創薬応用のための全ヒト肝培養システム

このプロトコルは、ライフネットヘルスの倫理委員会のガイドラインに従っています。この原稿には、著者が実施したヒトを対象とした研究や動物実験は含まれていません。すべての細胞は、ライフネットヘルスが研究目的で完全に同意したドナー組織から単離されました。 1. 培地の調製 フィーダーセル解凍培地、サプリメントA、サプリメントB、およびサプリメントC( 材料表を参照)をそれぞれ1本ずつ、37°Cのウォーターバスまたは4°Cで16〜24時間解凍します。 フィーダーセル融解培地のボトル全体(10 mL)を15 mLまたは50 mLのコニカルチューブに分注します。注:細胞ペレットのサイズは、15 mLのコニカルチューブを使用すると見やすくなります。 めっき剤1本(75mL)( 資料表参照)に、4.5mLのサプリメントBと11mLのサプリメントAを加えて、完全なめっき剤を作ります。注:完全なめっき媒体の濃度はFBS<5%v / vです。 別のボトルに、100 mLの培地( 材料表を参照)、1 mLのサプリメントC、および14 mLのサプリメントAを加えて、完全な培地を作ります。注:完全培地の濃度はFBS<1%v/vです。 残りのサプリメントCとサプリメントAは、2週目の培地調製まで-20°Cで保管してください。注:凍結融解サイクルを繰り返すと、サプリメントの保存期間が短くなります。凍結融解は1回のみにすることをお勧めします。 使用前に、フィーダー細胞融解培地、肝細胞融解培地、完全めっき培地、および完全培養培地10mLを37°Cのウォーターバスで20〜30分間加温します。 2. ヒトフィーダー細胞の融解、計数、プレーティング(図1A) PHHを播種する約1時間前にフィーダー細胞を培養し、フィーダー細胞( 材料表を参照)を37°Cのウォーターバスで1〜2分間解凍します。注:長時間の曝露(例:>2分)を避けて、バイアルの解凍を監視し、反転させたときにクライオバイアル内で液体が緩んだ場合は取り除いてください。 解凍後すぐに、フィーダーセルを氷の上に置きます。 無菌技術を用いて、バイオセーフティキャビネット(BSC)内で、新たに融解した細胞を10 mLのフィーダー細胞融解培地に添加します。 1000 μLのピペットを使用して、1 mLの細胞/融解培地懸濁液でバイアルを1回洗浄し、回収します。 室温(RT)で400 x g で4分間回転させます。 上清は、細胞ペレットを乱さないように、ピペッティングまたは真空吸引によって慎重に廃棄してください。細胞ペレットを1 mLの完全めっき培地に再懸濁し、フィーダー細胞をカウントします。注:フィーダー細胞は、自動セルカウンターでアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム(AOPI)を使用するか、血球計算盤を使用してトリパンブルーを使用してカウントできます。細胞数は、技術やユーザーによって異なる場合があります。最良の結果を得るには、重複するサンプルをカウントし、選択した方法論で一貫性を保ちます。 細胞懸濁液を100,000細胞/mLに希釈し、完全なめっき培地を使用します。 希釈した細胞懸濁液を1ウェルあたり500 μL(50,000細胞)を、コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに播種します( 材料表を参照)。 プレートを北(N)-南(S)-東(E)-西(W)の運動で、N-S方向に2回前後に動かし、その後同じ運動E-Wで振る。この振とうプロトコルをさらに2回繰り返し、合計3ラウンド行います。注:細胞の分布を補助しながら、プレートの蓋に飛び散らないように、適度な力で振とうを行ってください(ビデオを参照してください)。 37°C/5%CO2 で60分間インキュベートします。 肝細胞の融解に進む前に、フィーダー細胞の付着を確認してください。注:許容されるフィーダーセルの付着は、視覚的に約50%のコンフルエントです。 3. 初代ヒト肝細胞の融解、計数、プレーティング(図1B) 30分間のフィーダー細胞培養後、予熱した肝細胞融解培地を0.2 μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターユニットでろ過します。 PHHを37°Cのウォーターバスで1〜2分間解凍します。注:長時間の曝露(例:>2分)を避けて、バイアルの解凍を監視し、反転させたときにクライオバイアル内で液体が緩んだ場合は取り除いてください。 解凍後すぐに、PHHを氷の上に置きます。 BSCでは、PHH懸濁液を肝細胞融解培地に注ぎます。注:可能であれば、PHH細胞懸濁液のピペッティングは避けてください。凍結したPHHをクライオバイアルから融解培地に移す際にピペッティングを行わないことが最も重要です。 1000 μLのピペットを使用して、1 mLの肝細胞/融解培地懸濁液をバイアルに静かにピペッティングし、解凍培地に注いで洗浄液を回収することにより、バイアルを3〜4回洗浄します。 解凍したPHH懸濁液に蓋をして、5回静かに裏返します。 室温で 100 x g で 8 分間スピンします。 上清は、細胞ペレットを乱さないように、ピペッティングまたは真空吸引によって慎重に廃棄してください。円錐形チューブの壁に、3 mLの完全なめっき媒体を追加します。 円錐形のチューブを左右に揺らして、細胞ペレットを再懸濁します。 再懸濁した肝細胞にさらに5 mLの完全めっき培地を加えます。 PHHを数えます。注:PHHは、自動セルカウンターでAOPIを使用してカウントするか、血球計算盤を使用してトリパンブルーを使用してカウントできます。細胞数は、技術やユーザーによって異なる場合があります。最良の結果を得るには、重複するサンプルをカウントし、選択した方法論で一貫性を保ちます。 完全なめっき培地を使用して、細胞懸濁液を所望の播種密度(300,000-600,000 PHHs/mL)に希釈します。注:最適な肝細胞播種密度は、ロットごとに異なる場合があります。特定のロットの推奨播種密度は、分析証明書(COA)に記載されています。以下の式を使用して、24ウェルプレートの肝細胞/mLを決定します。 播種したフィーダーセルから、ピペッティングまたは真空吸引により培地を除去します。注:フィーダーセルの生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 希釈した肝細胞懸濁液のウェルあたり500μL(150,000〜300,000細胞)を、フィーダー細胞を含むプレコートされたコラーゲン24ウェルプレートに直ちにプレーティングします。 N-S方向に前後に2回、同じ動きE-Wを使用して、プレートをN-S-E-Wの動きで振る。この振とうプロトコルをさらに2回繰り返し、合計3ラウンド行います。注意: 細胞の分布を補助しながら、プレートの蓋に飛び散らないように、適度な力で振とうを行ってください。 37°C/5%CO2 で2〜4時間インキュベートします。培養の最初の60分間は、上記のステップ3.15と同様に、N-S-E-W運動で15分ごとにプレートを振とうします。 インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り外し、BSCに入れます。 プレートを振とうし、ピペッティングまたは真空吸引により完全なめっき媒体を除去します。注:培養の生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 予熱した完全培地500μLを直ちに各ウェルに加えます。 4. メンテナンス 37°Cのウォーターバスで20〜30分間分注し、完全培養液を予備温めます。 24ウェルプレート1枚に約13.5 mLの培地が必要です。 ウェルあたり500 μLの新鮮な予熱済み完全培地を毎日培養します。注:培養の生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 7日ごとに新しい完全培地を調製します。 5. アルブミン・尿素測定のための培養上清試料の採取 7日目、10日目、14日目に、 図1Cに示すように、目的のサンプルウェルから500 μLの培地を微量遠心チューブに集めます。 サンプルを 320 x g で 4 °C で 10 分間遠気し、破片をペレット化します。 ピペットを使用してサンプル上清を新しい微量遠心チューブに移し、ペレットの破壊を回避します。 アルブミンアッセイおよび/または尿素アッセイでサンプルを実行します(それぞれセクション10および11を参照)。注:サンプルは-20°C〜-80°Cで2週間保存できます。 6. 染色1日目 注意:固定バッファーにはパラホルムアルデヒドが含まれています。パラホルムアルデヒドは、眼の損傷、皮膚の炎症、臓器毒性を引き起こす可能性があります。換気の良い場所で作業し、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。 14日目に培地サンプルを採取した後、図1Cに示すように、染色する各ウェルに300 μLの固定バッファー(材料表を参照)を添加します。最低2ウェルを染色します。 4°Cで20〜60分間インキュベートします。 5 mL の 10 倍ストック溶液を 45 mL の 1x PBS に加えて、1 倍透過処理バッファー( 材料表を参照)を調製します( 材料表を参照)。注:1x透過処理バッファーは、4°Cで1か月間保存できます。 氷上で300 μLの1x透過処理バッファーで2回洗浄します。 300 μL の一次抗体サイトケラチン 18( 材料表を参照)を、氷上の 1x 透過処理バッファーに 1:1000 の希釈液で添加します。注:少なくとも、1つのウェルを1x透過処理バッファーとインキュベートするのは、二次抗体のみのコントロールの場合に限ります。 4°Cで16〜24時間インキュベートします。 7. 染色2日目 翌日、ピペッティングまたは真空吸引により一次抗体を除去します。 ウェルあたり300 μLの1x透過処理バッファーを氷上で2回洗浄します。 1x透過処理バッファーに1:500希釈して300 μLの蛍光二次抗体( 材料表を参照)を加えます(二次コントロールのみを含む)。注:蛍光抗体を使用する際は、光を避けてください。 暗所で4°Cで30〜45分間インキュベートします。 二次抗体をピペッティングまたは真空吸引により除去します。 ウェルあたり300 μLの1x透過処理バッファーを氷上で2回洗浄します。 1 ウェルあたり 300 μL の 1x PBS で 1 回洗浄します。 150 μLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)封入培地( 材料表を参照)を各ウェルに添加し、室温で暗所で15分間インキュベートします。注:プレートはパラフィルムで包み、暗所で4°Cで1週間保存できます。 蛍光顕微鏡で見る。10倍の対物レンズを使用して、各ウェルの特定の蛍光チャンネルの画像を5枚撮影します(1枚の画像にスケールバーがあることを確認してください)。注:DAPIの励起/発光は358 nm/461 nmです。DAPIと二次抗体蛍光色素の両方に適切な検出フィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。 8. ImageJ解析(図2) 注: ImageJ バージョン 1.52a 以降を使用することをお勧めします。 縮尺記号を含む画像を ImageJ で開きます。[ 直線 ] アイコンをクリックし、縮尺記号の正確な長さに線を引きます [図 2 (1)]注意: 必要に応じて、 拡大鏡 アイコンをクリックしてズームインまたはズームアウトします。 [ 分析 ] タブをクリックします。[ スケールの設定]をハイライト表示してクリックします。 [既知の距離] を縮尺記号の距離に変更します。[長さの単位] を縮尺記号の単位に変更します。[グローバル] をオンにして、設定をグローバルに適用します。[OK] をクリックして縮尺を設定します。注:この設定を適用すると、開いたすべての画像に、ユーザーが入力した単位で計算された視野の領域が表示されます。 ImageJ で DAPI のみのイメージを開きます。[ プロセス ]タブをクリックし、[ 背景の減算]を強調表示します。染色されていない領域が黒くなるまで、一度に 50 ピクセルずつ背景を削除します。注: 画像に背景が含まれていない場合、この手順は必要ありません。 [イメージ] タブをクリックし、[タイプ] をハイライト表示します。8ビットをクリックすると、画像がグレースケールになります[図2(2)]。 手動または自動で画像を閾値設定して、すべてのDAPI粒子を含めます(手動で閾値を超えないように注意してください)[図2 (3)]。[ 画像 ] タブをクリックし、[ 調整] をハイライト表示します。 「しきい値」をクリックします。完了したら [ 適用 ] をクリックします。 [ プロセス ] タブをクリックし、[ バイナリ] を強調表示します。[ 集水域ラスターの作成 (Watershed)] をクリックします。 Analyzeタブをクリックし、Analyze Particlesをハイライト/クリックします[図2(4)]。Sizeを5-Infinityに、Circularityを0.00-1.00に設定します。[表示] ドロップダウン タブで、[アウトライン] を選択します。Display Results、Summarize、Include Holesがチェックされていることを確認します。[OK] をクリックします。注:しきい値によって背景ピクセルが生成される場合は、目的の粒子範囲を調整できます。 集計結果を TOTAL DAPIとして記録します。 マージされたサイトケラチン 18/DAPI イメージを ImageJ で開きます。 マルチポイント[図2(5)]アイコンを使用して、サイトケラチン18について染色されていないすべてのDAPI粒子を手動でカウントします。 結果を FEEDER CELLSとして記録します。以下の式を使用して、肝細胞DAPIを決定します。肝細胞 DAPI = 総 DAPI – フィーダー細胞 DAPI 9. 肝細胞の総接着量と接着率の定量(プレーティング性) 以下の式を使用して、24ウェル培養エリアのスケールファクターを作成します。視野の測定値は、開いた各画像の上部にあります[図2 (2)、緑色のボックス]。 以下の式を使用して、付着した肝細胞の総数を計算します。結合肝細胞 = 肝細胞DAPI×スケールファクター 以下の式を使用して、肝細胞の接着率を計算します。 10. アルブミンアッセイ 1:200に希釈したサンプルで、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)( 材料表を参照)を使用してアルブミン産生を測定します。注:正確を期すために、ユーザーはサンプルが標準曲線の線形範囲内にあることを確認します。指定されたキットには、アッセイを実行するためのすべての材料と説明書が含まれています。 以下の式を使用して、付着した肝細胞に対するサンプル濃度を正規化します。 11. 尿素アッセイ 注意:血中尿素窒素(BUN)酸試薬には硫酸が含まれています。BUN酸試薬中の硫酸濃度は腐食性であると考えられています。摂取しないでください。換気の良い場所で作業し、適切なPPEを着用してください。 尿素合成は、修飾ジアセチルモノキシム法を用いて測定されます( 材料表を参照)。 尿素 53.3 μL の 75 mg/dL を 346.7 μL の完全培地に希釈して、スタンダード #1(100 μg/mL)を調製します。 チューブ 2-8 に標識し、1:2 の段階希釈液を使用して尿素アッセイ標準試料を作製します(表 1)。 10 μLのサンプルまたは標準試料を、黒壁の透明底の96ウェルプレートのウェルに加えます( 材料表を参照)。 150 μLのBUN試薬をサンプルを含む各ウェルに添加します。1/3のBUNカラー試薬と2/3のBUN酸試薬を混合して、BUN試薬を調製します。以下の式を使用して計算に役立ててください。BUN カラー試薬 (mL) = 必要な BUN 試薬総量 × 0.333BUN 酸試薬 (mL) = 必要な BUN 試薬の総量 × 0.667 プレートを60°Cのオーブンまたはインキュベーターで90分間インキュベートします。 540 nm と 650 nm のプレート吸光度をすぐに読み取ります。 すべてのサンプルと標準試料からブランク吸光度とバックグラウンド吸光度(650 nm)を差し引いて、検量線を作成します。線形回帰分析によって最適な線を生成します。 検量線から未知のサンプル濃度を決定します。 以下の式を使用して、付着した肝細胞に対するサンプル濃度を正規化します。