Тест на активное избегание места (APA) — эффективная, универсальная и воспроизводимая задача пространственного обучения для мышей
Summary
Здесь мы представляем протокол теста на избегание активного места, парадигмы пространственного обучения, зависящей от гиппокампа, разработанной для грызунов. Изменение ключевых параметров позволяет повторно тестировать животных до и после лечения или с течением времени.
Abstract
Гиппокамп-зависимое пространственное обучение у грызунов было проверено с использованием различных методов. К ним относятся водный лабиринт Морриса (MWM), Y-лабиринт и задачи по определению местоположения нового объекта (NOL). В последнее время в качестве альтернативы этим более традиционным подходам была разработана задача активного избегания места (APA). В задаче APA мыши должны использовать пространственные подсказки, размещенные вокруг вращающейся арены, чтобы избежать неподвижной зоны удара. Благодаря множеству параметров, которые можно регулировать, задача APA показала себя очень универсальным подходом. Его можно использовать в продольном и многократном режиме для одной и той же когорты мышей. Здесь мы предоставляем подробный протокол для успешного выполнения задачи APA. Мы также выделяем альтернативные подходы APA, которые можно использовать для изучения различных компонентов пространственного обучения. Описываются процессы сбора и анализа данных. Обсуждаются критические шаги во время задания APA, чтобы повысить вероятность успешного проведения теста. Задание APA имеет несколько преимуществ по сравнению с более традиционными тестами на пространственную навигацию. Его целесообразно использовать с пожилыми мышами или мышами с фенотипами заболеваний, такими как болезнь Альцгеймера. Сложность задачи можно легко изменить, что позволяет протестировать широкий спектр штаммов мышей. Кроме того, задание APA подходит для тестирования животных, перенесших операцию или экспериментальные вмешательства, которые могли повлиять на двигательную или нервную функцию, такие как инсульт или черепно-мозговая травма.
Introduction
Активное избегание места (APA) является эффективным инструментом для проверки пространственного обучения в зависимости от гиппокампа у грызунов 1,2,3,4. Во время задания APA животное помещается на вращающуюся арену и должно использовать визуальные подсказки, чтобы сориентироваться и избежать аверсивной зоны шока5. Вращение арены гарантирует, что мышь не сможет использовать идиотский подход для навигации, а также не может использовать запаховые метки, поскольку эти подсказки вращаются на платформе, в то время как зона удара остается неподвижной5. Изменение скорости и направления арены, а также расположения зоны удара и визуальных подсказок позволяет повторно тестировать мышей несколько раз 6,7,8. APA предлагает несколько явных преимуществ по сравнению с водным лабиринтом Морриса (MWM), одним из наиболее широко используемых тестов пространственного обучения. Важно отметить, что мыши испытывают отвращение к плаванию и считают задачу MWM чрезвычайно стрессовой9. Кроме того, сообщалось, что старые мыши плавали во время задачи10 MWM, что во многих случаях делало ее непригодной в качестве задачи пространственного обучения. Кроме того, поскольку задача MWM требует скрытой, погруженной платформы, которую мыши могут найти во время тестирования. Это требует, чтобы вода была непрозрачной, что обычно достигается добавлением белой краски. Отслеживание и анализ животных во время поведенческих задач требует достаточного контраста между объектом и окружением, исключая определенные линии мышей, такие как Swiss или BALB/c, из тестирования в MWM. В задаче APA эта проблема обходится за счет добавления черного пластика под сетку.
Несколько парадигм APA были разработаны для проверки пространственного обучения, демонстрируя его полезность в качестве эффективного поведенческого инструмента. Например, приобретение, удержание и закрепление пространственного обучения обычно достигается путем ежедневного тестирования животных, которое может варьироваться от 3 до 5 дней 6,7,11,12. Память и обучение количественно оцениваются путем сравнения количества шоков, полученных каждый день приобретения. Время до первого входа и максимальное время избегания зоны шока также являются важными параметрами, которые могут быть использованы для определения изменений в способности к обучению во время выполнения задания. В качестве альтернативы пространственную рабочую память можно проверить, проведя одну 30-минутную сессию APA 2,13, где пространственное обучение измеряется как изменения в течение сеанса путем сравнения производительности, такой как шоковое число, в 5-минутных интервалах.
В этой статье мы опишем задание APA и выделим ключевые особенности, которые необходимо учитывать при проведении этого теста на пространственное обучение.
Protocol
Representative Results
Discussion
В заключение, тест на избегание активного места является эффективной задачей пространственного обучения, которую можно использовать на различных линиях мышей и экспериментальных условиях. Задача APA преодолевает ограничения, связанные с другими парадигмами пространственного обучения14, такими как MWM, которая является стрессовой для мышей, измеряемой уровнем кортизола9. MWM также не подходит для старых мышей, которые, как сообщается, плавают во время выполнения задачи10. Хотя другие тесты на пространственное обучение, такие как лабиринт Барнса и тест на определение местоположения нового объекта, менее стрессовые, они ограничены тем, как часто можно проводить повторное тестирование на одной и той же когорте мышей. Таким образом, основное преимущество задачи APA заключается в том, что ее можно использовать несколько раз, так как несколько параметров можно настроить для поддержания новизны. Действительно, мы использовали задачу APA до 5 раз на одной и той же когорте мышей, чтобы изучить эффект абляции гиппокампа и последующий эффект упражнения8. В каждом случае параметры, включая вращение арены, зону удара и пространственные подсказки, были изменены между тестами. Это было эффективно для обеспечения того, чтобы мыши использовали пространственные навигационные подсказки для повторного обучения задаче, о чем свидетельствуют контрольные животные, начиная с большого количества ударов, а затем уменьшая их в течение последующих тестовых дней длякаждого периода тестирования. Как правило, в конце 5-дневного теста парадигмы мы считаем, что любое животное, которое получило более 10 ударов током в последний день или имеет максимальное избегание менее 60 с, не выучило парадигму.
