Los avances técnicos recientes permitieron la producción a escala de una plataforma in vitro para aplicaciones de metabolismo y toxicidad de fármacos. Un sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) proporciona resultados fisiológicamente relevantes utilizando métodos tradicionales de cultivo bidimensional. Este protocolo apoyará a los usuarios finales en la configuración, el mantenimiento y la aplicación del sistema.
Encontrar un modelo de cultivo a largo plazo y relevante para el ser humano para los hepatocitos humanos primarios (PHH) para estudios farmacológicos y toxicológicos sigue siendo un desafío. Las plataformas de modelos in vitro actuales suelen ser incómodas y complejas, carecen de estabilidad fenotípica a lo largo del tiempo y no admiten múltiples lotes de PHH, careciendo de reproducibilidad experimental y flexibilidad. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la descongelación, el recubrimiento y el mantenimiento de un sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+), que aprovecha las técnicas y equipos de cultivo bidimensionales (2D) estándar al tiempo que mantiene la longevidad y la estabilidad fenotípica a lo largo del tiempo que suelen acompañar a los sistemas tridimensionales (3D) más complejos. Los resultados muestran la adhesión y el porcentaje de plateabilidad en TV2D+ en función de la densidad de siembra de PHH, así como una funcionalidad estable durante al menos 2 semanas en cultivo. Se evalúa un rango de densidades de siembra de PHH para lograr un cultivo exitoso a largo plazo. Cuando se establecen correctamente, las PHH en TV2D+ se organizan en colonias de hepatocitos, expresan un marcador hepático específico y mantienen la viabilidad, la integridad arquitectónica y los niveles fisiológicamente relevantes de albúmina y urea. Esta combinación única de atributos hace que el sistema TV2D+ sea un modelo hepático adecuado para una variedad de aplicaciones farmacológicas y toxicológicas.
La predicción de la seguridad y eficacia terapéutica es una parte importante del desarrollo preclínico de fármacos. Sin embargo, los modelos hepáticos preclínicos in vitro convencionales tienen una capacidad limitada para imitar con precisión el microambiente celular hepático in vivo y mantener la funcionalidad y morfología de los hepatocitos a lo largo del tiempo. Se necesitan modelos que proporcionen una competencia metabólica estable durante más de 1 semana para evaluar los compuestos de recambio lento o investigar los resultados asociados con la exposición subaguda o crónica. Las pruebas in vivo en animales a menudo no logran predecir la eficacia y el riesgo del fármaco debido a las diferencias de especies traslacionales en los mecanismos de depuración hepática humana1. Los modelos hepáticos actuales in vitro bidimensionales (2D), como el monocultivo tradicional de hepatocitos humanos primarios (PHH) o los cultivos sándwich, carecen de estabilidad fenotípica y longevidad en el cultivo, lo que lleva a la pérdida de la función hepatocelular clave y la integridad arquitectónica a lo largo del tiempo2. Un método alternativo consiste en la formación de esferoides de hepatocitos tridimensionales (3D), lo que ofrece un microambiente más relevante que el cultivo 2D. Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de materias primas, la selección del lote donante de PHH, la reproducibilidad y la pérdida de viabilidad con el aumento del tamaño de los esferoides 3,4,5,6. Se han introducido plataformas multicelulares mediante las cuales las PHH se siembran con células alimentadoras en placas de tamaño fijo y micropatrón. Aunque estos modelos pueden permitir tiempos de cultivo más largos, las células alimentadoras no humanas utilizadas en estas plataformas pueden alterar los resultados experimentales y limitar su aplicación debido a la contribución innata de fondo al aclaramiento del fármaco y a los perfiles metabólicos 1,7. El sistema hepático 2D+ totalmente humano TruVivo (TV2D+) descrito recientemente en Weaver, et al8, se desarrolló para abordar algunas de las limitaciones de los métodos tradicionales, de cocultivo y de cultivo 3D de PHH. Las células no hepáticas reducen las diferencias entre especies en el metabolismo y la producción paracrina y proporcionan el apoyo necesario para los hepatocitos primarios de una manera reproducible y robusta que no puede ser proporcionada por las células hepáticas no parenquimatosas correspondientes de un solo lote donante debido a limitaciones en la expansión, el fenotipo y el rendimiento. Las células