Aktif Yerden Kaçınma (APA) testi, fareler için etkili, çok yönlü ve tekrarlanabilir bir uzamsal öğrenme görevi
Summary
Burada, kemirgenler için tasarlanmış hipokampusa bağlı bir mekansal öğrenme paradigması olan aktif yerden kaçınma testi için bir protokol sunuyoruz. Anahtar parametrelerin değiştirilmesi, hayvanların tedavilerden önce ve sonra veya zaman içinde yeniden test edilmesine olanak tanır.
Abstract
Kemirgenlerde hipokampusa bağlı uzamsal öğrenme, çeşitli yöntemler kullanılarak test edilmiştir. Bunlar arasında Morris su labirenti (MWM), Y-labirenti ve yeni nesne konumu (NOL) görevleri bulunur. Daha yakın zamanlarda, aktif yerden kaçınma (APA) görevi, bu daha geleneksel yaklaşımlara bir alternatif olarak geliştirilmiştir. APA görevinde, fareler, sabit bir şok bölgesinden kaçınmak için dönen bir arenanın etrafına yerleştirilmiş uzamsal ipuçlarını kullanmalıdır. Ayarlanabilen çoklu parametreler nedeniyle, APA görevinin çok yönlü bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir. Aynı fare kohortu için uzunlamasına ve tekrar tekrar kullanılmaya elverişlidir. Burada, APA görevini başarılı bir şekilde yürütmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, uzamsal öğrenmenin farklı bileşenlerini incelemek için kullanılabilecek alternatif APA yaklaşımlarını da vurguluyoruz. Veri toplama ve analiz süreçlerini anlatıyoruz. Testin başarılı bir şekilde yürütülmesi olasılığını artırmak için APA görevi sırasındaki kritik adımlar tartışılmaktadır. APA görevi, daha geleneksel uzamsal navigasyon testlerine göre çeşitli avantajlara sahiptir. Yaşlı farelerde veya Alzheimer hastalığı gibi hastalık fenotiplerine sahip farelerde kullanılması uygundur. Görevin karmaşıklığı kolayca değiştirilebilir ve çok çeşitli fare türlerinin test edilmesine olanak tanır. Ayrıca, APA görevi, felç veya travmatik beyin hasarı gibi motor veya nöral işlevi etkilemiş olabilecek ameliyat veya deneysel müdahaleler geçirmiş hayvanları test etmek için uygundur.
Introduction
Aktif yerden kaçınma (APA), kemirgenlerde hipokampusa bağlı uzamsal öğrenmeyi test etmek için etkili bir araçtır 1,2,3,4. APA görevi sırasında, hayvan dönen bir arenaya yerleştirilir ve kendilerini yönlendirmek ve caydırıcı bir şok bölgesinden kaçınmak için görsel ipuçlarını kullanması gerekir5. Arenanın dönüşü, farenin navigasyon için aptalca bir yaklaşım kullanamamasını ve koku işaretlerinin kullanılamamasını sağlar, çünkü bu ipuçları şok bölgesi sabit kalırken platform üzerinde döner5. Arenanın hızını ve yönünü, ayrıca şok bölgesinin konumunu ve görsel ipuçlarını değiştirmek, farelerin birden çok kez yeniden test edilmesine olanak tanır 6,7,8. APA, en yaygın kullanılan uzamsal öğrenme testlerinden biri olan Morris su labirentine (MWM) kıyasla birkaç farklı avantaj sunar. Daha da önemlisi, fareler yüzmeye karşı bir isteksizliğe sahiptir ve MWM görevini son derece stresli bulurlar9. Ayrıca, yaşlı farelerin MWM görevi10 sırasında yüzdüğü bildirilmiştir, bu da onu birçok durumda uzamsal bir öğrenme görevi olarak uygun hale getirmez. Ayrıca, MWM görevi, farelerin test sırasında bulunması için gizli, batık bir platform gerektirdiğinden. Bu, suyun opak olmasını gerektirir ve bu da tipik olarak beyaz boya ilavesiyle elde edilir. Davranışsal görevler sırasında hayvanların izlenmesi ve analizi, İsviçre veya BALB/c gibi belirli fare suşlarının MWM’de test edilmesini hariç tutarak, denek ve çevresi arasında yeterli kontrast gerektirir. APA görevinde, ızgaranın altına siyah plastik eklenerek bu sorun aşılır.
