O teste Active Place Avoidance (APA), uma tarefa de aprendizagem espacial eficaz, versátil e repetível para camundongos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o teste de evitação de local ativo, um paradigma de aprendizagem espacial dependente do hipocampo projetado para roedores. A alteração dos principais parâmetros permite novos testes dos animais antes e depois dos tratamentos ou ao longo do tempo.
Abstract
A aprendizagem espacial dependente do hipocampo em roedores foi testada usando uma variedade de métodos. Isso inclui as tarefas de labirinto aquático de Morris (MWM), labirinto em Y e localização de novos objetos (NOL). Mais recentemente, a tarefa de prevenção ativa de locais (APA) foi desenvolvida como uma alternativa a essas abordagens mais tradicionais. Na tarefa APA, os ratos devem usar pistas espaciais colocadas em torno de uma arena rotativa para evitar uma zona de choque estacionária. Devido aos múltiplos parâmetros que podem ser ajustados, a tarefa APA demonstrou ser uma abordagem muito versátil. Ele se presta a ser usado longitudinalmente e repetidamente para a mesma coorte de camundongos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para conduzir com sucesso a tarefa APA. Também destacamos abordagens alternativas de APA que podem ser usadas para examinar diferentes componentes da aprendizagem espacial. Descrevemos os processos de coleta e análise de dados. As etapas críticas durante a tarefa APA são discutidas para aumentar a probabilidade de realizar o teste com sucesso. A tarefa APA tem várias vantagens sobre os testes de navegação espacial mais tradicionais. É apropriado usar com camundongos idosos ou com fenótipos de doenças, como a doença de Alzheimer. A complexidade da tarefa pode ser facilmente alterada, permitindo que uma ampla gama de cepas de camundongos seja testada. Além disso, a tarefa APA é adequada para testar animais que foram submetidos a cirurgia ou intervenções experimentais que podem ter afetado a função motora ou neural, como acidente vascular cerebral ou lesão cerebral traumática.
Introduction
A evitação ativa do local (APA) é uma ferramenta eficaz para testar o aprendizado espacial dependente do hipocampo em roedores 1,2,3,4. Durante a tarefa APA, o animal é colocado em uma arena giratória e é obrigado a usar pistas visuais para se orientar e evitar uma zona de choque aversiva5. A rotação da arena garante que o mouse não possa usar uma abordagem idiotética para navegação, nem marcas de cheiro podem ser usadas, pois essas pistas giram na plataforma enquanto a zona de choque permanece estacionária5. Alterar a velocidade e a direção da arena, bem como a localização da zona de choque e as pistas visuais, permite o novo teste de camundongos várias vezes 6,7,8. O APA oferece várias vantagens distintas em comparação com o labirinto aquático de Morris (MWM), um dos testes de aprendizagem espacial mais amplamente utilizados. É importante ressaltar que os ratos têm aversão à natação e acham a tarefa MWM extremamente estressante9. Além disso, foi relatado que camundongos idosos flutuam durante a tarefaMWM 10, tornando-a inadequada como uma tarefa de aprendizado espacial em muitos casos. Além disso, como a tarefa MWM requer uma plataforma oculta e submersa para os ratos localizarem durante o teste. Isso exige que a água seja opaca, o que normalmente é obtido por meio da adição de tinta branca. O rastreamento e a análise de animais durante tarefas comportamentais requerem contraste suficiente entre o sujeito e o ambiente, excluindo certas cepas de camundongos, como Swiss ou BALB/c, de serem testadas no MWM. Na tarefa APA, esse problema é contornado por meio da adição de plástico preto sob a grade.
Vários paradigmas da APA foram projetados para testar a aprendizagem espacial, demonstrando sua utilidade como uma ferramenta comportamental eficaz. Por exemplo, a aquisição, retenção e consolidação do aprendizado espacial são normalmente realizadas por testes diários de animais que podem variar de 3 a 5 dias 6,7,11,12. A memória e o aprendizado são quantificados comparando o número de choques recebidos a cada dia de aquisição. O tempo para a primeira entrada e o tempo máximo para evitar a zona de choque também são parâmetros importantes que podem ser usados para determinar mudanças na capacidade de aprendizado durante a tarefa. Alternativamente, a memória de trabalho espacial pode ser testada conduzindo uma única sessão APA de 30 minutos 2,13, onde o aprendizado espacial é medido como mudanças dentro da sessão, comparando o desempenho, como o número de choque, em caixas de 5 minutos.
Neste artigo, descrevemos a tarefa APA e destacamos os principais recursos que devem ser considerados ao realizar este teste de aprendizagem espacial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em conclusão, o teste de evitação de lugar ativo é uma tarefa de aprendizado espacial eficaz que pode ser usada em uma variedade de linhagens de camundongos e condições experimentais. A tarefa APA supera as limitações associadas a outros paradigmas de aprendizagem espacial14, como o MWM, que é estressante para os camundongos medidos pelos níveis de cortisol9. O MWM também é inadequado para camundongos idosos, onde eles flutuam durante a tarefa10. Embora outros testes de aprendizado espacial, como o labirinto de Barnes e o teste de localização de novos objetos, sejam menos estressantes, eles são limitados pela frequência com que os testes repetidos podem ser realizados na mesma coorte de camundongos. Portanto, a principal vantagem da tarefa APA é que ela pode ser usada várias vezes, pois vários parâmetros podem ser ajustados para manter a novidade. De fato, usamos a tarefa APA até 5 vezes na mesma coorte de camundongos para examinar o efeito da ablação do hipocampo e o efeito subsequente do exercício8. Em cada caso, os parâmetros, incluindo a rotação da arena, a zona de choque e as pistas espaciais, foram alterados entre os testes. Isso foi eficaz para garantir que os camundongos usassem dicas de navegação espacial para reaprender a tarefa, conforme evidenciado pelos animais de controle, começando com um grande número de choques e diminuindo durante os dias de teste subsequentes para cada período de teste8. Normalmente, no final de um paradigma de teste de 5 dias, consideramos que qualquer animal que recebeu mais de 10 choques no último dia ou tem uma evitação máxima de menos de 60 s não aprendeu o paradigma.