alimentadoras elegidas pudieron expandirse de manera consistente antes de su uso y carecían de la necesidad de transformación o diferenciación. Como se describe en Glicklis et al.4 y Khetani et al.5, los modelos de cultivo 3D como los esferoides de hepatocitos tienen dificultades de reproducibilidad debido a la variabilidad del donante y al mantenimiento de la consistencia en el tamaño de los esferoides, lo que afecta a la difusión de nutrientes en esferoides de más de 200 μm, lo que conduce a una disminución de la viabilidad y la funcionalidad. Al igual que la formación de esferoides 3D, el sistema TV2D+ se basa en el autoensamblaje de PHH; sin embargo, las colonias de PHH formadas se dispersan sobre el área de la superficie del pozo a una profundidad de una sola celda en lugar de compactarse en un solo agregado. Este método de cultivo puede ser útil para abordar la variabilidad de los donantes, lo que permite que los PHH se siembren, se cultiven y mantengan la funcionalidad básica a varias densidades de siembra. El sistema TV2D+ también puede aumentar la robustez del manejo del usuario debido a la pérdida durante la manipulación o al equipo especializado necesario para realizar el cultivo extendido en esferoides 3D.
El sistema TV2D+ combina el cultivo 2D estándar con la longevidad y la estabilidad fenotípica que suelen acompañar a los sistemas 3D. El protocolo descrito en este documento proporciona instrucciones paso a paso para los usuarios con conocimientos básicos de cultivo de tejidos en laboratorios equipados con equipos estándar, como cabinas de bioseguridad, centrífugas e incubadoras de CO2 . Cada paso del proceso se describe en detalle, incluida la preparación de los medios, la descongelación, el enchapado y el mantenimiento del sistema de cultivo resultante. El protocolo también contiene un método para determinar la funcionalidad básica de los hepatocitos, la albúmina y la urea, así como el análisis de imágenes inmunofluorescentes para determinar la unión de la PHH para la normalización. Cuando se establecen correctamente, las PHH en TV2D+ se organizan en colonias de hepatocitos, imitando la morfología hepática nativa, y mantienen una viabilidad prolongada, integridad arquitectónica y niveles fisiológicamente relevantes de albúmina y urea durante al menos 2 semanas8. Debido a que el sistema puede permitir un rango de densidades de siembra de PHH, puede ser útil para aumentar la disponibilidad de lotes de PHH menos placables que tengan características donantes deseables. Esta combinación de accesibilidad y funcionalidad hace que TV2D+ sea un modelo hepático adecuado para una variedad de aplicaciones farmacológicas y toxicológicas.
El sistema de cultivo hepático descrito puede establecerse en laboratorios que están equipados con instrumentación estándar de cultivo de tejidos. Compuesto por PHH cultivadas con células alimentadoras, el sistema permite al usuario cultivar PHH durante al menos dos semanas con producción estable de albúmina y síntesis de urea. Debido a la variabilidad de los lotes de donantes de PHH, solo se recomienda su uso en el sistema de PHH preseleccionados y calificados. Aunque el número de PHH adheridas varía según el lote donante y la densidad de siembra, la plastibilidad relativa sigue siendo similar dentro de cada lote donante. Si bien se recomiendan las densidades de siembra recomendadas, los datos anteriores sugieren que la densidad de siembra de hepatocitos se puede ajustar para diferentes necesidades experimentales; sin embargo, debe tenerse en cuenta que la siembra de un mayor número de PHH puede no proporcionar resultados funcionales más altos o más consistentes. El análisis de los lotes de PHH evaluados mostró el CV más bajo para la producción de albúmina y la síntesis de urea utilizando densidades de siembra más bajas de 150.000 PHHs/pocillo y 200.000 PHHs/pocillo; sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre la albúmina y la urea en ninguna densidad de siembra. Las densidades de siembra más altas de 250,000 PHHs/pocillo y 300,000 PHHs/pocillo muestran una mayor disminución de albúmina y urea durante el período de cultivo de 14 días. La variabilidad inherente del donante en la plaquetabilidad puede afectar la consistencia de la producción de albúmina y la síntesis de urea a 250.000 PHH/pocillo y 300.000 PHH/pocillo para los lotes de donantes analizados. Al igual que los esferoides de hepatocitos grandes, la resiembra de PHH en el sistema TV2D+ puede tener efectos negativos en el cultivo y la funcionalidad a largo plazo de los PHH.