Uzamsal öğrenmeyi test etmek için birden fazla APA paradigması tasarlanmıştır ve etkili bir davranışsal araç olarak faydasını göstermiştir. Örneğin, uzamsal öğrenmenin edinimi, tutulması ve pekiştirilmesi tipik olarak 3-5 gün arasında değişebilen hayvanların günlük testleriyle gerçekleştirilir 6,7,11,12. Hafıza ve öğrenme, her edinim gününde alınan şok sayısı karşılaştırılarak ölçülür. İlk girişe kadar geçen süre ve şok bölgesinden kaçınma süresi de görev sırasında öğrenme yeteneğindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılabilecek önemli parametrelerdir. Alternatif olarak, uzamsal çalışma belleği, 30 dakikalık tek bir APA oturumu 2,13 gerçekleştirilerek test edilebilir, burada uzamsal öğrenme, 5 dakikalık bölmelerde şok sayısı gibi performansı karşılaştırarak oturum içi değişiklikler olarak ölçülür.
Bu makalede, APA görevini açıklıyoruz ve bu uzamsal öğrenme testini yürütürken dikkate alınması gereken temel özellikleri vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuç olarak, aktif yerden kaçınma testi, çeşitli fare türlerinde ve deneysel koşullarda kullanılabilen etkili bir uzamsal öğrenme görevidir. APA görevi, kortizol seviyeleri14 ile ölçüldüğü gibi fareler için stresli olan MWM gibi diğer uzamsal öğrenme paradigmaları9 ile ilişkili sınırlamaların üstesinden gelir. MWM, görev10 sırasında yüzdükleri bildirilen yaşlı fareler için de uygun değildir. Barnes labirenti ve yeni nesne konum testi gibi diğer uzamsal öğrenme testleri daha az stresli olsa da, aynı fare kohortunda tekrar testinin ne sıklıkta yapılabileceği ile sınırlıdır. Bu nedenle, APA görevinin ana avantajı, yeniliği korumak için çeşitli parametreler ayarlanabildiğinden, birden çok kez kullanılabilmesidir. Gerçekten de, hipokampal ablasyonun etkisini ve egzersiz8’in müteakip etkisini incelemek için aynı fare kohortunda APA görevini 5 defaya kadar kullandık. Her durumda, arena dönüşü, şok bölgesi ve uzamsal ipuçları dahil olmak üzere parametreler testler arasında değiştirildi. Bu, farelerin, kontrol hayvanları tarafından kanıtlandığı gibi, görevi yeniden öğrenmek için uzamsal navigasyon ipuçlarını kullanmalarını sağlamada etkili oldu, yüksek sayıda şokla başladı ve daha sonra her test periyodu için sonraki test günlerinde azaldı8. Tipik olarak, 5 günlük bir test paradigmasının sonunda, son gün 10’dan fazla şok alan veya maksimum kaçınma süresi 60 saniyeden az olan herhangi bir hayvanın paradigmayı öğrenmediğini düşünüyoruz.
APA görevi, birden fazla uzamsal test turuna izin vermek için ayarları kolayca değiştirme yeteneğinin ötesinde, farelerin şok bölgesinden etkili bir şekilde kaçınmak için uzamsal navigasyonu kullanmasını sağlar. Örneğin, hayvanlar, sabit şok bölgesinden uzaklaşarak onu bulmak ve ona girmekten kaçınmak için dış ipuçlarını kullanmalıdır5. Arena dönerken, hayvanlar navigasyon için aptalca bir yaklaşım kullanamazlar ve koku gibi dışsal ipuçlarını kullanamazlar çünkü bu ipuçları arena ile birlikte dönerken şok bölgesi ve uzamsal ipuçları sabit kalır5.
Farelerin araştırmacı ve APA arenasına uygun şekilde alışmasını sağlamak da önemlidir. Ayak şokunun yoğunluğunun da optimize edilmesi gerekir, çünkü hem çok düşük hem de çok yüksek şok yoğunluğu farelerin görevi öğrenme ve gerçekleştirme yeteneğini tehlikeye atabilir5. Şok yoğunluğu tipik olarak 0,5 mA’ya ayarlanır ve 0,7 mA’yı geçmemelidir. Anksiyete benzeri davranışı artan hayvanlar için, hem ışık yoğunluğunu hem de ayak şoku yoğunluğunu azaltmayı düşünün. APA görevi sırasında artan kaygı, aşırı zıplama, arenada kontrolsüz koşma veya uzun süreli donma olarak ortaya çıkabilir. Burada tarif edilen protokol, daha önce BALB / c ile kullanılan ve daha yüksek kaygı benzeri davranışa sahip olduğu bilinen aynı yoğunluk olan 0.5 mA’lık bir şok yoğunluğu kullanmıştır15.