Além da capacidade de modificar facilmente as configurações para permitir várias rodadas de testes espaciais, a tarefa APA garante que os mouses usem a navegação espacial para evitar efetivamente a zona de choque. Por exemplo, os animais devem usar pistas externas para localizar e evitar entrar na zona de choque estacionária navegando para longe dela5. Como a arena está girando, os animais não são capazes de usar uma abordagem idiotética para navegação, nem podem usar pistas exteroceptivas, como odor, porque essas pistas giram com a arena enquanto a zona de choque e as pistas espaciais permanecem estacionárias5.
Também é importante garantir que os camundongos estejam adequadamente habituados à arena do pesquisador e da APA. A intensidade do choque do pé também precisa ser otimizada, pois tanto a intensidade do choque muito baixa quanto a muito alta podem comprometer a capacidade dos camundongos de aprender e realizar a tarefa5. A intensidade do choque é normalmente definida para 0.5 mA e não deve exceder 0.7 mA. Para animais que têm maior comportamento semelhante à ansiedade, considere reduzir a intensidade da luz e a intensidade do choque nas patas. O aumento da ansiedade durante a tarefa APA pode se apresentar como salto excessivo, corrida descontrolada dentro da arena ou congelamento prolongado. O protocolo aqui descrito utilizou uma intensidade de choque de 0,5 mA, a mesma intensidade que foi usada anteriormente com BALB/c, que é conhecido por ter maior comportamento semelhante à ansiedade15.
Aqui, descrevemos o software de rastreamento de animais fornecido pela empresa que forneceu o equipamento de prevenção de local ativo usado. O software alternativo de rastreamento de vídeo também é adequado para analisar o desempenho comportamental. Esses programas também podem medir e analisar com precisão o desempenho do mouse durante as tarefas da APA. Esses programas permitem a criação de várias zonas e locais dentro da arena da APA para avaliar o comportamento. A configuração da arena para um APA consiste em uma zona de choque triangular, onde o número de entradas, o tempo para entrar pela primeira vez e o tempo gasto na zona de choque são medidos. Zonas adicionais também podem ser adicionadas dentro da arena. Por exemplo, podemos adicionar uma zona central ou uma zona oposta à zona de choque para medir o tempo gasto e a distância percorrida nessas zonas como uma estratégia animal para evitar a zona aversiva. Esses programas rastreiam o centro de massa do mouse, que é salvo e exibido acima do quadro de referência para inspeção visual (Figura 6A, B). Por fim, também é possível criar um mapa de calor de densidade para o desempenho individual e em grupo (Figura 6C).
Ao conduzir a tarefa APA, há possíveis problemas que precisam ser resolvidos. Ocasionalmente, os camundongos precisarão ser excluídos da análise devido à falta de resposta à zona de choque. Como sempre, a exclusão só deve ser considerada quando atender a condições discrepantes predefinidas, por exemplo, ficando fora de 2 desvios padrão da média. Tarefas comportamentais complexas, como a APA, normalmente exigem altos valores de N dos animais. Sugerimos a realização de uma análise de poder para calcular o tamanho da amostra apropriada antes de realizar a APA. Isso dependerá da cepa usada e dos grupos de tratamento. Por experiência, descobrimos que um valor n de 10 ou mais para cada grupo fornece energia suficiente ao conduzir experimentos de APA. O principal problema com essa tarefa é garantir o rastreamento de alta qualidade do mouse durante a tarefa. O estágio de habituação da tarefa deve ser usado para confirmar que isso está ocorrendo. Os ratos que não respondem a um choque geralmente são devidos a fezes entre as barras da grade. É, portanto, essencial limpar o equipamento após cada animal e remover qualquer fezes ou urina. Isso também reduzirá o estresse para os animais que seguem. A tarefa APA normalmente envolve um paradigma de 5 dias, o que pode apresentar algumas limitações para estudos envolvendo intervenções efetivas em menos de 5 dias; no entanto, a memória de curto prazo ou a aquisição de aprendizagem espacial ainda podem ser avaliadas para esses estudos usando a abordagem de sessão única de 30 minutos.
Em resumo, este artigo fornece uma descrição detalhada de como configurar e usar o paradigma de evitação de lugar ativo para testar o aprendizado espacial de camundongos. A capacidade de alterar as condições para que várias linhagens de camundongos de cores variadas possam ser testadas é uma vantagem distinta sobre outros testes espaciais mais tradicionais, como o MWM. Além disso, a modificação de vários parâmetros permite a repetição de testes para que as mudanças no aprendizado espacial possam ser comparadas com precisão durante vários paradigmas experimentais ou durante o envelhecimento fisiológico. Em um curto período de tempo, o teste APA demonstrou ser uma alternativa precisa e eficaz para o aprendizado espacial dependente do hipocampo. No futuro, a tarefa APA pode ser usada como um método confiável para avaliar intervenções terapêuticas ou de exercícios no comportamento cognitivo e espacial em camundongos selvagens e transgênicos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behavior Facility pelo desenvolvimento e manutenção do aparelho descrito neste manuscrito.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O’Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