Todos los pasos de descongelación, enchapado y mantenimiento son fundamentales para el éxito de la cultura y la generación de datos; Sin embargo, hay varios errores comunes que los usuarios inexpertos pueden evitar. Los PHH son altamente susceptibles a daños secundarios a la fluctuación de temperatura, el esfuerzo cortante y la exposición al aire 9,10. Se deben tomar precauciones al descongelar los PHH para evitar períodos de descongelación prolongados y un pipeteo excesivo. El uso de un método de vertido manual, un temporizador y la transferencia inmediata del baño de agua al hielo reducirá estos errores comunes que pueden afectar la viabilidad y la capacidad de los PHH. Además, con los problemas de la cadena de suministro cada vez más comunes, puede ser difícil obtener placas recubiertas de colágeno. Para superar este problema se puede utilizar el recubrimiento manual de placas tratadas con cultivo de tejidos utilizando soluciones comerciales de colágeno tipo I (5-10 μg/cm2); Sin embargo, para un rendimiento y consistencia óptimos, se recomienda utilizar placas de colágeno prerrecubiertas. En el proceso de transición del cultivo solo de células alimentadoras a la introducción de PHH, es fundamental evitar que la capa de células alimentadoras se seque. Nunca permita que el aire se exponga a las celdas de alimentación. Cualquier tiempo de exposición al aire puede conducir a una mala calidad de la capa de células alimentadoras, lo que tendrá un impacto negativo en el cultivo a largo plazo de PHH. Es una buena práctica permitir que quede una pequeña cantidad de medio residual entre los cambios de medio. En ocasiones, los PHH pueden contener un exceso de residuos procedentes del aislamiento, lo que puede dificultar la visualización de la morfología. Para ayudar con este problema, agite la placa antes de un cambio medio y use la aspiración endouterina. Finalmente, al realizar un cambio de medio, aspire con cuidado el medio gastado, teniendo cuidado de no perturbar las células cultivadas. Pipetee un volumen medio fresco por el costado del pocillo para evitar pipetear directamente sobre la capa celular. El usuario también debe evitar la exposición al aire en cada cambio de medio, utilizando el cambio recomendado de 3 pocillos (Secciones 3 y 4). También hay que tener en cuenta que un cambio diario de medio es ideal pero no obligatorio.
Aunque los microscopios fluorescentes se han vuelto comunes en la mayoría de los laboratorios, el software necesario para realizar análisis de imágenes específicas puede incurrir en gastos adicionales. ImageJ se puede descargar de forma gratuita, lo que la convierte en una herramienta de análisis de imágenes de fácil acceso. Los pasos del protocolo proporcionan una base para la que el usuario puede necesitar optimizar, específicamente el análisis de partículas de la tinción DAPI; sin embargo, en ausencia de capacidad de obtención de imágenes fluorescentes, los valores de fijación de PHH en el día 14 se proporcionan en certificados de análisis específicos del lote. Un umbral deficiente dará lugar a un recuento inexacto de las partículas DAPI. También se recomienda verificar el área de superficie de las partículas DAPI individuales antes de establecer una exclusión de tamaño. Esto se puede lograr utilizando el icono ovalado [Figura 2 (1), icono circular debajo de la pestaña Editar ] y dibujando un círculo que abarque la partícula DAPI. La pestaña Analizar se puede utilizar para medir el área de la partícula DAPI seleccionada. Las mediciones específicas se pueden seleccionar utilizando el Conjunto de medidas en la pestaña Analizar [paso 8.9 y Figura 2 (4)].