Помимо возможности легко изменять настройки, чтобы разрешить несколько раундов пространственного тестирования, задача APA гарантирует, что мыши должны использовать пространственную навигацию, чтобы эффективно избегать зоны удара. Например, животные должны использовать внешние сигналы, чтобы найти и избежать входа в неподвижную зону удара, уйдя от нее5. Поскольку арена вращается, животные не могут использовать идиотический подход для навигации, а также не могут использовать экстероцептивные сигналы, такие как запах, потому что эти сигналы вращаются вместе с ареной, в то время как зона удара и пространственные сигналы остаются неподвижными.
Также важно убедиться, что мыши надлежащим образом приучены к исследователю и АПА. Интенсивность удара ногой также должна быть оптимизирована, так как как как слишком низкая, так и слишком высокая интенсивность удара может поставить под угрозу способность мышей обучаться и выполнять задачу5. Интенсивность ударной волны обычно устанавливается на 0,5 мА и не должна превышать 0,7 мА. Для животных с повышенным тревожным поведением рассмотрите возможность снижения интенсивности как света, так и интенсивности удара ногой. Повышенное беспокойство во время задания APA может проявляться либо в виде чрезмерных прыжков, неконтролируемого бега по арене, либо в виде длительного замерзания. В описанном здесь протоколе использовалась интенсивность удара 0,5 мА, та же интенсивность, которая ранее использовалась для BALB/c, который, как известно, имеет более высокое тревожноеповедение.
Здесь мы опишем программное обеспечение для отслеживания животных, поставляемое компанией, которая предоставила используемую установку для активного избегания места. Альтернативное программное обеспечение для отслеживания видео также подходит для анализа поведенческих показателей. Эти программы также могут точно измерять и анализировать производительность мыши во время задач APA. Эти программы позволяют создать несколько зон и локаций на арене АПА для оценки поведения. Арена для APA состоит из одной треугольной зоны удара, где измеряется количество входов, время первого входа и время, проведенное в зоне удара. Дополнительные зоны также могут быть добавлены внутри арены. Например, мы можем добавить центральную зону или зону, противоположную зоне удара, чтобы измерить затраченное время и расстояние, пройденное в этих зонах, в качестве стратегии животного, чтобы избежать зоны отвращения. Эти программы отслеживают центр масс мыши, который затем сохраняется и отображается над системой отсчета для визуального контроля (рис. 6A, B). Наконец, также можно создать тепловую карту плотности для индивидуальной и групповой производительности (рисунок 6C).
При выполнении задачи APA существуют потенциальные проблемы, которые необходимо решить. Иногда мышей нужно будет исключить из анализа из-за отсутствия реакции на зону удара. Как всегда, исключение следует рассматривать только в том случае, если они удовлетворяют заранее определенным условиям выбросов, например, выходят за пределы 2 стандартных отклонений от среднего значения. Сложные поведенческие задачи, такие как APA, обычно требуют высоких значений N у животных. Мы предлагаем провести анализ мощности, чтобы рассчитать подходящий размер выборки перед проведением APA. Это будет зависеть от используемого штамма и групп лечения. Из опыта мы обнаружили, что значение n 10 или более для каждой группы обеспечивает достаточную мощность при проведении экспериментов APA. Основная проблема с этой задачей — обеспечение качественного отслеживания мыши во время выполнения задачи. Стадия привыкания к заданию должна быть использована для подтверждения того, что это происходит. Мыши, не реагирующие на удар, часто возникают из-за того, что они застревают между стержнями сетки. Поэтому важно чистить установку после каждого животного и удалять любые экскременты или мочу. Это также снизит стресс для последующих животных. Задание АПА обычно включает в себя 5-дневную парадигму, которая может представлять некоторые ограничения для исследований, включающих вмешательства, эффективные менее 5 дней; Тем не менее, кратковременная память или пространственное обучение все еще могут быть оценены для таких исследований с использованием 30-минутного подхода с одним сеансом.
В целом, в этой статье представлено подробное описание того, как настроить и использовать парадигму активного избегания места для проверки пространственного обучения мышей. Возможность изменять условия таким образом, чтобы можно было протестировать несколько линий мышей разного цвета, является явным преимуществом по сравнению с другими, более традиционными пространственными тестами, такими как MWM. Кроме того, модификация нескольких параметров позволяет проводить повторное тестирование, чтобы можно было точно сравнить изменения в пространственном обучении во время различных экспериментальных парадигм или во время физиологического старения. За короткий период времени тест APA показал себя точной и эффективной альтернативой пространственному обучению, зависящему от гиппокампа. В будущем задача APA может быть использована в качестве надежного метода для оценки терапевтических или физических вмешательств на когнитивное и пространственное поведение как у мышей дикого типа, так и у трансгенных мышей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Центр поведения животных Квинслендского института мозга (QBI) за разработку и обслуживание аппарата, описанного в этой рукописи.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O’Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
