Il test Active Place Avoidance (APA), un compito di apprendimento spaziale efficace, versatile e ripetibile per i topi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per il test di evitamento del luogo attivo, un paradigma di apprendimento spaziale dipendente dall’ippocampo progettato per i roditori. La modifica dei parametri chiave consente di ripetere i test sugli animali prima e dopo i trattamenti o nel tempo.
Abstract
L’apprendimento spaziale dipendente dall’ippocampo nei roditori è stato testato utilizzando una varietà di metodi. Questi includono il labirinto d’acqua di Morris (MWM), il labirinto a Y e le attività di localizzazione di nuovi oggetti (NOL). Più recentemente, l’attività di evitamento attivo del luogo (APA) è stata sviluppata come alternativa a questi approcci più tradizionali. Nel compito APA, i topi devono utilizzare segnali spaziali posizionati attorno a un’arena rotante per evitare una zona d’urto stazionaria. A causa dei molteplici parametri che possono essere regolati, l’attività APA si è dimostrata un approccio molto versatile. Si presta ad essere utilizzato longitudinalmente e ripetutamente per la stessa coorte di topi. Qui forniamo un protocollo dettagliato per condurre con successo l’attività APA. Evidenziamo anche approcci APA alternativi che possono essere utilizzati per esaminare diverse componenti dell’apprendimento spaziale. Descriviamo i processi di raccolta e analisi dei dati. Vengono discussi i passaggi critici durante l’attività APA per aumentare la probabilità di condurre con successo il test. L’attività APA presenta diversi vantaggi rispetto ai test di navigazione spaziale più tradizionali. È appropriato da usare con topi anziani o con fenotipi di malattia come il morbo di Alzheimer. La complessità del compito può essere facilmente modificata, consentendo di testare un’ampia gamma di ceppi di topi. Inoltre, l’attività APA è adatta per testare animali che hanno subito interventi chirurgici o sperimentali che potrebbero aver influenzato la funzione motoria o neurale, come ictus o lesioni cerebrali traumatiche.
Introduction
L’evitamento attivo del luogo (APA) è uno strumento efficace per testare l’apprendimento spaziale dipendente dall’ippocampo nei roditori 1,2,3,4. Durante l’attività APA, l’animale viene posizionato su un’arena rotante e deve utilizzare segnali visivi per orientarsi ed evitare una zona di shock avversiva5. La rotazione dell’arena assicura che il mouse non sia in grado di utilizzare un approccio idiotetico per la navigazione, né possono essere utilizzati segni di odore, poiché questi segnali ruotano sulla piattaforma mentre la zona d’urto rimane ferma5. L’alterazione della velocità e della direzione dell’arena, nonché della posizione della zona d’urto e dei segnali visivi, consente di ritestare i topi più volte 6,7,8. L’APA offre diversi vantaggi distinti rispetto al labirinto d’acqua di Morris (MWM), uno dei test di apprendimento spaziale più utilizzati. È importante sottolineare che i topi hanno un’avversione per il nuoto e trovano il compito MWM estremamente stressante9. Inoltre, è stato segnalato che i topi anziani galleggiano durante il compitoMWM 10, rendendolo inadatto come compito di apprendimento spaziale in molti casi. Inoltre, poiché l’attività MWM richiede una piattaforma nascosta e sommersa che i topi possano localizzare durante i test. Ciò richiede che l’acqua sia opaca, che in genere si ottiene tramite l’aggiunta di vernice bianca. Il monitoraggio e l’analisi degli animali durante i compiti comportamentali richiedono un contrasto sufficiente tra il soggetto e l’ambiente circostante, escludendo alcuni ceppi di topi come Swiss o BALB/c dall’essere testati nel MWM. Nell’attività APA, questo problema viene aggirato attraverso l’aggiunta di plastica nera sotto la griglia.
Diversi paradigmi APA sono stati progettati per testare l’apprendimento spaziale, dimostrando la sua utilità come strumento comportamentale efficace. Ad esempio, l’acquisizione, la conservazione e il consolidamento dell’apprendimento spaziale sono in genere realizzati mediante test giornalieri sugli animali che possono variare da 3-5 giorni 6,7,11,12. La memoria e l’apprendimento sono quantificati confrontando il numero di shock ricevuti ogni giorno di acquisizione. Anche il tempo al primo ingresso e il tempo massimo per evitare la zona d’urto sono parametri importanti che possono essere utilizzati per determinare i cambiamenti nella capacità di apprendimento durante l’attività. In alternativa, la memoria di lavoro spaziale può essere testata conducendo una singola sessione APA di 30 minuti 2,13 in cui l’apprendimento spaziale viene misurato come cambiamenti all’interno della sessione confrontando le prestazioni, come il numero di shock, in contenitori di 5 minuti.
In questo articolo, descriviamo l’attività APA ed evidenziamo le caratteristiche chiave che devono essere considerate quando si conduce questo test di apprendimento spaziale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In conclusione, il test di evitamento del luogo attivo è un compito di apprendimento spaziale efficace che può essere utilizzato su una varietà di ceppi di topi e condizioni sperimentali. Il compito APA supera i limiti associati ad altri paradigmi di apprendimento spaziale14, come il MWM, che è stressante per i topi misurato dai livelli di cortisolo9. Il MWM non è adatto anche per i topi anziani, dove è stato segnalato che galleggiano durante il compito10. Sebbene altri test di apprendimento spaziale, come il labirinto di Barnes e il nuovo test di localizzazione degli oggetti, siano meno stressanti, sono limitati dalla frequenza con cui i test ripetuti possono essere condotti sulla stessa coorte di topi. Pertanto, il vantaggio principale dell’attività APA è che può essere utilizzato più volte poiché diversi parametri possono essere regolati per mantenere la novità. In effetti, abbiamo utilizzato il compito APA fino a 5 volte sulla stessa coorte di topi per esaminare l’effetto dell’ablazione ippocampale e il successivo effetto dell’esercizio8. In ogni caso, i parametri, tra cui la rotazione dell’arena, la zona d’urto e i segnali spaziali, sono stati alterati tra i test. Ciò è stato efficace nel garantire che i topi utilizzassero segnali di navigazione spaziale per riapprendere il compito, come evidenziato dagli animali di controllo che iniziavano con un numero elevato di shock e poi diminuivano durante i giorni di test successivi per ogni periodo di test8. In genere, alla fine di un paradigma di test di 5 giorni, consideriamo che qualsiasi animale che ha ricevuto più di 10 shock l’ultimo giorno o ha un evitamento massimo inferiore a 60 s non ha imparato il paradigma.
Oltre alla possibilità di modificare facilmente le impostazioni per consentire più cicli di test spaziali, l’attività APA garantisce che i topi debbano utilizzare la navigazione spaziale per evitare efficacemente la zona d’urto. Ad esempio, gli animali devono utilizzare segnali esterni per localizzare ed evitare di entrare nella zona d’urto stazionaria allontanandosi da essa5. Poiché l’arena ruota, gli animali non sono in grado di utilizzare un approccio idiotetico per la navigazione, né possono utilizzare segnali esterocettivi come l’odore perché questi segnali ruotano con l’arena mentre la zona di shock e i segnali spaziali rimangono stazionari5.
È anche importante assicurarsi che i topi siano adeguatamente abituati al ricercatore e all’arena APA. Anche l’intensità dello shock del piede deve essere ottimizzata, poiché sia un’intensità di shock troppo bassa che troppo alta possono compromettere la capacità dei topi di apprendere ed eseguire il compito5. L’intensità dell’urto è generalmente impostata su 0,5 mA e non deve superare 0,7 mA. Per gli animali che hanno un comportamento simile all’ansia aumentato, considera di ridurre sia l’intensità della luce che l’intensità dello shock del piede. L’aumento dell’ansia durante l’attività APA può presentarsi come salti eccessivi, corsa incontrollata all’interno dell’arena o congelamento prolungato. Il protocollo qui descritto utilizzava un’intensità di shock di 0,5 mA, la stessa intensità che è stata precedentemente utilizzata con BALB/c, che è noto per avere un comportamento simile all’ansia più elevato15.
Qui, descriviamo il software di tracciamento degli animali fornito dall’azienda che ha fornito l’impianto di evitamento del luogo attivo utilizzato. Il software di tracciamento video alternativo è adatto anche per analizzare le prestazioni comportamentali. Questi programmi possono anche misurare e analizzare con precisione le prestazioni del mouse durante le attività APA. Questi programmi consentono la creazione di diverse zone e luoghi all’interno dell’arena APA per valutare il comportamento. L’ambientazione dell’arena per un APA consiste in una zona d’urto triangolare, dove vengono misurati il numero di ingressi, il tempo per entrare per la prima volta e il tempo trascorso nella zona d’urto. È inoltre possibile aggiungere altre zone all’interno dell’arena. Ad esempio, possiamo aggiungere una zona centrale o una zona opposta alla zona d’urto per misurare il tempo trascorso e la distanza percorsa in quelle zone come strategia animale per evitare la zona avversiva. Questi programmi tracciano il centro di massa del mouse, che viene quindi salvato e visualizzato sopra il piano di riferimento per l’ispezione visiva (Figura 6A, B). Infine, è anche possibile creare una mappa di calore della densità per le prestazioni individuali e di gruppo (Figura 6C).
Quando si svolge l’attività APA, ci sono potenziali problemi che devono essere affrontati. A volte, i topi dovranno essere esclusi dall’analisi a causa della mancata risposta alla zona d’urto. Come sempre, l’esclusione dovrebbe essere presa in considerazione solo quando soddisfano condizioni anomale predefinite, ad esempio non rientrando in 2 deviazioni standard dalla media. Compiti comportamentali complessi come l’APA richiedono in genere alti valori di N degli animali. Suggeriamo di condurre un’analisi della potenza per calcolare la dimensione del campione appropriata prima di condurre l’APA. Ciò dipenderà dal ceppo utilizzato e dai gruppi di trattamento. Dall’esperienza, troviamo che un valore n di 10 o più per ciascun gruppo fornisce potenza sufficiente quando si conducono esperimenti APA. Il problema principale di questa attività è garantire un tracciamento di alta qualità del mouse durante l’attività. La fase di assuefazione del compito dovrebbe essere utilizzata per confermare che ciò si sta verificando. I topi che non rispondono a uno shock sono spesso dovuti allo scat tra le barre della griglia. È quindi essenziale pulire il rig dopo ogni animale e rimuovere eventuali escrementi o urina. Ciò ridurrà anche lo stress per gli animali che seguono. L’attività APA prevede in genere un paradigma di 5 giorni, che può presentare alcune limitazioni per gli studi che prevedono interventi efficaci meno di 5 giorni; tuttavia, la memoria a breve termine o l’acquisizione dell’apprendimento spaziale possono ancora essere valutate per tali studi utilizzando l’approccio di 30 minuti in una singola sessione.
In sintesi, questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come impostare e utilizzare il paradigma di evitamento del luogo attivo per testare l’apprendimento spaziale dei topi. La capacità di modificare le condizioni in modo da poter testare più ceppi di topi di colore variabile è un netto vantaggio rispetto ad altri test spaziali più tradizionali come il MWM. Inoltre, la modifica di più parametri consente di ripetere i test in modo che i cambiamenti nell’apprendimento spaziale possano essere accuratamente confrontati durante vari paradigmi sperimentali o durante l’invecchiamento fisiologico. In un breve periodo di tempo, il test APA ha dimostrato di essere un’alternativa accurata ed efficace per l’apprendimento spaziale dipendente dall’ippocampo. In futuro, il compito APA può essere utilizzato come metodo affidabile per valutare gli interventi terapeutici o di esercizio sul comportamento cognitivo e spaziale sia nei topi wild-type che in quelli transgenici.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behaviour Facility per lo sviluppo e la manutenzione dell’apparato descritto in questo manoscritto.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
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