Los métodos actuales para el cultivo de PHH implican el uso de recubrimientos como el colágeno-I para aumentar la adhesión celular en monocultivos bidimensionales tradicionales11 o la superposición con una matriz extracelular, como el Matrigel de base murina, una técnica comúnmente conocida como “cultivo sándwich”12,13,14,15 . Si bien la técnica de cultivo en sándwich mejora la morfología y la polaridad de la PHH a lo largo del tiempo en comparación con el monocultivo tradicional, ambos enfoques aún carecen de estabilidad fenotípica a largo plazo en el cultivo para la mayoría de los lotes placables de PHH. Otro método utilizado para cultivar PHH es la fabricación de esferoides 3D; sin embargo, como ya han señalado Glicklis et al.4, puede haber desafíos técnicos con la reproducibilidad del tamaño del esferoide debido a la variabilidad del donante. En un esfuerzo por hacer un modelo hepático fisiológicamente más relevante, se han desarrollado modelos multicelulares. Como describen Ware et al.7, mediante el uso de micropatrones, los fibroblastos murinos y las células endoteliales sinusoides hepáticas primarias humanas rodeadas de PHH permitieron tiempos de cultivo in vitro más prolongados. Sin embargo, la creación de micropatrones puede ser un proceso complejo y que requiere mucho tiempo, y las células alimentadoras no humanas pueden contribuir al fondo de las señales metabólicas, lo que limita la utilidad de esta plataforma en ciertas aplicaciones. El uso de varias células no hepáticas, incluidos los fibroblastos dérmicos humanos y de rata y las células endoteliales de la aorta bovina como células alimentadoras para el cocultivo de hepatocitos, ha demostrado una secreción de albúmina y una formación de uniones estrechas similares a los cocultivos de células alimentadoras de origen hepático16. Sin embargo, el mecanismo de interacciones entre las células alimentadoras no hepáticas TV2D+ y las PHH en cultivo debe investigarse más a fondo para comprender mejor la influencia en la estabilidad y funcionalidad de las PHH en este sistema. El sistema de cultivo descrito previamente por Weaver et al.8 puede cultivar con éxito PHHs en colonias hepáticas hasta por 42 días, formando extensas redes canaliculares biliares. Las PHH cultivadas en este sistema mantuvieron una funcionalidad hepática clave, incluida la actividad del citocromo 1A2, 2B6 y 3A4 y la actividad enzimática basada en la uridina 5′-difosfo-glucuronosiltransferasa (UGT), la formación de metabolitos de fase I y II, la producción de albúmina y la síntesis de urea durante al menos 22 días in vitro sin Matrigel. Este sistema de cultivo produce resultados estables y fisiológicamente relevantes que se adaptan fácilmente a cualquier laboratorio para aplicaciones farmacológicas y toxicológicas. Aunque las funciones clave de PHH se mantienen en el sistema TV2D+, no se han realizado comparaciones directas con el modelo de esferoide 3D; sin embargo, los trabajos futuros que comparen los mismos donantes de PHH entre los sistemas de cultivo resultarán valiosos para determinar los límites y ventajas de ambos métodos.
Las aplicaciones potenciales de TV2D+ incluyen la evaluación del aclaramiento metabólico y las interacciones farmacológicas de compuestos de baja rotación, la lesión hepática inducida por fármacos y la evaluación del riesgo de agroquímicos. La predicción precisa del aclaramiento hepático de fármacos nuevos y emergentes se basa en un cultivo estable y prolongado de PHH con retención de la funcionalidad hepatocelular clave, lo que es particularmente difícil cuando se evalúan compuestos de baja rotación. Además, la evaluación del riesgo y la toxicidad hepática inducida por sustancias químicas son problemas de salud importantes, y los modelos actuales no proporcionan la estabilidad y la funcionalidad a largo plazo en el cultivo para evaluar con precisión la posible toxicidad química crónica que puede ser secundaria a la exposición aguda. Los PHH sanos y enfermos cultivados en TV2D+ mostraron diferencias características en la función y la disposición lipídica que se mantuvieron a lo largo del tiempo17. Estos estudios respaldan a TV2D+ como una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones farmacológicas y toxicológicas.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Mellissa Keller y Wendy Hetman por su ayuda con la revisión de manuscritos y figuras.
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |