная в работе Weaver, et al8, была разработана для устранения некоторых ограничений традиционных, кокультурных и 3D-методов культивирования ПГХ. Непеченочные питающие клетки уменьшают межвидовые различия в метаболизме и продукции паракринов и обеспечивают поддержку, необходимую для первичных гепатоцитов, воспроизводимым и надежным образом, который не может быть обеспечен соответствующими непаренхиматозными клетками печени из одной донорской партии из-за ограничений в экспансии, фенотипе и производительности. Выбранные фидерные клетки могли быть последовательно расширены перед использованием и не нуждались в трансформации или дифференцировке. Как описано Glicklis et al.4 и Khetani et al.5, 3D-модели культивирования, такие как сфероиды гепатоцитов, имеют проблемы с воспроизводимостью из-за вариабельности доноров и поддержания постоянства размера сфероида, что влияет на диффузию питательных веществ в сфероидах размером более 200 мкм, что приводит к снижению жизнеспособности и функциональности. Как и формирование 3D-сфероида, система TV2D+ основана на самосборке PHH; однако образующиеся колонии PHH рассредоточены по поверхности скважины на глубине одной ячейки, а не уплотнены в единый агрегат. Этот метод культивирования может быть полезен для решения проблемы вариабельности доноров, позволяя распределять PHH, культивировать и сохранять основные функциональные возможности при различной плотности посева. Система TV2D+ также может повысить надежность работы с пользователем из-за потерь во время манипуляций или специализированного оборудования, необходимого для выполнения расширенного культивирования в 3D-сфероидах.
Система TV2D+ сочетает в себе стандартную 2D-культуру с долговечностью и фенотипической стабильностью, которые обычно сопровождают 3D-системы. Протокол, описанный в настоящем документе, содержит пошаговые инструкции для пользователей, обладающих базовыми навыками культивирования тканей в лабораториях, оснащенных стандартным оборудованием, таким как шкафы биобезопасности, центрифуги и инкубаторыCO2 . Подробно описан каждый этап процесса, включая подготовку среды, размораживание, нанесение покрытия и обслуживание полученной системы культивирования. Протокол также содержит метод определения основных выходов функциональности гепатоцитов, альбумина и мочевины, а также иммунофлуоресцентный анализ изображений для определения прикрепления PHH для нормализации. При правильном установлении PHH в TV2D+ организуются в колонии гепатоцитов, имитируя нативную морфологию печени, и поддерживают расширенную жизнеспособность, архитектурную целостность и физиологически значимые уровни альбумина и мочевины в течение не менее 2 недель8. Поскольку система может допускать диапазон плотности посева PHH, она может быть полезна для увеличения доступности менее пригодных для пластин партий PHH, которые имеют желаемые характеристики донора. Такое сочетание доступности и функциональности делает TV2D+ подходящей моделью печени для различных фармакологических и токсикологических применений.
Описанная система культивирования печени может быть установлена в лабораториях, оснащенных стандартным оборудованием для культивирования тканей. Система, состоящая из ПГХ, культивируемых с помощью фидерных клеток, позволяет пользователю культивировать ПГГ в течение не менее двух недель со стабильным производством альбумина и синтезом мочевины. Из-за вариабельности партий доноров PHH для использования в системе рекомендуются только предварительно проверенные и квалифицированные PHH. Несмотря на то, что количество прикрепленных PHH варьируется в зависимости от донорской партии и плотности посева, относительная пластинчатость остается одинаковой в пределах каждой донорской партии. Несмотря на то, что рекомендуется рекомендуемая плотность посева, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что плотность засева гепатоцитов может быть скорректирована для различных экспериментальных нужд; однако следует отметить, что посев большего количества PHH может не обеспечить более высоких или более стабильных функциональных результатов. Анализ оцененных партий PHH показал самые низкие CV для производства альбумина и синтеза карбамида при более низкой плотности посева 150 000 PHHs/скважина и 200 000 PHH/скважина; Однако существенных различий между альбумином и мочевиной при любой плотности посева обнаружено не было. Более высокая плотность посева 250 000 PHH на лунку и 300 000 PHH на лунку свидетельствует о большем снижении альбумина и мочевины в течение 14-дневного периода культивирования. Присущая донору вариабельность пластинчатости может влиять на стабильность продукции альбумина и синтеза мочевины при 250 000 ПГХ/лунку и 300 000 ПГХ/лунку для исследованных донорских партий. Как и в случае с крупными сфероидами гепатоцитов, пересев PHH в системе TV2D+ может иметь негативные последствия для долгосрочного культивирования и функциональности PHH.
Все этапы размораживания, нанесения покрытия и технического обслуживания имеют решающее значение для успешной культуры и создания данных; Однако есть несколько распространенных ошибок, которых неопытные пользователи могут избежать. PHH очень восприимчивы к повреждениям, вызванным колебаниями температуры, напряжением сдвига и воздействием воздуха 9,10. При размораживании ПГХ следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать длительных сроков размораживания и чрезмерного пипетирования. Использование метода ручной заливки, таймера и немедленного переноса с водяной бани на лед уменьшит эти распространенные ошибки, которые могут повлиять на жизнеспособность и пластинчатость PHH. Кроме того, в связи с тем, что проблемы с цепочками поставок становятся все более распространенными, может быть трудно получить пластины с коллагеновым покрытием. Для решения этой проблемы можно использовать ручное покрытие планшетов, обработанных культурой тканей, коммерческими растворами коллагена типа I (5-10 мкг/см2); Тем не менее, для оптимальной производительности и консистенции рекомендуется использовать предварительно покрытые коллагеновые пластины. В процессе перехода от культивирования только фидерных клеток к введению ПГХ крайне важно не допустить высыхания слоя фидерных клеток. Никогда не допускайте попадания воздуха на ячейки питателя. Любое время воздействия воздуха может привести к ухудшению качества слоя питательных клеток, что негативно скажется на долгосрочном культивировании ПГХ. Рекомендуется оставлять небольшое количество остаточной среды между сменами среды. В некоторых случаях PHH могут содержать избыток мусора от изоляции, что может затруднить изучение морфологии. Чтобы решить эту проблему, встряхните пластину перед заменой среды и используйте вакуумную аспирацию. Наконец, при смене среды осторожно аспирируйте отработанную среду, стараясь не повредить культивируемые клетки. Нанесите пипетку свежего среднего объема вниз по краю лунки, чтобы избежать пипетирования непосредственно на клеточный слой. Пользователь также должен избегать воздействия воздуха при каждой смене среды, используя рекомендуемую замену 3 лунок (разделы 3 и 4). Следует также отметить, что ежедневная смена среды идеальна, но не обязательна.
Несмотря на то, что флуоресцентные микроскопы стали обычным явлением в большинстве лабораторий, программное обеспечение, необходимое для выполнения специфического анализа изображений, может повлечь за собой дополнительные расходы. ImageJ можно скачать бесплатно, что делает его легкодоступным инструментом анализа изображений. Шаги, описанные в протоколе, обеспечивают основу, которую пользователю может потребоваться оптимизировать, в частности, анализ частиц при окрашивании DAPI; однако, при отсутствии возможности флуоресцентной визуализации, значения прикрепления PHH на 14-й день указываются в сертификатах анализа для конкретной партии. Плохое пороговое значение приведет к нетточному подсчету частиц DAPI. Также рекомендуется проверить площадь поверхности отдельных частиц DAPI перед установкой исключения по размеру. Этого можно достичь, используя значок овала [Рисунок 2 (1), значок круга под вкладкой Редактировать ] и нарисовав круг, охватывающий частицу DAPI. Вкладка Analyze (Анализ) может быть использована для измерения площади выбранной частицы DAPI. Конкретные измерения можно выбрать с помощью Set Measurements на вкладке Analyze (Анализ) [шаг 8.9 и Рисунок 2 (4)].