Burada, kullanılan aktif yerden kaçınma teçhizatını sağlayan şirket tarafından sağlanan hayvan izleme yazılımını açıklıyoruz. Alternatif video izleme yazılımı da davranışsal performansı analiz etmek için uygundur. Bu programlar ayrıca APA görevleri sırasında fare performansını doğru bir şekilde ölçebilir ve analiz edebilir. Bu programlar, davranışı değerlendirmek için APA arenası içinde çeşitli bölgelerin ve konumların oluşturulmasına izin verir. Bir APA için arena ayarı, giriş sayısının, ilk giriş süresinin ve şok bölgesinde geçirilen sürenin ölçüldüğü üçgen bir şok bölgesinden oluşur. Arena içinde ek bölgeler de eklenebilir. Örneğin, harcanan zamanı ölçmek için merkezi bir bölge veya şok bölgesinin karşısına bir bölge ekleyebilir ve bu bölgelerde caydırıcı bölgeden kaçınmak için bir hayvan stratejisi olarak kat edilen mesafeyi ekleyebiliriz. Bu programlar, fare kütle merkezini izler, bu daha sonra kaydedilir ve görsel inceleme için referans çerçevesinin üzerinde görüntülenir (Şekil 6A,B). Son olarak, bireysel ve grup performansı için bir yoğunluk ısı haritası oluşturmak da mümkündür (Şekil 6C).
APA görevini yürütürken, ele alınması gereken potansiyel sorunlar vardır. Bazen, şok bölgesine yanıt vermeme nedeniyle farelerin analizden çıkarılması gerekecektir. Her zaman olduğu gibi, dışlama yalnızca önceden tanımlanmış aykırı değer koşullarını karşıladıklarında, örneğin ortalamadan 2 standart sapmanın dışında kaldıklarında dikkate alınmalıdır. APA gibi karmaşık davranışsal görevler tipik olarak hayvanların yüksek N değerlerini gerektirir. APA’yı gerçekleştirmeden önce uygun örneklem boyutunu hesaplamak için bir güç analizi yapmanızı öneririz. Bu, kullanılan suşa ve tedavi gruplarına bağlı olacaktır. Deneyimlerimizden, APA deneyleri yaparken her grup için 10 veya daha fazla n değerinin yeterli güç sağladığını bulduk. Bu görevle ilgili temel sorun, görev sırasında farenin yüksek kalitede izlenmesini sağlamaktır. Görevin alışma aşaması, bunun gerçekleştiğini doğrulamak için kullanılmalıdır. Bir şoka tepki vermeyen fareler genellikle ızgara çubukları arasındaki scat’ten kaynaklanır. Bu nedenle, her hayvandan sonra teçhizatı temizlemek ve herhangi bir dışkı veya idrarı çıkarmak çok önemlidir. Bu aynı zamanda takip eden hayvanlar için stresi de azaltacaktır. APA görevi tipik olarak 5 günlük bir paradigmayı içerir ve bu, 5 günden daha az etkili müdahaleleri içeren çalışmalar için bazı sınırlamalar sunabilir; Bununla birlikte, kısa süreli hafıza veya uzamsal öğrenme edinimi, 30 dakikalık, tek oturumluk yaklaşım kullanılarak bu tür çalışmalar için hala değerlendirilebilir.
Özetle, bu makale, farelerin uzamsal öğrenmesini test etmek için aktif yerden kaçınma paradigmasının nasıl kurulacağı ve kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar. Farklı renkteki birden fazla fare türünün test edilebilmesi için koşulları değiştirme yeteneği, MWM gibi diğer, daha geleneksel uzamsal testlere göre belirgin bir avantajdır. Ayrıca, çoklu parametrelerin modifikasyonu, mekansal öğrenmedeki değişikliklerin çeşitli deneysel paradigmalar sırasında veya fizyolojik yaşlanma sırasında doğru bir şekilde karşılaştırılabilmesi için tekrar teste izin verir. Kısa bir süre içinde, APA testinin hipokampusa bağlı uzamsal öğrenme için doğru ve etkili bir alternatif olduğu gösterilmiştir. Gelecekte, APA görevi, hem vahşi tip hem de transgenik farelerde bilişsel ve mekansal davranış üzerindeki terapötik veya egzersiz müdahalelerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem olarak kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queensland Beyin Enstitüsü (QBI) Hayvan Davranışı Tesisi’ne bu yazıda açıklanan cihazın geliştirilmesi ve bakımı için teşekkür ederiz.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O’Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