Современные методы культивирования PHH включают использование покрытий, таких как коллаген-I, для увеличения прикрепления клеток в традиционной 2-мерноймонокультуре11 или наложение внеклеточного матрикса, такого как мышиный Matrigel, метод, обычно называемый «сэндвич-культурой»12,13,14,15. Несмотря на то, что метод сэндвич-культивирования со временем улучшает морфологию и полярность PHH по сравнению с традиционной монокультурой, обоим подходам по-прежнему не хватает долгосрочной фенотипической стабильности в культуре для большинства пластинчатых партий PHH. Другим методом, используемым для культивирования PHH, является создание 3D-сфероидов; однако, как ранее указывали Glicklis et al.4, могут возникнуть технические проблемы с воспроизводимостью размера сфероида из-за вариабельности донора. В попытке создать более физиологически релевантную модель печени были разработаны многоклеточные модели. Как описано Ware et al.7, использование микропаттернов, мышиных фибробластов и первичных эндотелиальных клеток синусоидальной формы печени человека, окруженных PHH, позволило увеличить время культивирования in vitro. Тем не менее, микропаттернирование может быть сложным и трудоемким процессом, и нечеловеческие клетки-кормушки могут вносить свой вклад в фон метаболических сигналов, ограничивая полезность этой платформы в определенных приложениях. Использование различных непеченочных клеток, включая дермальные фибробласты человека и крысы и эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого скота, в качестве фидерных клеток для совместного культивирования гепатоцитов показало секрецию альбумина и образование плотных соединений, сходных с кокультурами фидерных клеток печеночного происхождения16. Тем не менее, механизм взаимодействия между непеченочными клетками, питающимися TV2D+, и PHH в культуре нуждается в дальнейшем исследовании, чтобы лучше понять влияние на стабильность и функциональность PHH в этой системе. Культуральная система, ранее описанная Weaver et al.8, может успешно культивировать PHH в печеночных колониях в течение 42 дней, образуя обширные желчно-каналикулярные сети. ПГХ, культивируемые в этой системе, поддерживали ключевые функции печени, включая активность цитохрома 1A2, 2B6 и 3A4 и активность фермента на основе уридина-5′-дифосфо-глюкуронозилтрансферазы (UGT), образование метаболитов I и II фазы, продукцию альбумина и синтез мочевины в течение не менее 22 дней in vitro без матригеля. Эта система культивирования дает стабильные, физиологически значимые результаты, которые легко адаптируются к любой лаборатории для фармакологического и токсикологического применения. Несмотря на то, что ключевые функции PHH сохраняются в системе TV2D+, прямых сравнений с 3D-моделью сфероида не проводилось; тем не менее, будущая работа по сравнению одних и тех же доноров PHH между системами культивирования окажется ценной для определения ограничений и преимуществ обоих методов.
Потенциальные применения TV2D+ включают оценку метаболического клиренса и лекарственного взаимодействия соединений с низким оборотом, лекарственно-индуцированное повреждение печени и оценку риска агрохимикатов. Точное прогнозирование печеночного клиренса новых и перспективных лекарственных средств зависит от стабильного и пролонгированного посева ПГХ с сохранением ключевой гепатоцеллюлярной функциональности, что особенно сложно при оценке соединений с низкой оборачиваемостью. Кроме того, оценка риска и химически индуцированная токсичность для печени являются серьезными проблемами для здоровья, а существующие модели не обеспечивают долгосрочную стабильность и функциональность культуры для точной оценки потенциальной хронической химической токсичности, которая может быть вторичной по отношению к острому воздействию. Здоровые и больные ПГХ, культивируемые в TV2D+, показали характерные различия в функции и липидном расположении, которые сохранялись с течением времени17. Эти исследования подтверждают, что TV2D+ является многообещающим инструментом для различных фармакологических и токсикологических применений.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Меллиссу Келлер и Венди Хетман за помощь в рецензировании рукописей и рисунков.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |